Summary
Questo articolo descrive come eseguire il bypass cardiopolmonare in topi. Questo modello di romanzo faciliterà l'indagine dei meccanismi molecolari coinvolti nel danno dell'organo.
Abstract
Come bypass cardiopolmonare prolungata diventa più essenziale durante gli interventi cardiaci, una crescente domanda clinica si pone per l'ottimizzazione della procedura e per minimizzare il danno d'organo derivanti da circolazione extracorporea prolungata. L'obiettivo di questa carta era di dimostrare un modello completamente funzionale e clinicamente rilevante dell'esclusione cardiopolmonare in un mouse. Segnaliamo il dispositivo progettazione, ottimizzazione del circuito di perfusione e le tecniche microsurgical. Questo modello è un modello acuto, che non è compatibile con la sopravvivenza a causa della necessità per più disegni di sangue. A causa della gamma di strumenti disponibili per i topi (ad es., marcatori, forature, ecc.), questo modello faciliterà la ricerca sui meccanismi molecolari del danno d'organo e l'effetto dell'esclusione cardiopolmonare in relazione agli altri comorbilità.
Introduction
Fin dall'introduzione dell'esclusione cardiopolmonare (CPB) in clinica, esso ha svolto un ruolo essenziale in cardiochirurgia1. In cardiochirurgia moderna, prolungato tempo CPB è essenziale per eseguire vaste ricostruzioni aortiche e procedure unite. Anche se i progressi tecnologici sono stati enormi, l'uso della circolazione extracorporea è associato con intra - e postoperatorie sistemica e locale organo danni2,3.
Grandi modelli animali sono stati sviluppati per studiare il ruolo di CPB su processi fisiologici4,5. Anche se questi modelli hanno fornito alcune del CPB connesse complicazioni, sono estremamente costosi e strumenti molecolari (ad es., anticorpi) sono molto limitati. Un'alternativa più efficiente è stata sviluppata nei piccoli animali. Dal loro sviluppo, sono stati condotti diversi studi per ottimizzare un modello CPB in ratti e conigli5,6,7,8,9. Questi modelli costituiscono una buona base per le misurazioni dei processi patofisiologici malattia; Tuttavia, essi sono ancora insufficienti per indagare immunologia umorale e cellulare a causa della mancanza di anticorpi pertinenti e reagenti. Ciò altera il loro ruolo in questo campo di ricerca.
Recentemente abbiamo sviluppato un modello murino di CPB. A causa di una vasta gamma di reagenti specifici del mouse e topi modificati geneticamente, modelli murini sono in generale il modello di scelta per la ricerca fisiologica, molecolari ed immunologici10,11. Pertanto, il nostro modello faciliterà lo studio di CPB in relazione alle varie comorbidità come ci sono molti ceppi di topi disponibili con malattie clinicamente rilevante12,13. Di conseguenza, questo articolo descrive, in dettaglio, come eseguire CPB in topi. Ossigeno e i parametri emodinamici sono strettamente monitorati dopo l'arresto di profondità respiratoria e circolatoria.
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Protocol
tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge di protezione animale tedesco (TierSchG) e sono stati approvati dal comitato locale benessere degli animali (ufficio di stato della Sassonia inferiore per tutela del consumatore e sicurezza alimentare, protocollo TSA 14/1556). Il peso minimo del mouse è adatto per questo modello è di 25 g.
1. preoperative preparazioni
Nota: tutte le procedure vengono eseguite in condizioni di pulito, non sterile, con strumenti sterilizzati nell'autoclave.
- Posto 50-60 8 cm lungo propilene hollow fibre in parallelo in un tubo e collegare con un adattatore a T su entrambi i lati. Riempire lo spazio tra le fibre cave e il ramo esterno dell'adattatore a T con colla.
- Consenti almeno 24 ore per la colla per indurire. Tagliare le fibre cave che si estende dal T-adattatore tramite un microtomo standard e accostare il tubo di silicone per i siti di collegamento.
- Inserire un ago di metallo 27 G (da un branule di 26G) in una cannula di poliuretano Fr 2. Utilizzare una lama chirurgica e micro-forbici al microscopio (ingrandimento X 8-12) per rendere le finestrature di tre o quattro di circa 0,15 cm entro il terzo distale della cannula per assicurare ottimale venoso flusso di ritorno.
