Summary
Linfoma del manto (MCL) es un difícil de tratar el trastorno de la célula de B y es igualmente difícil establecer un modelo de ratón de xenoinjerto de MCL primaria a estudiar y desarrollar la terapéutica. Aquí, describimos el establecimiento acertado de xenoinjertos MCL en ratones para ayudar a comprender su biología subyacente.
Abstract
Los linfocitos B son actores clave en la circulación de células inmunitarias y principalmente hogar y residen en los órganos linfoides. Mientras que las células B normales sólo proliferan cuando estimulados por los linfocitos T, células B oncogénicas sobrevivirán y amplían autónomamente en nichos de órgano indefinido. Linfoma del manto (MCL) es un tal trastorno de la célula de B, donde la tasa mediana de supervivencia de los pacientes es 4-5 años. Esto requiere la necesidad de mecanismos efectivos por que se bloquean el autoguiado hacia el blanco y el injerto de estas células con el fin de aumentar la supervivencia y longevidad de los pacientes. Por lo tanto, el esfuerzo para desarrollar un modelo de ratón de xenoinjerto para estudiar la eficacia de la terapéutica MCL bloqueando la recalada mecanismo en vivo es de suma importancia. Desarrollo de receptores animales para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido perseguido, como modelos de ratón preclínicos relevantes son cruciales para nuevos agentes terapéuticos pantalla. Este modelo animal se desarrolla para evitar el rechazo al injerto humano y establecer un modelo para enfermedades humanas, y puede ser una herramienta extremadamente útil para el estudio de progresión de la enfermedad de tipos diferentes de linfoma y para efectuar la prueba preclínica de fármacos candidatos para malignidades hematológicas, como MCL. Hemos establecido un modelo de ratón de xenoinjerto que servirá como un excelente recurso para estudiar y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para MCL.
Introduction
Linfocitos por naturaleza un papel importante en la vigilancia inmune, y trata de linfocitos es un paso crítico en la inmunidad específica de antígeno1,2de montaje. Este proceso incluye la migración de linfocitos T del timo al torrente sanguíneo y de allí a los órganos linfoides secundarios, incluyendo los ganglios linfáticos, placas de Peyer y bazo, donde se encuentran los antígenos afines. Los linfocitos B diferencian en la médula ósea y migran como ingenuo células en los folículos de los órganos linfoides secundarios3. Algunas de estas células B antígeno con su receptor unen y son activados por células T específicas. Proliferación y diferenciación de estas células B empuja las células Naive B desactivado, en la zona del manto del folículo. Las células activadas pueden distinguir entonces en memoria B las células, que patrullan el cuerpo, o maduran en inmunoglobulinas secretoras de las células plasmáticas que migran a la médula ósea4.
MCL se produce cuando los linfocitos B en la zona del manto se transforman en un tumor. Estas células de linfoma residen en el microambiente de los órganos linfoides y proliferan independientemente de linfocitos T específicos de control. Sin embargo, en un determinado momento de densidad escapan de este nicho y recirculan en el torrente sanguíneo en búsqueda de nichos en otros órganos. Teniendo en cuenta la complejidad de las moléculas de adhesión y la promiscuidad de quimiocinas y sus receptores, el mecanismo de este celular trata en vivo es mal entendido y por lo tanto dificulta la terapia. Se necesitan métodos nuevos para bloquear este proceso de migración para evitar que las células del linfoma B llegando a microambientes nuevo.
MCL es uno de los más difíciles para el tratamiento de tumores malignos de células B. El desarrollo de un fenotipo neoplásico de MCL es el resultado de una cascada multietapa, caracterizado por la adquisición de propiedades biológicas únicas. En el momento del diagnóstico, mayoría (70%) de los pacientes ya presentan una enfermedad diseminada, con una mayoría de casos exponiendo implicación extranodal en bazo, médula ósea, y en el tracto gastrointestinal5,6. En los pacientes tratados, recaídas de tumores resistentes dentro de unos años es común, a pesar de la quimioterapia convencional induce tasas de remisión alta a corto plazo7,8. Aquí presentamos un nuevo modelo de enfermedad que puede ayudar a entender su biología subyacente y difusión MCL: establecimos un modelo humano del ratón del xenoinjerto MCL que se originaron en las células del tumor primario de los pacientes. Esperamos que este modelo ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas contra difusión de MCL y posiblemente proporcionar nuevas perspectivas clínicas para óptimo diagnóstico y tratamiento de los pacientes recaídos.
