Summary
Этот документ описывает, как выполнять искусственного кровообращения у мышей. Эта новая модель будет способствовать изучение молекулярных механизмов, занимающихся повреждения органов.
Abstract
Как длительное искусственного кровообращения становится более важным во время кардиологических вмешательств, клинических спрос возникает для оптимизации процедуры и минимизации орган ущерба в результате длительного экстракорпоральной циркуляции. Целью этой статьи было продемонстрировать полностью функциональной и клинически значимых модель искусственного кровообращения в мыши. Мы сообщаем о дизайн устройства, оптимизация цепи перфузии и микрохирургической техники. Эта модель является острый модель, которая не совместима с выживания вследствие необходимости для нескольких рисунков крови. Из-за ряда инструментов, доступных для мышей (например, маркеры, нокауты и т.д.) Эта модель будет способствовать расследование молекулярные механизмы повреждения органов и эффект искусственного кровообращения по отношению к другой сопутствующих заболеваний.
Introduction
С момента введения искусственного кровообращения (КПБ) в клинике она сыграла важную роль в хирургии сердца1. В современной кардиохирургии длительное время КПБ имеет важное значение для выполнения обширной реконструкции аорты и комбинированных процедур. Хотя технологические достижения были огромны, использования экстракорпоральной циркуляции связан с интра - и послеоперационной системных и местный орган ущерб2,3.
Крупные животные модели были разработаны для расследования роли КПБ на физиологические процессы в4,5. Хотя эти модели представление о некоторых из КПБ ассоциированных осложнений, они являются очень дорогостоящими и молекулярных инструменты (например, антитела) весьма ограничены. Была разработана более экономичную альтернативу в мелких животных. После их разработки оптимизировать модель КПБ в крыс и кроликов5,6,,78,9были проведены многочисленные исследования. Эти модели обеспечивают хорошую основу для измерения процессов патофизиологические болезни; Однако они все еще недостаточны для расследования гуморального и клеточного иммунологии из-за отсутствия соответствующих антител и реагенты. Это ухудшает их роль в этой области исследований.
Мы недавно разработали модель мыши КПБ. Благодаря широкому выбору мыши специфические реагенты и генетически модифицированные мыши мыши модели являются в целом модель выбора для физиологических, молекулярной и иммунологических исследований10,11. Таким образом наша модель будет способствовать изучению КПБ в отношении различных сопутствующих заболеваний, как есть много мышей штаммов с клинически значимых заболеваний12,13. Соответственно этот документ описывает, в деталях, как выполнять КПБ в мышах. После глубокого дыхания и кровообращения ареста внимательно следить за кислорода и гемодинамики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецкого закона о защите животных (TierSchG) и были утверждены Комитетом местных животных (Нижняя Саксония государственное управление по защите прав потребителей и безопасность пищевых продуктов, протокол TSA 14/1556). Минимальный вес мыши подходит для этой модели — 25 г.
1. предоперационная подготовка
Примечание: все процедуры осуществляются в чистой, не стерильных условиях, газобетона инструментами.
- Место 50-60 8-cm длинный пропилена полых волокон параллельно в трубку и связаться с Т-адаптер с обеих сторон. Заполнить пространство между полых волокон и внешние отделение Т-адаптер с клеем.
- Разрешить по крайней мере 24 часа для клея для упрочнения. Вырезать полые волокна, которая выходит из Т-адаптер, используя стандартный микротом и натяните силиконовые трубки для соединения сайтов.
- Вставьте 2 Fr полиуретановые канюля металла иглу 27 G (от 26G branule). Используйте хирургическое лезвие и микро ножницы под микроскопом (8-12 крат) сделать три-четыре ярусе около 0,15 см каждый в дистальной трети канюля для обеспечения оптимального венозного возврата потока.
- Удалить провод после завершения. Используйте ватные тампоны для тупых диссекции и Ретракция структур. Использовать марлевые тампоны (5 x 5 см 2) чтобы впитывать лишнюю жидкость для предотвращения обезвоживания тканей.
