Summary
לימפומה cell מנטל (MCL) היא קשה לטפל הפרעת תא B ולכן לא פחות קשה להקים מודל העכבר xenograft של ראשי MCL ללמוד ולפתח את הרפוי. כאן, אנו מתארים את הקמת MCL xenografts בעכברים כדי לעזור להבין את הביולוגיה כבסיס מוצלחת.
Abstract
B לימפוציטים הם שחקני המפתח מחזור תא החיסון והם בעיקר ביתם, שוכנים באזור איברי הלימפה. בעוד תאי B נורמלי להתרבות רק כשאתה מגורה על ידי לימפוציטים מסוג T, תאי B oncogenic לשרוד ו להרחיב באופן עצמאי בתוך נישות איברים לא מוגדר. לימפומה cell מנטל (MCL) הוא אחד כזה הפרעת תא B, שבו שיעור חציון ההישרדות של חולים היא 4-5 שנים. זה דורש את הצורך של מנגנונים יעילים באמצעותו יונת ואת engraftment של תאים אלה נחסמות על מנת להגביר את הישרדות, תוחלת החיים של המטופלים. לכן, המאמץ לפתח מודל העכבר xenograft לחקור את היעילות של הרפוי MCL על ידי חסימת ה ביות מנגנון ויוו הוא בעל חשיבות עליונה. התפתחות בעלי חיים הנמענים התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים לבדוק תרופות בשלב מוקדם של זמן כנראה תפס, כמו דגמים הרלוונטיים העכבר פרה יש חשיבות מכרעת מסך סוכני טיפולית חדשה. מודל זה בעל חיים מפותחת כדי למנוע דחיית שתל האנושי ולהקים מודל עבור מחלות אנושיות, והוא עשוי להיות כלי שימושי ביותר ללמוד את התקדמות המחלה סוגי לימפומה שונים, לבצע בדיקה פרה של תרופות עבור ממאירויות המטולוגיות, כמו MCL. הקמנו דגם העכבר xenograft אשר ישמש משאב מצוין ללמוד ולפתח את רומן גישות טיפוליות עבור MCL.
Introduction
לימפוציטים על ידי הטבע לשחק תפקיד מרכזי מעקב המערכת החיסונית, לימפוציט סחר היא שלב קריטי הרכבה אנטיגן ספציפי חסינות1,2. תהליך זה כולל העברה של לימפוציטים נאיביים T של בלוטת התימוס כדי להזרים את הדם, ומשם לאיברים הלימפה המשני, כולל בלוטות הלימפה, התיקונים של פייה או הטחול, הם נפגשים אנטיגנים cognate. לימפוציטים B להבדיל במח העצם, נודדים כתאי תמים אל זקיקים של איברי הלימפה משני3. חלק תאים B אלה לאגד אנטיגן עם קולטן שלהם, מופעלים על ידי תאי T ספציפי. התפשטות ובידול של תאים אלה B דוחף את התאים תמים B שאינו מופעל ע י לאזור מנטל של הזקיק. תאים מופעל יכול להבדיל ואז לזיכרון B תאים, אשר מסיירים הגוף, או לידי בנוגדנים הפרשת תאי פלזמה להגר מח העצם4.
MCL מתרחשת כאשר לימפוציטים נאיביים B באזור מנטל להפוך גידול. אלו תאים לימפומה לשכון microenvironment של איברים הלימפה, להתרבות ללא תלות שליטה לימפוציט T ספציפי. עם זאת, בשלב מסוים של צפיפות לברוח מן הנישה הזאת והם recirculate במחזור הדם לחפש נישות באיברים אחרים. בהתחשב במורכבות של מולקולות אדהזיה והפקרות של נוגדנים, קולטנים שלהם, המנגנון של הסלולר סחר זה ויוו ממעטים להבין, לכן הסלים טיפול. שיטות רומן נחוצים כדי לחסום ביעילות תהליך הגירה זה כדי למנוע את התאים לימפומה B מלהגיע microenvironments חדש.
