Summary
이 문서에서는 마우스에 심폐 바이패스를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 이 새로운 모델은 장기 손상에 관여 하는 분자 메커니즘의 조사를 촉진할 것 이다.
Abstract
심장 중재 동안 장기간된 심폐 바이패스 본질적인 되면서 절차 최적화에 대 한 고 장시간된 extracorporal 순환 기관 피해를 최소화 하기 위한 임상 수요 증가 발생 합니다. 이 문서의 목표 마우스에 심폐 바이패스의 완전 한 기능 및 임상 관련 모델을 설명 했다. 우리는 장치를 설계, 관류 회로 최적화와 microsurgical 기술에 보고합니다. 이 모델은 여러 피 도면에 대 한 필요성으로 인해 생존와 호환 되지 않습니다는 급성 모델. 이 모델 마우스 (예를 들어, 마커, 녹아웃, 등)에 사용할 수 있는 도구의 범위 때문에 장기 손상 및 다른 관련 심폐 바이패스의 효과의 분자 메커니즘에 조사를 촉진 한다 comorbidities입니다.
Introduction
심장과 폐 우회 (CPB)의 병원에 도입, 이후 그것은 심장 수술1에 필수적인 역할을 담당해 왔습니다. 현대 심장 수술, 장기 CPB 시간 광범위 한 대동맥 개조 및 결합 된 절차를 수행 하기 위해 필수적입니다. 기술의 진보 엄청난 되었습니다, extracorporal 순환의 사용은 관련 내부-와 수술 후 조직 및 지역 기관 손상2,3.
대형 동물 모델 생리 적 프로세스4,5에 CPB의 역할을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 모델은 CPB의 일부에 대 한 통찰력 관련 합병증 제공, 비록 그들은 매우 비용이 많이 드는 고 분자 도구 (예, 항 체)는 매우 제한 된. 작은 동물에 더 많은 비용 효율적인 대안 개발 되었습니다. 그들의 개발 이후 여러 연구 쥐와 토끼5,6,7,,89CPB 모델을 최적화 하기 위해 실시 되었습니다. 병 태 생리 질병 프로세스;의 측정을 위한 좋은 기초를 제공 하는 이러한 모델 그러나, 그들은 아직도 조사 하는 세포와 체액 성 면역학 관련 항 체 및 시 약의 부족 때문에 충분 하지 않습니다. 이 연구의이 분야에서 그들의 역할을 손상 한다.
우리는 최근 CPB의 마우스 모델을 개발 했습니다. 때문에 다양 한 마우스 관련 시 약 및 유전자 변형 쥐, 마우스 모델은 일반적 생리 적, 분자, 그리고 면역학 연구10,11에 대 한 선택의 모델입니다. 따라서, 우리의 모델 임상 관련 질병12,13사용할 수 있는 많은 쥐 종자는 다양 한 comorbidities 관하여 CPB의 연구를 촉진 한다. 따라서,이 종이 자세하게에서 설명 합니다, 쥐에 CPB를 수행 하는 방법을. 깊은 호흡과 순환 상 검거 후 산소와 hemodynamic 매개 변수는 밀접 하 게 모니터링 됩니다.
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Protocol
모든 동물 실험 독일 동물 보호 법률 (TierSchG)에 따라 수행 하 고 (낮은 작센 주 사무소 소비자 보호 및 식품 안전, 프로토콜에 대 한 지역 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다 TSA 14/1556)입니다. 이 모델에 대 한 적합 한 마우스의 최소 무게는 25 이다 g.
1. 수술 전 준비
참고: 모든 프로시저 압력가 악기와 함께 깨끗 한, 비 살 균 조건 하에서 수행 됩니다.
- 장소 50-60 8 cm 긴 프로필 렌 중공 섬유 튜브에 병렬로 하 고 양쪽 모두 T 어댑터와 연결. 접착제와 속이 빈 섬유 및 T-어댑터의 외부 분기 사이 공간을 채우기.
- 허용 적어도 24 h 강화를 접착제에 대 한
- . 표준 톰을 사용 하 여 T 어댑터에서 밖으로 확장 하는 빈 섬유를 자르고 연결 사이트를 실리콘 튜브를 당겨.