- Подготовить грунтование тома. Для завершения добавьте 30 ед гепарина мл грунтовка решения и 2,5% v/v 8,4% раствора NaHCO 3 для буферизации. Хранить это решение на 4 ° C до тех пор, пока используется.
- Заполнить цепи КПБ (т.е., насос, воздушный охотник, труб и оба канюли) раствором 850 мкл грунтование через венозный катетер. После того, как заполнены, держать циркулирующих КПБ, пока животное не готова для катетеризации.
2. Животных анестезии
- для администрирования анестезии, поместите животное в камеру всасывание под 2,5% v/v изофлюрановая/кислородная смесь. Подтвердите надлежащее анестезии путем оценки педали вывода рефлекс, хвост щепотку рефлекс и рефлекс глаз мерцания. Применять мазь ветеринарных глаз избежать сухости глаз.
- Место животное на потепление площадку с функцией регулирования температуры. Измерение температуры тела с зонд вставляется ректально и подключены к системе сбора данных.
- После достижения полной анестезии, интубировать животных orotracheally с использованием пластиковых braunule 20G, вставив его устно и вставив его в трахею под визуальным контролем. Начала искусственной вентиляции легких с помощью изофлюрановая испарителем, подключенных к мыши вентилятора. В зависимости от веса животного, отрегулируйте вентиляции, таким образом, чтобы достичь дыхательный объем 250-350 мкл.
- Для обеспечения полной анестезии, вводить подкожно 5 мг/кг массы тела животных carprofen. Рекомендуется, что концентрация изофлюрановая храниться между 1,3-2,5% кислорода. Изофлюрановая концентрация вручную может корректироваться в зависимости от стадии процедуры.
3. Хирургические процедуры
- после того, как достигается полная анестезия и интубации, выполняют Кожный разрез средней линии шеи с тонкой ножницами, отдельных мышц в тупой моды и подвергать право яремной вены и левой сонной артерии. Во время подготовки, коагулировать малых судов с использованием ветеринарных коагулятор, подключенных к биполярный пинцет для обеспечения минимальной кровопотерей.
- После подготовки шейных сосудов, краниально перевязать Дистальный сегмент левую общую сонную артерию на его развертывание с использованием шелковых нитей 8-0.
- Подключение, дистальный конец канюли 27 G приток артериальной трубок с помощью силиконового соединителя (ID 0,5 мм, 1 мм OD), место 8-0 Шелковый шов скольжения узлов в проксимальном сегменте артерии и вставить кончик канюли в сонной артерии.
- После правильного размещения кончика канюля, заранее кончик канюля, так, что она откладывает 3-4 мм проксимально аорты. Исправить кончик канюля путем обеспечения с шелковой узлов 8-0.
- Использование микрохирургических щипцы и ножницы, выполняют тупые и острые рассечение, подвергать право яремной тупым подготовка ткани боков к ключично мышцы, недалеко от ключицы и место 8-0 шелк узел на дистальном конце и 8-0 цикла в проксимальном конце.
- После перевязки дистального конца яремной вены, поместите кончик венозная канюля в правой яремной вены и прогресс в направлении правого предсердия и secure с использованием шелковой узел. Для оптимального венозный возврат, это может быть необходимо заранее венозной кончика в правый желудочек.
- Как только достигается правильным канюля позиции, выполнять системные Гепаринизация путем добавления 2,5 МЕ гепарина на грамм веса животных через прямой внутривенные инъекции в яремной.
- Для мониторинга в реальном времени инвазивного давления, иглу левой бедренной артерии. Подвергать паховой области и аккуратно отделить общие бедренной артерии от бедренной вены и бедренного нерва под 25 крат.
- Ligate дистальной частью бедренной артерии. Временно загородить проксимальной части с скольжения узел и сделать небольшой надрез на передней стенке с помощью микро пинцет.