MCL הוא אחד הקשים ביותר לטיפול תא B ממאירות. הפיתוח של הפנוטיפ אמצעים של MCL היא התוצאה של מפל רב-שלבי, המאופיינת על ידי רכישת מאפיינים ביולוגיים ייחודיים. בזמן האבחנה, רוב המטופלים (70%) שכבר קיים עם מחלה המופץ, עם רוב המקרים מפגין extranodal מעורבות הטחול, מוח עצם, ו/או מערכת העיכול5,6. בחולים שטופלו, נסיגה על ידי גידולים עמידים בתוך כמה שנים הוא נפוץ, למרות כימותרפיה קונבנציונלית מעניקה שיעורי הפוגה גבוהה לטווח קצר7,8. כאן אנו מציגים מודל המחלה חדש יכול לעזור להבין MCL הפצתו וביולוגיה הבסיסית שלה: הקמנו האנושי MCL xenograft העכבר מודל שמקורם בתאי הגידול העיקרי של חולים. אנו מקווים כי מודל זה יעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות נגד הפצת MCL, לספק במרכיבי קליניים אופטימלית אבחון וטיפול בחולים הישנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות דם אנושי שימשו על פי הנהלים אושרה על ידי האתיקה המקומית ניסויים ועדות של בית החולים של אוניברסיטת ז'נבה.
ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים אתית הוועדה של חיה טיפול ב ז'נבה ומשרד וטרינרי הקנטונים (מספר אישור: ג ' נרל אלקטריק/26/15).
1. הכנת תאי תאי דם היקפיים הראשי (PBMCs) על-ידי הפרדת צבע צפיפות
הערה: 3-5 מ של דם היקפיים הושג מחולים עם MCL הצגת בשלב לוקמיה. האבחנה הייתה נקבע על פי קריטריונים אבחון סטנדרטי עבור cytometry זרימה (CD5 +, CD23−, CD200 +, האוכלוסייה monoclonal B cell), לאחר מכן אושר על ידי נוכחות של t(11;14) טרנסלוקציה כרומוזומלית, ביטוי של cyclin D1. בכל המקרים, היוו monoclonal תאי B כדי > 90% מן האוכלוסייה הכוללת B cell. התאים הנותרים היו בעיקר ומונוציטים ו כמה תאים T.
- לדלל (1:1) 5 מ של דגימת דם MCL עם 5 מ של רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני 1640 (RPMI) (איור 1 א').
- היפוך התקשורת הדרגתיות צפיפות (טבלה של חומרים) מספר פעמים לפני השימוש כדי להבטיח ערבוב יסודי.
- הוסף 5 מ של מדיה הדרגתיות צפיפות לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות פיפטה.
- שכבת בעדינות את דגימת הדם מדולל על התקשורת הדרגתיות צפיפות בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות (הדם צפיפות מדיה הדרגתיות יחס צריך להיות 2:1, למשל, 10 מ של דם עד 5 מ"ל של צפיפות הדרגתיות מדיה). צריך לקחת כדי לא לערבב שתי השכבות (איור 1B, ג).
- Centrifuge הדגימה ב 400 g x 40 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלמים צנטריפוגה כבוי.
- בעדינות בעזרת פיפטה סטרילי של פסטר, תשאף השכבה האמצעית (לבנבן, דק טבעת המסומן בחץ (איור 1D, E)) המכילות את התאים תאי ולהעביר אותם לתוך צינור נקי.
- כביסה של תאי תאי
- להעריך את עוצמת הקול של התליה תא שהועברו ולהוסיף אליו שלושה כרכים של עקר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% אלבומין שור (BSA).
- מערבבים את המתלים על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
- Centrifuge את המתלים ב 400-500 g x למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את תגובת שיקוע להשיג בגדר תא, חזור על השלב לשטוף שוב.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי האחסון הרצוי, למשל, 1 או 2 מ"ל ל- PBS.
- לספור את מספר התאים מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות של hemocytometer (נויבאואר קאמרית).
2. העשרה של תאים B לפי בחירה שלילי תא B
- לדלל את התאים ב- PBS כדי ריכוז סופי של 50 x 106 תאים/מ ל....
- העבר את התאים מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון. להוסיף 100 µL של נוגדן קוקטייל מתוך ערכת העשרה תא B 2 מ של השעיה תא ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה (איור 2-1).
- דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- בקצרה מערבולת החלקיקים המגנטיים המסופק בערכה תא B העשרה עבור 30 s (איור 2-2). להוסיף 150 µL של החלקיקים המגנטיים 2 מ"ל של המדגם.
- דגירה המדגם על עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- להביא את אמצעי האחסון מדגם 2.5 מ עם PBS x 1 המכיל 2% עגל עוברית סרום (FCS) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA). הכנס את הצינור המגנט, דגירה הצינור עוד 3-5 דקות (איור 2-3).
- לאסוף את המגנט עם הצינור במקום, בתנועה רציפה אחת, decant את הצינור כך התליה תא מועשר נאסף בשפופרת טריים (איור 2-4). לספור את התאים על ידי מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות hemocytometer כדי לקבל את התשואה הכוללת תאי B.
הערה: בדרך כלל, התשואה היא ~ 105 B תאים למ"ל נורמלי בתאי B ו 5-50 x 106 תאים/mL עבור MCL. - המאשרת את טוהר העשרת תא B
- קח ~ 50,000 תאים דגירה התאים עם נוגדנים anti-CD19/CD20 (1:20 דילול) ובנוסף נוגדן anti-CD45 כדי fluorochromes שונים (1:10 דילול) בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
- לשטוף עם 1 מ"ל של 1 x PBS + 1% BSA, centrifuge את התאים ב- 400-500 g x עבור 5 דקות, resuspend תאי µL ~ 200 ל- PBS.
- לרכוש את דגימות תאים על ידי cytometry זרימה ולנתח טוהר של תאי B. טוהר הוא ברובו > 90% בשיטה זו (איור 3).
3. פיתוח של המודל העכבר Xenograft
- להשעות ~ 40-60 x 106 תאים ב- 150-200 µL ל- 1 x PBS (נפח תידרש להזריק לכל העכבר).
- להזריק 150 µL של התליה תא לווריד (עירוי) לתוך כל וריד הזנב של שבוע 6-7 scid הנד immunodeficient גמא (NSG) עכברים בלי קשר למין (איור 4A).
- לאפשר העכברים לפתח לימפומה האנושית ~ 10 שבועות.
הערה: תאים לימפומה אנושית ראשונית יקח עוד הרבה זמן לפתח גידול לעומת שורות תאים לימפומה אנושי (~ 3 שבועות). - כאשר בעלי החיים מתחילים להראות סימפטומים של מחלות קטלניות כמו ירידה במשקל, שערה הסתור, ירידה בפעילות, שיתוק גפיים הינד, וכדומה, להקריב העכברים בעזרת2 CO ואחריו לב לב לנקב להשיג דם.
- לאסוף איברים שונים כמו מח העצם, הטחול, הכבד על ידי לנתח את העכברים, לאסוף דם היקפיים על ידי ציור דם מהלב בזמנו של הקרבה לניתוח engraftment הגידול (איור 4B -F).
4. chimerism ניתוח של תאים סרטניים Engrafted באיברים שונים
- לאחר איסוף איברים שונים, לעבד אותם על ידי הפרעה מכנית ליצירת תא בודד המתלים בעקבות פירוק תאי הדם האדומים (RBC) באמצעות µL 200 1 x אמוניום כלוריד האשלגן מאגר דם, מח עצם, µL 500 על הטחול, 2 מ עבור כבד .
- לספור, מכתים את התאים באמצעות נוגדנים ספציפיים תא B האנושי, קרי, אנטי-CD19, אנטי-CD20 אנטי-CD45.
הערה: עכברים NSG חוסר בתאי B, ומכאן לניתוח, תאים מוכתמים עם סמנים תא B אנושי ספציפי. - לנתח את התאים נגזר אורגן על ידי cytometry זרימה על ידי gating בתאי B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- לכמת את תאי הגידול engrafted באיברים שונים שמקורם עכברים MCL מוזרק המבוסס על תאים מגודרת כפי שמצוין בשלב 4.3 (איור 4G).