- 입니다. 무뚝뚝한 절 개 및 구조의 철회에 대 한 면봉을 사용 합니다. 거 즈 면봉 (5 x 5 cm 2)를 사용 하 여 조직의 탈수를 방지 하기 위해 초과 하는 액체를 흡수.
2. 동물 마 취
마 취 관리, 동물 유도 챔버 미만 2.5%를에 장소- v/v isoflurane/산소 혼합물. 페달 철수 반사, 꼬리 핀치 반사와 눈 깜박임 반사를 평가 하 여 적절 한 마 취를 확인 합니다. 눈 건조를 피하기 위해 수의 눈 연 고를 적용.
3. 과적
- 전체 마 취 및 삽 관 법, 달성 후 날카로운가 위를 잘 목에 중간 피부 절 개를 수행, 무딘 패션에서 근육을 분리 하 고 바로 경 정 맥과 왼쪽된 경 동맥을 노출. 준비 하는 동안 최소한의 혈액 손실 되도록 수의학 coagulator 양극 겸 자에 연결을 사용 하 여 작은 혈관 응고.
- Jugular 혈관의 준비, 후 cranially 8-0 비단 봉합을 사용 하 여 그것의 분기를 왼쪽된 일반적인 경 동맥의 원심 세그먼트 선.
- 연결 동맥, 경 동맥에 정 맥의 끝 삽입의 인접 세그먼트에서 실리콘 커넥터 (0.5 m m ID, 1 m m OD), 장소 8-0 비단 봉합 슬립을 사용 하 여 동맥 유입 튜브를 27 G 정의 원심 끝 매듭.
- 이죠 proximally 대동맥 아치에 3-4 m m 되도록 사전 정 팁을 정 팁의 정확한 위치, 후. 8-0 실크 매듭으로 확보 하 여 정 팁 수정.
- 사용 microsurgical 집게와가 위, 무딘, 날카로운 해 부를 수행, 바로 경 정 맥 쇄 골, 가까이 sternocleidomastoid 근육을 옆으로 조직의 무딘 준비 하 여 노출과 선단부와 8-0 8 0 실크 매듭을 배치 근 위 끝을에서 루프.
- 경 정 맥의 선단부의 결 찰 후 정 맥 정 맥의 끝에 바로 경 정 맥 및 오른쪽 아 트리 움 쪽으로 진행 하 고 실크 매듭을 사용 하 여 보안. 최적의 정 맥 반환, 그것은 우 심 실에 정 맥 팁을 미리 해야 할 수 있습니다.
- 올바른 정 위치 달성 되 면 경 정 맥 혈관에 직접 주사를 통해 동물 bodyweight의 그램 당 덤플링의 2.5 IU를 추가 하 여 조직의 heparinization 수행.
- 실시간 침입 압력 모니터링을 위한 cannulate 왼쪽된 대 퇴 동맥. 사 타 구니 영역을 노출 하 고 부드럽게 대 퇴 정 맥, 대 퇴 신경 25 X 배율 아래에서 일반적인 대 퇴 동맥을 분리.
- Ligate 대 퇴 동맥의 말 초 부분
- . 일시적으로 슬립 매듭 인접 부분을 가리고 하 고 마이크로 집게를 사용 하 여 앞쪽 벽에 작은 절 개를 하 게.
- 이후에, 1 Fr 폴리우레탄 정 대 퇴 동맥으로 삽입 하 고 10-0 봉합 한 실크로 확보. 이 정 맥은 혈액 가스 분석을 위한 혈액 샘플을 추출 하는 데 사용 됩니다.
4. 심폐 바이패스 및 혈액 가스 분석
- 혈액 가스 분석 (BGA)를 사용 하 여 유리 모 세관 튜브 대 퇴 동맥 카 테 터를 통해 60-90 µ L 동맥 혈액을 수집.
- 실리콘 튜브에 작은 클램프를 사용 하 고 카 테 터에서 튜브를 분리. 모 세관 튜브의 제어 충전 수 있도록 클램프에 천천히 압력 해제.