- После этого, вставьте 1 Полиуретановые канюля Fr в бедренной артерии и закрепите его с шелком шва 10-0. Этот катетер используется для извлечения образцов крови для анализа газов крови.
- После успешного размещения артериальной и венозной канюли, инициировать искусственного кровообращения, повернув на насосе. Время от интубации начиная КПБ является примерно 45 мин начать использовать скорость потока 0,5 мл/мин, в зависимости от системных давления измерения и увеличение потока крови в течение 2 мин до полного потока (4-6 мл/мин), увеличивая скорость насоса.
- Под полный контроль, выполняют верхняя стернотомия, с помощью острых ножниц, начиная от рукоятка и собирается 5 мм в хвостовой направлении. Коагулировать края грудины немедленно, чтобы избежать кровотечения. Разоблачить аорты, потянув правой сонной артерии в направлении черепной.
- Для оптимального управления, окружности бесплатно аорты из вилочковой железы и окружающих тканей для облегчения зажима. Место 8-0 шелковые петли вокруг восходящей части аорты. Чтобы поставить крест зажим для Кардиоплегия, тянуть шелковые петли в черепной направлении лучше выставить восходящей части аорты.
4. Искусственного кровообращения и анализ газа крови
- для анализа газов крови (BGA), использовать стеклянные капиллярные трубки для сбора 60-90 мкл артериальной крови через катетер бедренной артерии.
- Использовать струбциной маленький на Силиконовая трубка и отсоедините трубку от катетера. Сбросьте давление медленно на зажим, чтобы разрешить контролируемое заполнение капиллярной трубки.
- Прикрепить силиконовые трубки катетера. Вставьте капиллярной трубки в крови газоанализатор для измерения в следующее время:
10 мин после начала КПБ с вентиляцией (BGA1)
после 25 мин КПБ и 15 минут дыхания (BGA2)
после 40 мин КПБ и 30 минут остановка дыхания (BGA3)
после 55 мин КПБ, 45 мин респираторных и 20 мин остановки сердца (BGA4)
- под стабильным потоком КПБ, инициатива TE дыхания, остановив вентиляции.
- После окончания вентиляции, установите потепление площадку до 28 ° c и начать местно охлаждения животного до 28 ° c температуры тела в течение первых 20 минут дыхания с помощью Марли, смоченной в холодной соленой.
- После достижения температуры тела 28 ºС и после всего 30 минут остановка дыхания, администрировать 0,3 мл раствора KCl 7,45% в контуре КПБ инициировать Кардиоплегия.
- Для крест пережатие аорты, потяните ранее размещенных шелковые петли (шаг 3.10) в черепной направлении для лучшего воздействия и поместите зажим микро serrefine на восходящей части аорты.
- Выполнить в общей сложности 60 мин остановка дыхания и сердца 30 мин. Выньте зажим микро serrefine из восходящей части аорты инициировать реперфузии сердца. Одновременно, повторно проветривать и теплые животных до 37 ° C.
- После завершения реперфузии и животное достиг normothermia, прекратить КПБ, отключив насос и продолжать следить за физиологических измерений (например температуры тела, ЭКГ и инвазивных артериальное давление) 20 мин
- В конце эксперимента, exsanguinate животное под полным наркозом (5% изофлюрановая) и собирать кровь и органы для дальнейшего анализа 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает перфузии цепи, хирургических процедур и мониторинга физиологических параметров во время КПБ мыши. При исполнении адекватно квалифицированных микрохирург, последовательно и можно воспроизвести результаты.
Для поддержания адекватного ткани перфузии, среднее артериальное давление всегда находится между 40 и 60 мм рт.ст, регулируя поток крови КПБ и добавление дополнительных тома. В зависимости от веса животного, его состояние тома, и температуры тела экстракорпоральное кровообращение поддерживается между 2.3-6,5 мл/мин, Коррекция объема потерь во время эксперимента достигается путем добавления 0,1 мл раствора грунт цепи во время КПБ. Системные рН стабилизация достигается путем добавления 8,4 ммоль/Л NaHCO2. Все жидкости осуществляется через водохранилище воздуха треппинга для снижения риска воздуха эмболизации.