הערה: ראה טבלה של חומרים לפרטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב היד מתאר פרוטוקול אופטימליים להתפתחות מוצלחת של העכבר xenograft מודל engraftment של תאים MCL. הכנה של אוכלוסיה תא טהור (בתאים הזה במקרה MCL), חיוני מאוד לפתח xenografts MCL מוצלחת. איור 1 מייצג את השלבים מפוח תא תאי בידוד מן הדם של החולה MCL על ידי הפרדת צבע צפיפות. תאי תאי מעובדים נוספים כדי להשיג טהור B תאים באמצעות ערכת העשרה תא B שלילי כדי להשיג אוכלוסיה תא טהור להזרקה xenograft לתוך עכברים. צריך לקחת כדי להשיג טוהר מקסימלית על מנת שיהיה מוצלח MCL engraftment. טוהר שהושג באמצעות שיטה זו היא בדרך כלל > 90%. התאים הנותרים היו בעיקר ומונוציטים ו כמה תאים T (נתונים לא מוצג).
איור 2 מייצג את השלבים השונים של פרוטוקול טיהור תא B כמתואר בסעיף שיטות. התאים מועשר מנותחים נוסף שלהם טוהר על ידי זרימת cytometer באמצעות סמנים שונים (CD45 CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, קאפה, למדא). Gating רציפים, כפי שמוצג באיור 3 מאפשרת אפיון של תאים MCL: CD45 + CD19 +, CD20 +, CD5 +, CD23−, CD200− נבחרו. פיצוי עבור צביעת ססגוניות התבצע באמצעות פקדים מוכתם יחיד עבור כל אחד fluorochromes נעשה שימוש, על פי הגדרת cytometry סטנדרטי.
איור 3E G מייצגת העלילה נקודה אופיינית של תאים B לפני ואחרי העשרה. במקרה זה, > 95% של תאים מועשר באמצעות ערכה זו הם תאי B. התאים מושעים ב- PBS ב ריכוז של 40-60 × 106 תאים ב- 150-200 µL PBS כאמור בפרוטוקול. הם היו מיד מוזרק עירוי NSG לעכברים. לאחר 10 שבועות, > 90% של לימפומה חיות מוזרק פיתח מראה סימנים של מחלה סופנית (ירידה במשקל, שערה הסתור, ירידה בפעילות, וכו '). לאחר הקרבה, הטחול והכבד הם הוסרו ומעובדים להשיג תא בודד המתלים שיבושים מכניים (איור 4D, F); דם משורטט בקפידה על ידי דקירה בלב לב, מח העצם מעובד על ידי חיתוך בשני הקצוות של עצם הירך, שטיפה באמצעות מזרק 2 מ"ל מתמלאת RPMI בינוני או PBS (איור 4C). התאים יותר מעובדים על ידי cytometry זרימה באמצעות תאי B אדם סמני ספציפיים כמו CD19/CD20 ו- CD45. השתמשנו תא B אנושי ספציפי סמני כאן בגלל המתח העכבר הנמען (NSG) חסר בתאי B. איור 4B - F מייצג האוסף של איברים לאחר ההקרבה, השלבים של עיבוד נוסף. מידת engraftment של תאים MCL נגזר שני חולים מיוצג באיור 4G. ניתן להשוות את התבנית engraftment באיברים שונים ובין חולים בעקבות טכניקה זו.