- 는 실리콘 튜브 카 테 터를 다시 연결합니다. 다음 시간에 측정을 위한 혈액 가스 분석기에 모 세관 튜브를 삽입:
환기 (BGA1)와 형사 요의 개시 후 10 분
25 분 CPB의 및 호흡기 체포 (BGA2)의 15 분 후
CPB의 및 호흡기 체포 (BGA3)의 30 분 40 분 후
CPB의 55 분, 45 분의 호흡, 그리고 심장 마비 (BGA4)의 20 분 후
- 안정적인 CPB 흐름과에서 환기를 중지 하 여 테 호흡기 체포.
- 환기의 종료 후 28 º C로 온난 패드를 설정 하 고 몸에 붙이기도 차가운 식 염 수에 젖은 거 즈를 사용 하 여 호흡 검거의 첫번째 20 분 내의 온도 28 º C에 동물을 냉각 시작.
- 일단 28 º C의 온도 달성, 그리고 호흡기 체포의 30 분의 총 후에, cardioplegia 시작 하 CPB 회로에 7.45 %KCl 용액의 0.3 mL 관리.
- 교차 하는 대동맥의 클램핑, 이전 배치 실크 루프 (단계 3.10) 더 나은 노출 위한 두개골 방향으로 당겨 및 대동맥의 상승 부분에 마이크로 serrefine 클램프를 배치.
- 총 60 분 호흡 마비 및 심장 마비의 30 분을 수행합니다. 심장의 reperfusion 시작 오름차순 대동맥에서 마이크로 serrefine 클램프를 제거 합니다. 동시에, 다시 환기 하 고 따뜻한 동물 37 ° c.
- Reperfusion 완료 하 고 동물에는 normothermia에 도달 했습니다 CPB 펌프를 해제 하 여 종료 하 고 계속 20 분에 대 한 생리 적 측정 (예: 체온, 심전도, 및 침략 혈압) 모니터링
- 실험의 끝에, exsanguinate (5 %isoflurane) 완전 취 동물 및 혈액 및 추가 분석 14 장기 수집.
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Representative Results
이 프로토콜에서는 관류 회로, 수술 절차, 및 마우스의 CPB 동안 생리 적인 매개 변수 모니터링. 적절 하 게 숙련 된 microsurgeon에 의해 수행 하면 결과 지속적으로 그리고 reproducibly 얻을 수 있습니다.
적절 한 조직 관류를 유지 하려면 평균 동맥 압력 및 여분의 볼륨의 추가 형사 요 혈을 조정 하 여 40과 60 mmHg 사이 항상 유지 됩니다. 동물, 볼륨 상태와 체온의 무게에 따라 extracorporal 혈 실험 기간 동안 볼륨 손실의 보정 회로를 못쓰게 솔루션의 0.1 mL의 추가 하 여 이루어집니다 2.3-6.5 mL/분 사이 유지 동안 형사 요. 조직의 pH 안정화 NaHCO2의 8.4 mmol/L을 추가 하 여 이루어집니다. 모든 유체는 공기 색전술의 위험을 줄이기 위해 공기 트래핑 저수지를 통해 관리 됩니다.
생리 적 매개 변수는 4 다른 시간 점 (그림 1)에서 BGA를 사용 하 여 평가 했다 고 대표 성공적인 CPB 절차에서 측정 표 1에 표시 됩니다.
가 측정 회로 (표 1)을 못쓰게 볼륨의 추가 때문에 hemodilution를 표시합니다. 그러나 없었다,, 수혈에 대 한 필요가 없습니다 헤모글로빈 수준 실험 (표 1)의 과정 동안 충분 한 수준에서 유지 되었다. 조직의 동맥 pO2, 산소 포화, pCO2 만료 값 마이크로 oxygenator (표 1)의 우수한 기능을 검증. pCO2 만료 FiO2 0.8에서 산소/공기 혼합물을 사용 하 여 최적 이었다.