- Rimuovi il filo quando completato. Utilizzare tamponi di cotone per dissezione smussa e retrazione delle strutture. Utilizzare tamponi di garza (5 x 5 cm 2) per assorbire il liquido in eccesso per prevenire la disidratazione del tessuto.
- Preparare il volume di riempimento. Per il completamento, aggiungere 30 UI eparina / mL soluzione e 2,5% v/v di una soluzione di 8,4% di NaHCO 3 per il buffer di adescamento. Conservare questa soluzione a 4 ° C fino a quando non usato.
- Riempire il circuito CPB (cioè, pompa, trapper aria, tubi e due cannule) con 850 µ l di soluzione di adescamento tramite cannula venosa. Una volta riempito, tenere il CPB in circolazione fino a quando l'animale è pronto per l'inserimento di una canula.
2. Anestesia degli animali
- per amministrare l'anestesia, metti l'animale in una camera di induzione inferiore 2,5% miscela di ossigeno/isoflurano v/v. Confermare la corretta anestesia valutando pedale ritiro reflex, reflex pizzico di coda e riflesso batter occhio. Applicare l'unguento veterinario degli occhi per evitare secchezza degli occhi.
- Metti l'animale su un tappetino riscaldante con funzione di regolazione di temperatura. Misurare la temperatura corporea con una sonda inserita per via rettale e collegato al sistema di acquisizione dati.
- Dopo anestesia completa è realizzata, intubare il orotracheally animale utilizzando una braunule di plastica di 20G, inserendolo oralmente e spingendolo nella trachea sotto controllo visivo. Iniziare la ventilazione meccanica utilizzando un vaporizzatore di isoflurane collegato ad un ventilatore del mouse. A seconda del peso dell'animale, regolare la ventilazione in modo che si ottiene un volume corrente di 250-350 µ l.
- Per assicurare la completa analgesia, iniettare 5 mg/kg peso corporeo degli animali carprofen per via sottocutanea. Si raccomanda che la concentrazione di isoflurane siano tenuti fra 1.3-2.5% in ossigeno. Isoflurano concentrazione può essere regolata manualmente a seconda della fase della procedura.
3. Procedure chirurgiche
- dopo l'anestesia completa e l'intubazione è raggiunto, eseguire un'incisione della pelle del midline al collo con forbici bene affilate, separare i muscoli in modo schietto ed esporre la vena giugulare di destra e sinistra dell'arteria carotica. Durante la preparazione, coagulare piccoli vasi con un veterinario coagulatore collegato alla pinza bipolare per garantire la perdita di anima minima.
- Dopo la preparazione dei vasi giugulari, cranialmente legare il segmento distale dell'arteria carotide comune sinistra alla sua biforcazione con punti di sutura seta 8-0.
- Collegare l'estremità distale di una cannula di 27 G alla tubazione di affluenza arteriosa utilizzando un connettore in silicone (ID di 0,5 mm, 1 mm di diametro), posto 8-0 sutura seta slip nodi a segmento prossimale dell'arteria e inserire la punta della cannula nell'arteria carotica.
- Dopo il corretto posizionamento della punta della cannula, avanzare la punta della cannula in modo che depone 3-4 mm prossimalmente al arco aortico. Difficoltà la punta della cannula fissando con nodi di seta 8-0.
- Uso microsurgical pinze e le forbici, eseguire la dissezione smussata e forte, esporre la vena giugulare di destra da smussato preparazione del tessuto lateralmente al muscolo sternocleidomastoideo, vicino alla clavicola e mettere un 8-0 seta nodo all'estremità distale e un 8-0 ciclo all'estremità prossimale.
- Dopo la legatura dell'estremità distale della vena giugulare, posizionare la punta della cannula venosa nella vena giugulare di destra e progressi verso l'atrio destro e fissarla con il nodo di seta. Per ottimo ritorno venoso, può essere necessario per far avanzare la punta venosa nel ventricolo destro.
- Una volta ottenuta la posizione corretta della cannula, svolgere eparinizzazione sistemica con l'aggiunta di 2,5 IU dell'eparina per grammo del peso corporeo degli animali tramite iniezione endovenosa diretta nella vena giugulare.
- Per il monitoraggio in tempo reale pressione invasiva, incannulare l'arteria femorale di sinistra. Esporre la zona inguinale e separare delicatamente l'arteria femorale comune dalla vena femorale e del nervo femorale sotto ingrandimento X 25.
- Legano la parte distale dell'arteria femorale. Temporaneamente occludere la parte prossimale con un cappio e praticare una piccola incisione sulla parete anteriore utilizzando micro-forcipe.