איור 1: בידוד של PBMCs של דם מלא- דם מחולה MCL הוא מדולל 1:1 בינוני RPMI (א), והניח בזהירות על גבי השכבה מדיה הדרגתיות צפיפות (B) ללא ערבוב הדם לתוך מדיה הדרגתיות זו צפיפות (C). צנטריפוגה-400 g x עבור 45 min מפריד בין תאי תאי, אשר מופיעים בתור טבעת לבנבן (חץ מצביע על השכבה תא תאי) (D). שכבה זו הוא pipetted בעדינות ללא ערבוב עם שכבות אחרות לתוך צינור נקי לעיבוד נוסף (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: העשרה של B תאים מחלון PBMCs. PBMCs מבודדת על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות נשטפים פעמיים עם PBS. באמצעות השליליים B תא העשרה קיט, לפי הפרוטוקול של היצרן, אוכלוסיית תאי B מתקבל (1–4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח FACS של תאים MCL והטוהר של B תאים לפני ואחרי העשרה. התאים MCL תאי מאופיינים על ידי ניתוח FACS באמצעות סמנים שונים כמו CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, לקאפה למבדא. התאים הם חיוביים עבור CD45, CD19, CD20, CD5 שלילי עבור CD23 ו- CD200 הם נבחרים (A–F). G מייצג את אוכלוסיית תאים לאחר העשרה באמצעות הערכה שלילית הבחירה בהשוואה ל- E, אשר לפני העשרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: עכברים NSG כמודל xenograft עבור engraftment של תאים MCL. בתאי B נגזר חולי MCL הוזרקו עירוי דרך וריד הזנב לרוחב NSG עכברים (A). לאחר מתן אפשרות מספר ימים עבור הגידול engraft, העכברים הוקרבו, גזור (B) לאסוף איברים שונים כמו מח העצם (C), הטחול (D), דם היקפיים (E) (מצוירים על ידי ניקוב לב לב), ו הכבד (F). האיברים האלה היו עיבוד נוסף, נותחו על ידי cytometry זרימה נוכחות של תאי B. G מייצגת את התבנית engraftment של תאים MCL באיברים שונים שמקורם MCL מוזרק NSG עכברים. התוצאות של שני חולים יוצגו. הנתונים מוצגים אומר ± SEM, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסויים קליניים אפשריות לתרופות הניתנות בשלב מתקדם של פיתוח אך אינם יכולים לשמש עבור גילוי תרופות. זמן כנראה תפס המאמצים לפתח נמענים בעלי חיים עבור התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים כדי לבדוק תרופות בשלב מוקדם. כאן אנו מציגים במודל חיה מונע דחיית שתל האנושית, יכול להקים מודל עבור מחלות אנושיות, כגון MCL. . זה כרגע דגם xenograft משוכללת כדי לחקור את המנגנונים של גידול אנושי engraftment, הגידול. כאן נשתמש NSG עכברים, אחד המודלים העכבר לקוי ביותר החיסון עד היום על מנת להשיג הצלחה גדולה יותר של לימפומה engraftment. NSG עכברים חסרי בוגרת תאי T, תאים B, תאי NK. הם גם בעלי ליקויי ציטוקין איתות ויש להם פגמים בתגובה חיסונית מולדת.
לימפוציט הכנה מדגם MCL הראשי על-ידי דחיסות צבע היא צעד חשוב כדי להסיר סוגי תאים אחרים כמו תאי דם אדומים ולבנים וטסיות דם. באופן מסורתי, צנטריפוגה מעבר צבע צפיפות מאפשר בידוד מוצלחת של לימפוציטים. עיבוד נוסף של לימפוציטים אלה כדי להעשיר את האוכלוסייה תא B מושגת על ידי שימוש ערכת העשרה תא B בעקבות הפרוטוקול כפי שמתואר בתוך כתב היד הזה. צריך לקחת כדי להשיג את טוהר גבוהה של לימפוציטים B האוכלוסיות להגיע engraftment אופטימלי של תאים לימפומה. התאים MCL שהם מזריקים לווריד (לפחות 40-60 x 106 תאים/עכבר) דרך הזנב לרוחב וריד ועכברים הורשו לפתח לימפומה עבור עד 10 שבועות. העכברים נבחנו היטב כל יום על הסימפטומים של המחלה כולל, ירידה במשקל, רפלד שיער, ירד פעילות, שיתוק גפיים הינד, וכו ניתוח של איברים שונים כמו הטחול, הכבד, מח עצם, דם על ידי cytometry זרימה חשף MCL engraftment. לאחרונה, הוכח כי ראשי MCL תאים engraft מח העצם, הטחול של עכברים NSG לקרינה-20 שבועות של הזרקת9. עצמאית של ממצא זה, בהצלחה פיתחנו שלנו דגם xenograft של ראשי MCL עם היווצרות הגידול מהירה יותר.