BGA는 또한 CPB 동안 동물의 대사 상태에 대 한 통찰력을 제공합니다. 환기와 CPB의 개시, 후 동맥 pH 상승 했다 (표 1). 이 효과 종종 호흡기 체포 시작 되 면 감소 됩니다. 실험 과정에서 pH에 점진적 감소를 보였다 (표 1). 연속 버퍼링 동맥 pH와 젖 산 증에 대 한 보상 필요 했다.
그림 1 : 실험 일정. 삽 관 법, 환기, 호흡 마비, CPB, 심장 마비, reperfusion, 냉각/다시-온난화, 및 BGA 샘플링 포인트의 타이밍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| BGA1 | BGA2 | BGA3 | BGA4 | |
| 헤모글로빈 (g/dl) | 8.9 | 6.8 | 6.8 | 5.6 |
| 보통 | 27.5 | 21.2 | 21.3 | 17.7 |
| pO2 (mmHg) | 508 | 506 | 504 | 271 |
| pCO2 (mmHg) | 24.5 | 20.3 | 20 | 36.4 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH | 7.56 | 7.65 | 7.36 | 7.32 |
| 젖 (mmol/L) | 2.6 | 3.1 | 3 | 6.9 |
표 1: 마우스에 성공적인 CPB에서 대표 BGA 결과. BGA는 실험의 과정을 통해 4 개의 다른 시간 지점에서 촬영.
그림 2 : 마우스에서 CPB 회로의 회로도. 정 맥 캐 뉼 러 (파란색)에 배치 됩니다 통해 열 등 한 베 나 정 맥 바로 경 정 맥 및 동맥 정 맥에는 대동맥을 통해 왼쪽된 경 동맥 (빨간색). 산소를 혈액은 왼쪽된 경 동맥에 공기 사냥꾼 저수지를 통해 양수 된다. 온도 rectally, 측정와 압력은 대 퇴 동맥을 통해 모니터링 ECG 전극 피하 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 완전 한 기능 임상 관련 모델 CPB의 마우스를 개발 했습니다. 쥐 데 심혈 관 질환의 30 개 이상의 긴장, 우리의 모델 CPB에 관련 된 새로운 미래의 프로토콜의 개발을 위한 출발점이 될 수 있습니다. 또한, 마우스 관련 시 약 및 녹아웃 아웃 마우스의 과다 때문이 모델 있지만 대체할 수 없습니다만 CPB의 현재 쥐 모델 CPB 관련 장기 손상에 관련 된 분자 메커니즘의 해 부를 촉진 한다. 날짜 하려면, CPB 하지 마우스 마이크로 oxygenator 데 충분히 작은 못쓰게 볼륨의 개발을 포함 한 기술적인 도전 뿐만 아니라 cannulation 기법, microsurgical 문제 때문에 적용 되었습니다. 약 90도 경험이 풍부한 microsurgeon의 근 면 한 일 안정적인 모델을 달성 하기 위해 필요 했다. 다른 롤러 펌프, 튜빙, 그리고 다양 한 저수지 CPB 기계의 이상 15 프로토타입은 테스트 하 고 지속적으로 개선 했다. 10 이상 버전 다른 oxygenators의 내장 되었고 현재 결과 달성 하기 위해 테스트. 우리의 새로운 모델 extracorporal 순환의 기존 쥐 모델 설치의 완전 한 재설계가 필요합니다. 첫째, 우리는 가장 작은 가능한 마이크로 oxygenator 허용 못쓰게 볼륨 내장 < 0.3 mL. oxygenator 혈액 빈 섬유를 못쓰게 볼륨에 있는 뜻깊은 감소에 대 한 허용 그들 사이 흐르는 거꾸로 시스템을 사용 하 여 재설계 되었다.