Физиологические параметры были оценены с использованием BGA в четырех различных временных точках (рис. 1) и измерения от представителя успешной процедуры КПБ представлены в таблице 1.
Гематокрит измерения показывают гемодилюции связано с добавлением объема грунта до трассы (Таблица 1). Существует, однако, нет необходимости переливания крови как уровень гемоглобина поддерживались на достаточном уровне в ходе эксперимента (Таблица 1). Системной артериальной Ро2, насыщение кислородом, ЦУП2 истечения значения проверены отличное функционирование микро Оксигенатор (Таблица 1). ЦУП2 истечения был оптимальным использованием смеси кислорода и воздуха на FiO2 0,8.
BGA также предоставляет проницательность в метаболический статус животного во время КПБ. После инициирования КПБ с вентиляцией, возведен артериальной рН (Таблица 1). Этот эффект часто уменьшается после возбуждения дыхания. Постепенное снижение рН в ходе эксперимента был замечен (Таблица 1). Необходимо компенсировать ацидоз было непрерывное буферизации артериальной pH и лактата.
Рисунок 1 : Экспериментальная Timeline. Сроки проведения интубации, вентиляции, дыхания, КПБ, инфаркт миокарда, реперфузия, охлаждения/ре потепление и BGA проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| BGA1 | BGA2 | BGA3 | BGA4 | |
| Гемоглобин (g/dl) | 8.9 | 6.8 | 6.8 | 5.6 |
| Гематокрит | 27,5 | 21.2 | 21.3 | 17.7 |
| Ро2 (mmHg) | 508 | 506 | 504 | 271 |
| pCO2 (mmHg) | 24.5 | 20.3 | 20 | 36,4 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH | 7.56 | 7.65 | 7.36 | 7.32 |
| Лактат (ммоль/Л) | 2.6 | 3.1 | 3 | 6.9 |
Таблица 1: результаты BGA представитель от успешной КПБ в мышь. BGA, принятые в четырех точках в разное время в течение эксперимента.
Рисунок 2 : Схема цепи КПБ в мышь. Венозная канюля (синий) помещается в нижней полой вены через правый яремной вены и артериальной канюля (красный) в аорту через левой сонной артерии. Кислородом кровь перекачивается через воздух охотник водохранилище в левой сонной артерии. Электроды ЭКГ размещаются подкожно, температура тела измеряется ректально и давление контролируется через бедренную артерию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали полностью функционирующей клинически значимых модель КПБ в мыши. С более чем тридцатью штаммов мышей, имеющих сердечно-сосудистые заболевания наша модель может быть отправной точкой для разработки новых перспективных протоколов, связанных с КПБ. Кроме того из-за множества мыши специфические реагенты и нокаут из мышей, эта модель может не только заменить текущий крысы модель КПБ но облегчит рассечение молекулярных механизмов, участвующих в повреждения органов, связанных с КПБ. На сегодняшний день, КПБ не применялось в мышах благодаря микрохирургическое вызовы в технику катетеризации, а также технические проблемы, включая разработку микро Оксигенатор объемом достаточно маленький грунтовки. Приблизительно 90 тропы и добросовестный труд опытных микрохирург необходимы для достижения стабильной модели. Свыше 15 прототипы КПБ машины различные роликовые насосы, трубы и различных водоемов были протестированы и постоянно совершенствуется. Более чем 10 версий различных оксигенаторы были построены и испытаны достичь нынешних результатов. Наши новые модели требуется полный редизайн существующих крысы модель установки экстракорпорального кровообращения. Во-первых, мы построили наименьшей возможной микро Оксигенатор позволяет томов грунтовки < 0,3 мл. Оксигенатор был переработан с использованием Перевернутый системы, где кровь течет через полые волокна, а не между ними, позволяя существенного снижения объема грунта.