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Protocol
Las muestras de sangre humana fueron utilizadas según procedimientos aprobados por los comités de experimentación humana del Hospital Universitario de Ginebra y de ética local.
Animales procedimientos fueron realizados según el institucional ética Comité de Animal Care en Ginebra, Suiza y la Oficina veterinaria Cantonal (número de autorización: 26/GE/15).
1. preparación de células mononucleares de sangre periférica primaria (PBMCs) por separación de gradiente de densidad
Nota: 3-5 mL de sangre periférica se obtuvo de pacientes con MCL en una fase leucémica. El diagnóstico fue establecido de acuerdo con criterios estándar de diagnóstico para citometría de flujo (CD5 +, CD23−, CD200 +, población monoclonal de células B) y posteriormente confirmado por la presencia de la translocación cromosómica t(11;14) y sobreexpresión de ciclina D1. En todos los casos, células B monoclonales constituyeron a > 90% de la población total de células B. Las células restantes fueron principalmente monocitos y algunos linfocitos T.
- Diluir 5 mL (1:1) de la muestra de sangre MCL con 5 mL de medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).
- Invertir los medios gradiente de densidad (Tabla de materiales) varias veces antes de su uso para asegurar una mezcla completa.
- Añadir 5 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador de pipeta.
- Capa de la muestra de sangre diluida suavemente sobre los medios de gradiente de densidad en el tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador (relación medios gradiente de densidad de la sangre debe ser 2:1, por ejemplo, 10 mL de sangre a 5 mL de medio de gradiente de densidad). Debe tenerse cuidado para no mezclar las dos capas (figura 1B, C).
- Centrifugar la muestra a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente con los frenos de la centrifugadora apagados.
- Suavemente con una pipeta Pasteur estéril, aspirar la capa media (anillo blanquecino, delgado marcado con una flecha (figura 1, E)) que contiene las células mononucleares y transferirlos a un tubo limpio.
- Lavado de células mononucleares
- Estimar el volumen de la suspensión de células transferidas y añadirle 3 volúmenes de estéril 1 x de tampón fosfato salino (PBS) con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
- Mezcle la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.
- Centrifugar la suspensión a 400-500 x g durante 10-15 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante para obtener el precipitado de células y repetir el paso de lavado.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en el volumen deseado, por ejemplo, 1 o 2 mL de PBS.
- Contar el número de células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro (cámara de Neubauer).
2. enriquecimiento de las células B por selección negativa de células B
- Diluir las células en PBS a una concentración final de 50 x 106 células/mL.
- Transferir las células a 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo. Añadir 100 μl de anticuerpo cóctel del kit de enriquecimiento de la célula de B de 2 ml de la suspensión celular y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo (figura 2-1).
- Incube las células a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Brevemente vortex las partículas magnéticas proporcionan en el kit de enriquecimiento de células B durante 30 s (figura 2-2). Añadir 150 μL de las partículas magnéticas a 2 mL de la muestra.
- Incubar la muestra para otros 5 minutos a temperatura ambiente.
- Llevar el volumen de muestra a 2.5 mL con PBS de x 1 que contiene 2% de suero de ternero fetal (FCS) y ácido etilendiaminotetraacético de 1 mM (EDTA). Coloque el tubo en el imán e incubar el tubo por otro 3-5 min (figura 2-3).
- Recoger el imán con el tubo en su lugar y en un movimiento continuo, decantar el tubo para que la suspensión de células enriquecido se recoge en un tubo fresco (figura 2-4). Contar las células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro para obtener el rendimiento total de las células de B.
Nota: Normalmente, el rendimiento es ~ 105 B células/mL para normal las células de B y 5-50 x 106 células/mL para MCL. - Confirmar la pureza del enriquecimiento de la célula de B
- Tomar ~ 50.000 células e incubar las células con anticuerpos anti-CD19/CD20 (1:20 dilución) y anticuerpo anti-CD45, junto a diferentes fluorocromos (1:10 dilución) a temperatura ambiente durante 15-30 min.
- Lavar con 1 mL de 1 x PBS + 1% de BSA, centrifugar las células a 400-500 x g durante 5 min y resuspender las células en ~ 200 μL de PBS.