מודל זה העכבר xenograft עלולים להיות כלי שימושי ביותר עבור המחקר של התקדמות המחלה מסוגים שונים לימפומה. Xenograft מודלים מספקים כלים רבי-עוצמה כדי לבצע בדיקה פרה של תרופות עבור המטולוגיות ממאירות כמו MCL, עם זאת, במגבלות מסוימות לדוגמה, שיבוט דומיננטי נוכח relapse לחולה אינה בהכרח השיבוט העולה על השתלת איברים מבעלי חיים10. זה יכול להיות בגלל לחץ סלקטיבי שונים xenograft עובר במערכות מארח שונים. ההרכב hematopoietic של זן זה לא מלא מסכם את הדברים hematopoiesis האנושי, לפיכך, הגבלת את תחזוקה ארוכי טווח של תאים אנושיים. היתרונות בשימוש גידול אנושי xenografts עוקפת את המגבלות כמו התוצאות מתקבלים בעוד כמה שבועות של ביופסיה של הגידול האנושית לגבי התגובה לטיפול. תגובות סמים לא לעיתים קרובות לתאם עם פעילויות קליניים בחולים11 שורות תאים אנושיים במקום הגידול העיקרי תאים משמשים xenografts, אך הם עוזרים ליצור את היסודות תשובתכם טיפולית. השימוש של גידולים הראשי xenograft orthotropic יש ערך ניבוי התגובה חזק, במיוחד כאשר מינון התרופה הרלוונטית קלינית בשימוש11,12,13. יונת תאים לימפומה נישות שלהם היא דרישה מוקדמת חשובה על מנת לשרוד ולהקים הגידול engraftment. תהליך זה מוסדר צהובה דרך מערכת הלימפה, ושומר הערך של מחזורי לימפוציטים דרך venules אנדותל גבוה על הומאוסטזיס לימפוציטים בבלוטות הלימפה.
מחזור של לימפוציטים B דרך הלימפה דורש חציית המחסומים אנדותל נדידת תאים chemoattractant המופעלות על-ידי התערבות מתואמת עם מולקולות אדהזיה שונים. לכן, מיקוד המולקולות הקובעות את יונת של לימפוציטים נישות ההישרדות שלהם עשויה להוות את אסטרטגיית טיפול חדשה של לימפומות B cell כפי שהם מתנהגים בדומה לימפוציטים נורמלית. מטרתנו הייתה למקד את המולקולה ריבה-C, מולקולה אדהזיה מהחיבור, שבו קיים ב- MCL. מודל xenograft זה ישמש ללמוד את השפעות טיפוליות ריבה-C נוגדן על יונת ו engraftment של תאים לימפומה ראשונית נישות ההישרדות שלהם. אנחנו לאחרונה הראו השפעה של נוגדן אנטי-JAM-C בעכברים שקיבלו על שורת התאים MCL, Jeko-114. נוגדן זה הייתה השפעה חסימה על יונת של תאים Jeko-1 וגם כאשר ניתנת במרווחי זמן קבועים, שהיא מנעה ביעילות את engraftment של תאים Jeko-1. בנוסף השפעתו על יונת, הטיפול נוגדן משורש לימפומה engrafted רוב האברים נבדק זה עכברים14.
לאור השאלה מדעית וקלינית נותרים ללא מענה, גידולים xenografted אלה מייצגים כיום, מודל מעניין ללמוד את תוצאת MCL טיפולית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי le חדר מרווח וחדיש ליגה Genevoise סרטן, ד ר Fondation דובואה Ferriere דינו-ליפאטי, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, שוויצרי מענק קרן המדע הלאומית 31003A_156760 ו 310030-153456.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | for separation of mononuclear cells |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | for dilution of blood sample |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | washing of cells |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Charles River Laboratories | 5557 | used to develop MCL xenografts in this study |
| Easy sep Human B cell enrichment kit | Stem cell technologies | 19054 | used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment |
| 1X ammonium chloride potassium buffer | red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l ) |
References
- Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).
- Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th edition, (2001).
- De Silva, N. S., Klein, U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).
- Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma. Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).
- Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).
- Herrmann, A., et al. Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma. J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).
- Martin, P., et al. Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies. Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).
- Iyengar, S., et al. Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice. Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).
- Klco, J. M., et al. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts. Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).
- Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma. J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).