- In seguito, inserire una cannula di poliuretano Fr 1 nell'arteria femorale e fissarlo con una seta 10-0 suturare. Questa cannula viene utilizzata per estrarre i campioni di sangue per analisi di gas del sangue.
- Dopo posizionamento di successo delle cannule arteriose e venose, avviare l'esclusione cardiopolmonare di accendere la pompa. Il tempo da intubazione a partire del CPB è circa 45 min. iniziare ad usare una portata di 0,5 mL/min, a seconda delle misurazioni della pressione sistemica e aumentare il flusso sanguigno all'interno di 2 min a flusso pieno (4-6 mL/min) aumentando la velocità della pompa.
- Sotto monitoraggio completo, eseguire un sternotomy superiore utilizzando delle forbici affilate, a partire da manubrio e andando 5 mm in direzione caudale. Coagulare i bordi sternali immediatamente per evitare il sanguinamento. Esporre l'arco aortico tirando l'arteria carotica di destra in direzione craniale.
- Per un controllo ottimale, circonferenzialmente gratis arco aortico da timo e nel tessuto circostante per facilitare il bloccaggio. Luogo un ciclo di 8-0 seta intorno all'aorta ascendente. Per inserire il morsetto a croce per cardioplegia, tirare l'ansa seta in direzione craniale per esporre meglio l'aorta ascendente.
4. Esclusione cardiopolmonare e l'emogasanalisi
- per analisi di gas del sangue (BGA), utilizzare tubi capillari di vetro per raccogliere 60-90 µ l di sangue arterioso tramite catetere dell'arteria femorale.
- Utilizzare un piccolo morsetto del tubo di silicone e staccare il tubo dal catetere. Rilasciare la pressione lentamente sul morsetto per consentire il riempimento controllato del tubo capillare.
- Ricollegare il tubo di silicone al catetere. Inserire i tubi capillari nel sangue analizzatore di gas per misure presso i seguenti punti di tempo:
10 min dopo l'inizio di CPB con ventilazione (BGA1)
dopo 40 min di CPB e 30 min di arresto respiratorio (BGA3)
dopo 55 min di CPB, 45 min di respiratori e 20 min di arresto cardiaco (BGA4)
- sotto flusso stabile di CPB, initia arresto respiratorio te arrestando ventilazione.
- Dopo il termine della ventilazione, impostare il riscaldamento pad a 28 º c e iniziare il raffreddamento topicamente l'animale alla temperatura corporea di 28 ° c entro i primi 20 min di arresto respiratorio utilizzando una garza imbevuta di soluzione salina fredda.
- Una volta ottenuta una temperatura corporea di 28 ° c e dopo un totale di 30 min di arresto respiratorio, amministrare 0,3 mL di soluzione di KCl 7,45% nel circuito del CPB per avviare cardioplegia.
- Per attraversare la pressione dell'aorta, tirare l'ansa di seta precedentemente posizionata (punto 3.10) in direzione craniale per una migliore esposizione e posizionare un morsetto di micro-serrefine sulla parte ascendente dell'aorta.
- Eseguire un totale di 60 min arresto respiratorio e 30 min di arresto cardiaco. Rimuovere il morsetto di micro-serrefine dall'aorta ascendente di avviare riperfusione del cuore. Contemporaneamente, ri-ventilare e caldo l'animale a 37 ° C.
- Dopo riperfusione è completato e l'animale ha raggiunto normothermia, terminare il CPB spegnendo la pompa e continuare a monitorare le misurazioni fisiologiche (ad es. temperatura corporea, ECG e pressione sanguigna invasiva) per 20 min.
- Alla fine dell'esperimento, prosciugare l'animale in anestesia completo (5% isoflurano) e raccogliere il sangue e gli organi per ulteriore analisi 14.
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Representative Results
Questo protocollo descrive il circuito di perfusione, interventi chirurgici e il monitoraggio dei parametri fisiologici durante CPB di un mouse. Quando eseguita da un Microchirurgo adeguatamente qualificato, i risultati si ottengono costantemente e riproducibile.