우리의 모델의 개발 하는 동안 우리는 몇 가지 기술적인 문제가 발생 했습니다. 우리의 첫 번째 프로토타입 회로 최대 6 mL의 대형 못쓰게 볼륨 필요합니다. 이 헤모글로빈 값 4 g/dl와 보통 값 약 15의 극단적인 hemodilution에서 결과. 좋은 산소를 보여주는 BGA에도 불구 하 고 hypoxemia 절차 동안 급속 한 심장 마비로 이어지는 관찰 합니다. 적절 한 조직의 산소를 달성 하기 위해 보통 값은 25 이상 이어야 합니다. 튜브 크기 조정, 롤러 펌프의 디자인 변경, 소형된 공기 사냥꾼 생산 최적화 하 여 정 맥 및 동맥 뉼, 못쓰게 볼륨 크게 감소 했다 < 0.9 mL.
적절 한 관류에도 불구 하 고 4-6 mL/min, 제공 하는 충분 한 정 맥 역류의 흐름은 필수적입니다. 오른쪽 아 트리 움 또는, 더 나은, 우 심 실에서 정 맥 정 맥의 배치는이 문제를 완화 한다. 관류 흐름 증가 정 맥 캐 뉼 러 또는 액체와 조직 부 종의 overperfusion 관련 손실의 어느 빠는 이끌어 낸다. 빠른 신진 대사를가지고, 마우스에 CO2 보존 하지 않으려면 우리는 600 mL/min의 흐름2 80 %FiO는 oxygenator 통해 산소 공급을 유지는 조직의 산소에 대 한 최적의 발견.
하나 발생할 수 있는 또 다른 문제는 이러한 반복 볼륨 대체 모든 30-40 분 interstitium 혈관 내 볼륨의 점진적 손실 이다. 하지만 hydroxyethyl 전 분 (HES)을 포함 하는 전해질 솔루션의 hyperosmolarity 방지 혈관 내 볼륨 감소, 독점적으로 사용 될 때 그것의 높은 점도 증가 일으키는 거 대 한 조직의 압력에 CPB 동안. oxygenator 동맥 정 맥에 인접 배관에 누설을이 끈다. 따라서, hyperosmolarity 및 적당 한 점도 사이의 균형을 달성 하기 위해 HES 포함 된 솔루션의 1:1 혼합물 및 다른 isotonic 균형된 액체 최적의 것 발견 되었다.
롤러 펌프의 운전 전자는 작은 직경 튜브 내에서 충분 한 흐름을 따라서 허용 회전 속도 높이기 위해 수정 되었습니다. 롤러 펌프에 의해 생성 하는 강한 흡입 아래 정 맥 시스템에 미세한 기포를 일반적입니다. 0.15 mL 아래 못쓰게 볼륨 소형된 공기 사냥꾼의이 문제를 해결합니다. 여분의 볼륨의 0.1 mL를 추가 하 고 정 맥 정 맥의 정확한 위치를 확인 외 형사 요 흐름을 줄이고 공기 색 전 증 회로에서 제거.
테스트 하려면 소설 심폐 바이패스 모델의 기술적 타당성, 여러 혈액 samplings가 필요 합니다. 혈액의 이상 0.2 mL을 제거 하는 것은 일반적으로 건강 한 마우스에 대 한 치명적인입니다. 산소와 hemodynamic 안정성을 보장 하기 위해서 우리의 실험에서 혈액 samplings 양의이 값 보다 훨씬 이었고 거의 0.9 mL 실험의 끝에 도달. 그럼에도 불구 하 고, hemodynamic 매개 변수 및 안정 되어 있는 산소는 혈액 값의 지속적인 감소에도 불구 하 고 관찰 했다. 따라서, 우리의 초기 타당성 모델은 주로 급성, 비 생존 프로토콜로 설계 되었습니다. 우리는 지금 필요성을 함으로써, 적은 혈액 샘플링을 할 것 이다 최소한 침략 적 생존 모델 개발.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 아무 승인 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | priming volume, 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | priming volume, 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml of priming solution |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| KCL 7.45 % Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL for cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotid artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| Vasofix Safety catheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheal intubation |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| CLINITUBES blood capillaries | Radiomed GmbH | 51750132 | blood sampling 60 - 95 microliter |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| MiniVent Ventilator for Mice (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanical ventilation |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1.3 - 2.5% | |
| PowerLab data acquisition device 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | invasive pressure, ECG, temperature |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | blood gas analysis | |
| NMRI mice | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment |
References
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