Во время разработки нашей модели мы столкнулись с рядом технических трудностей. Наш первый прототип цепи требуется большой грунтовки объемов до 6 мл. Это привело к крайней гемодилюция с гемоглобина ниже 4 g/dL и значения гематокрита примерно 15. Несмотря на BGA, показаны хорошие оксигенации мы наблюдали признаки гипоксемия ведет к быстрому сердца во время процедуры. Для достижения надлежащего ткани кислородом, гематокрит значения должны быть выше 25. Корректировка размера трубы, изменяя дизайн насос ролик, производства миниатюрных воздуха охотник, и оптимизации артериальные и венозные канюли, грунтование объем значительно сократилось до < 0,9 мл.
Несмотря на адекватной перфузии поток 4-6 мл/мин, обеспечивая достаточную венозного оттока имеет важное значение. Размещение венозная канюля в правое предсердие или, еще лучше, в правый желудочек, устраняет эту проблему. Увеличение потока перфузии приводит к либо сосание венозная канюля или потери, связанные с overperfusion, отека тканей и жидкости. Чтобы избежать удержания CO2 в мышь, которая имеет быстрый метаболизм, мы обнаружили, что сохранение подачи кислорода через Оксигенатор FiO2 80% с потоком 600 мл/мин является оптимальным для оксигенации тканей.
Еще одна проблема, которую можно столкнуться является постепенная потеря внутрисосудистого объема интерстиция, требуя повторных объем замены каждые 30-40 мин. Гиперосмолярности растворов электролитов, содержащие гидроксиэтилкрахмала (ГЭС) предотвращает потери внутрисосудистого объема, но когда используется исключительно, его высокая вязкость вызывает огромный рост в системное давление во время КПБ. Это приводит к утечке в Оксигенатор и проксимальнее артериальной канюля трубки. Таким образом чтобы добиться баланса между гиперосмолярности и умеренной вязкости, 1:1 смесь растворов, содержащих ГЭС и другой изотонические сбалансированные жидкости было установлено быть оптимальным.
Управляя электроника валика насоса были модифицированы для увеличения скорости вращения, таким образом позволяя достаточного потока внутри трубы малого диаметра. Под сильным всасывания, производимые насос ролик это типичный для микроскопических пузырьков воздуха в венозной системе. Строительство траппер миниатюрных воздуха объемом грунт ниже 0,15 мл решить эту проблему. Добавление 0,1 мл дополнительный объем и сокращение потока КПБ в дополнение к проверке правильное размещение венозная канюля ликвидированы эмболии в контуре.
Чтобы проверить техническую осуществимость модель Роман искусственного кровообращения, требуются несколько выборок крови. Удаление более 0,2 мл крови обычно смертелен для здоровой мыши. Для обеспечения кислородом и стабильность гемодинамики, количество крови выборок в нашем эксперименте был далеко за пределы этого значения и почти достиг 0,9 мл в конце эксперимента. Тем не менее стабильной оксигенации и гемодинамики были замечены несмотря на постоянное снижение гематологической значения. Таким образом наша модель первоначального технико-экономического обоснования был главным образом как острый, не выживание протокол. В настоящее время мы разрабатываем минимально инвазивной выживания модели, которая, при необходимости, будет иметь меньше проб крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | priming volume, 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | priming volume, 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml of priming solution |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| KCL 7.45 % Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL for cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotid artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| Vasofix Safety catheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheal intubation |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| CLINITUBES blood capillaries | Radiomed GmbH | 51750132 | blood sampling 60 - 95 microliter |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| MiniVent Ventilator for Mice (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanical ventilation |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1.3 - 2.5% | |
| PowerLab data acquisition device 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | invasive pressure, ECG, temperature |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | blood gas analysis | |
| NMRI mice | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment |
References
- Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
- Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
- Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
- Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
- Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
- Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
- Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
- Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
- Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
- Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
- Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
- Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).