Per mantenere la perfusione tissutale adeguata, la pressione arteriosa media è sempre tra 40 e 60 mmHg regolando il flusso di sangue CPB e aggiunta di volume supplementare. A seconda del peso dell'animale, suo stato del volume e la temperatura corporea, il flusso di sangue extracorporeo che viene mantenuto tra 2.3-6,5 mL/min. correzione della perdita di volume durante l'esperimento viene ottenuta aggiungendo 0,1 ml di soluzione di innesco al circuito durante CPB. Stabilizzazione del pH sistemico è ottenuta aggiungendo 8.4 mmol/L di NaHCO2. Tutti i liquidi sono somministrati attraverso il serbatoio di intrappolamento dell'aria per ridurre il rischio di embolization dell'aria.
Parametri fisiologici sono stati valutati usando BGA in quattro diversi momenti (Figura 1) e le misure da un rappresentante riuscita procedura CPB sono presentate nella tabella 1.
Ematocrito misurazioni mostrano hemodilution grazie all'aggiunta di volume di riempimento del circuito (tabella 1). Non c'era, tuttavia, c'è bisogno di trasfusione di sangue come livelli di emoglobina sono stati mantenuti a livelli sufficienti nel corso dell'esperimento (tabella 1). Arteriosa sistemica pO2, saturazione dell'ossigeno, pCO2 valori di scadenza convalidato eccellente funzionamento del micro-ossigenatore (tabella 1). pCO2 scadenza era ottima utilizzando una miscela di aria/ossigeno a FiO2 0,8.
Durante CPB, BGA ha inoltre fornito spaccato lo stato metabolico dell'animale. Dopo l'inizio di CPB con ventilazione, pH arterioso è stato elevato (tabella 1). Questo effetto è spesso diminuito una volta avviata la arresto respiratorio. Una graduale riduzione del pH nel corso dell'esperimento è stato visto (tabella 1). Buffering continuo di lattato e pH arterioso è stato necessario per compensare l'acidosi.
Figura 1 : Sperimentale Timeline. Tempi di intubazione, ventilazione, arresto respiratorio, CPB, arresto cardiaco, riperfusione, raffreddamento/re-warm e punti di campionamento di BGA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| BGA1 | BGA2 | BGA3 | BGA4 | |
| Emoglobina (g/dl) | 8.9 | 6.8 | 6.8 | 5.6 |
| Ematocrito | 27.5 | 21,2 | 21,3 | 17,7 |
| pO2 (mmHg) | 508 | 506 | 504 | 271 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 20,3 | 20 | 36,4 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH | 7,56 | 7.65 | 7,36 | 7,32 |
| Lattato (mmol/L) | 2.6 | 3.1 | 3 | 6.9 |
Tabella 1: risultati di BGA rappresentante da un successo CPB in un Mouse. BGA preso in quattro diversi momenti nel corso di un esperimento.
Figura 2 : Diagramma schematico del circuito CPB nel topo. Una cannula venosa (blu) viene inserita nella vena cava inferiore attraverso la vena giugulare di destra e una cannula arteriosa (rosso) in aorta tramite l'arteria carotide sinistra. Sangue ossigenato viene pompato attraverso il serbatoio di aria-trapper in arteria carotide sinistra. ECG elettrodi per via sottocutanea, la temperatura corporea è misurata per via rettale e la pressione è controllata tramite l'arteria femorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo sviluppato un modello clinicamente rilevante perfettamente funzionante di CPB in un mouse. Con più di trenta ceppi di topi con malattie cardiovascolari, il nostro modello potrebbe essere un punto di partenza per lo sviluppo di nuovi protocolli prospettici correlati a CPB. Inoltre, a causa della pletora di reagenti specifici del mouse e topi knockout, questo modello non può solo sostituire l'attuale modello di ratto di CPB ma faciliterà la dissezione dei meccanismi molecolari coinvolti nel danno dell'organo CPB-correlati. Ad oggi, CPB non è stato applicato in topi causa microsurgical sfide nella tecnica di inserimento di una canula, come pure le sfide tecniche, compreso lo sviluppo di un micro-ossigenatore avendo un volume sufficientemente piccolo di innesco. Circa 90 sentieri e diligente lavoro di un esperto Microchirurgo erano necessarie per realizzare un modello stabile. Oltre 15 prototipi della macchina CPB avendo diversi rulli pompe, tubi e serbatoi diversi sono stati testati e costantemente migliorati. Più di 10 versioni di ossigenatori differenti sono state costruite e testate per ottenere i risultati attuali. Il nostro modello di romanzo necessaria una riprogettazione completa delle impostazioni esistenti del modello del ratto di circolazione extracorporea. In primo luogo, abbiamo costruito i più piccolo possibile micro-ossigenatore permettendo volumi di riempimento < 0,3 mL. L'ossigenatore è stata riprogettata utilizzando un sistema invertito dove il sangue scorre attraverso le fibre cave e non tra di loro, consentendo una riduzione significativa del volume di riempimento.
Durante lo sviluppo del nostro modello abbiamo incontrato diverse difficoltà tecniche. I nostri primi circuiti prototipo necessari volumi di riempimento grandi fino a 6 ml. Ciò ha provocato estremo hemodilution con valori di emoglobina inferiore a 4 g/dL e i valori dell'ematocrito di circa 15. Nonostante BGA mostrando buona ossigenazione abbiamo osservato segni di ipossiemia che conduce all'arresto cardiaco rapido durante la procedura. Al fine di ottenere la corretta ossigenazione, i valori dell'ematocrito dovrebbero essere superiore ai 25. Regolando la dimensione della tubazione, alterarne il design della rullo-pompa, producendo un trapper aria miniaturizzata ed ottimizzando cannule venose ed arteriose, il volume di riempimento è stato significativamente ridotto a < 0,9 mL.
Nonostante aspersione sufficiente flusso di 4-6 mL/min, fornendo sufficiente riflusso venoso è essenziale. Posizionamento della cannula venosa nell'atrio destro o, ancora meglio, nel ventricolo di destra, consente di attenuare questo problema. Aumentando il flusso di perfusione conduce ad entrambi succhiare della cannula venosa o perdita relativa overperfusion di edema fluido e del tessuto. Per evitare la ritenzione di CO2 nel topo, che ha un metabolismo veloce, abbiamo trovato che mantenere l'apporto di ossigeno attraverso l'ossigenatore a FiO2 80% con una portata di 600 mL/min è ottimale per l'ossigenazione dei tessuti.
Un altro problema che si può incontrare è la graduale perdita di volume intravascolare all'interstizio, rendendo necessaria la sostituzione del volume ripetere ogni 30-40 min. Il hyperosmolarity di soluzioni di elettroliti contenenti amido idrossietilico (HES) impedisce la perdita di volume intravascolare, ma quando utilizzato esclusivamente, sua viscosità alta provoca un aumento enorme della pressione sistemica durante CPB. Questo porta a perdite nell'ossigenatore e il tubo prossimale alla cannula arteriosa. Pertanto, per raggiungere un equilibrio tra hyperosmolarity e viscosità moderata, una miscela di 1:1 di soluzioni contenenti HES e un altro fluido equilibrato isotonico è stato trovato per essere ottimale.
La guida elettronica della pompa a rulli sono stato modificato per aumentare la velocità di rotazione, permettendo così un flusso sufficiente all'interno dei tubi di piccolo diametro. Sotto la forte aspirazione prodotta dalla pompa del rullo, è tipico di avere microscopiche bolle d'aria nel sistema venoso. Costruzione di un trapper aria miniaturizzato con volume di riempimento inferiore a 0,15 mL risolto questo problema. Aggiungere 0,1 mL di volume extra e riducendo il flusso CPB oltre a controllare il corretto posizionamento della cannula venosa eliminato l'embolia gassosa nel circuito.
Per verificare la fattibilità tecnica di un modello di romanzo bypass cardiopolmonare, prelievi multipli di anima sono necessari. Rimozione di più di 0,2 mL di sangue è solitamente mortale per un topo sano. Per garantire la stabilità emodinamica e ossigeno, la quantità di prelievi di anima nel nostro esperimento era molto di là di questo valore e quasi raggiunto 0,9 mL alla fine dell'esperimento. Tuttavia, ossigenazione stabile e i parametri emodinamici sono stati osservati nonostante la costante diminuzione nei valori ematologici. Pertanto, il nostro modello di fattibilità iniziale è stato progettato principalmente come un protocollo acuto, non-sopravvivenza. Ora stiamo sviluppando un modello di sopravvivenza come minimo dilagante che, per necessità, avrà meno il prelievo di sangue.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | priming volume, 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | priming volume, 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml of priming solution |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| KCL 7.45 % Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL for cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotid artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| Vasofix Safety catheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheal intubation |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| CLINITUBES blood capillaries | Radiomed GmbH | 51750132 | blood sampling 60 - 95 microliter |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| MiniVent Ventilator for Mice (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanical ventilation |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1.3 - 2.5% | |
| PowerLab data acquisition device 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | invasive pressure, ECG, temperature |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | blood gas analysis | |
| NMRI mice | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment |
References
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