- Adquirir las muestras de células por citometría de flujo y analizar la pureza de las células de B. La pureza es en su mayoría > 90% por este método (figura 3).
3. desarrollo del modelo de ratón de xenoinjerto
- Suspender ~ 40-60 x 106 células en 150-200 μL de PBS 1 x (volumen necesaria para inyectar al ratón).
- Inyecte 150 μL de la suspensión celular por vía intravenosa (i.v.) en cada vena de la cola de ratones inmunodeficientes 6-7 semana viejo de la gamma (NSG) del NOD scid independientemente del género (Figura 4A).
- Permitir que los ratones a desarrollar linfoma humano de aproximadamente 10 semanas.
Nota: Las células de linfoma humano primario toman mucho más tiempo para desarrollar tumor en comparación con líneas de células de linfoma humano (~ 3 semanas). - Cuando los animales comienzan a mostrar síntomas de una enfermedad mortal como la pérdida de peso, pelo rizado, parálisis de extremidades, disminución de la actividad, etc., sacrificar a los ratones por CO2 asfixia seguida por punción cardiaca corazón para obtener sangre.
- Recogemos diferentes órganos como médula ósea, bazo y hígado por disección de los ratones y recoger sangre periférica por extraer sangre desde el corazón en el momento del sacrificio para el análisis de engraftment de tumor (Figura 4B -F).
4. Análisis de quimerismo de células tumorales Engrafted en diferentes órganos
- Después de recoger los diferentes órganos, procesarlos por la interrupción mecánica para generar suspensiones de la célula después de lisis de glóbulos rojos (gr) con 200 μL de 1 x de buffer de cloruro de amonio potasio de sangre y médula ósea, 500 μl de bazo y 2 mL para el hígado .
- Cuente y teñir las células con anticuerpos de células B humanas, es decir, anti-CD19, anti-CD20 y anti-CD45.
Nota: Ratones NSG carecen las células de B y por lo tanto, para el análisis, se tiñen las células con marcadores de células B específicas humanas. - Analizar las células de cada órgano mediante citometría de flujo por que bloquean a las células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Cuantificar las células del tumor implantada en diversos órganos derivadas de ratones MCL inyectado en las células cerradas base como se indica en el paso 4.3 (figura 4).
Nota: Para detalles, véase Tabla de materiales .
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Representative Results
El manuscrito describe un protocolo optimizado para el desarrollo exitoso de un modelo de ratón de xenoinjerto de engraftment de células MCL. Preparación de una población celular pura (en este caso células MCL), es muy crítico para desarrollar exitosos xenoinjertos MCL. La figura 1 representa los pasos preparativas para el aislamiento de células mononucleares de sangre del paciente MCL por separación de gradiente de densidad. Las células mononucleares son procesadas más lejos para obtener las células de B puras utilizando un kit de enriquecimiento negativo la célula de B para obtener una población celular pura para la inyección de xenoinjerto en ratones. Debe tenerse cuidado para obtener la máxima pureza para engraftment acertado de MCL. La pureza obtenida mediante este método generalmente es > 90%. Las células restantes fueron principalmente monocitos y algunos linfocitos T (datos no mostrados).
Figura 2 representa los distintos pasos del Protocolo de purificación de células B como se describe en la sección de métodos. Las células enriquecidas se analizan más lejos su pureza por citometría de flujo utilizando diferentes marcadores (CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa y lambda). Control secuencial como se muestra en la figura 3 permite la caracterización de células MCL: CD45 +, CD19 +, CD20 +, CD5 +, CD23− y CD200− son seleccionados. Indemnización por la coloración multicolor se llevó a cabo mediante controles manchados solo para cada uno de los fluorocromos utilizados, según la configuración estándar de citometría.
Figura 3E G representa la trama de punto típicos de las células B, antes y después de enriquecimiento. En este caso, > 95% de las células enriquecidas con este kit son las células de B. Las células son suspendidas en PBS a una concentración de 40-60 × 106 células en 150-200 μL PBS como se menciona en el protocolo. Ellos inmediatamente fueron inyectadas i.v. a los ratones de la NSG. Después de 10 semanas, > 90% de los inyectados animales desarrollados linfoma muestra signos de enfermedad terminal (pérdida de peso, cabello rizado, disminución de la actividad, etc.). Después del sacrificio, el bazo y el hígado se quitan y procesados para obtener suspensiones celulares solo por la interrupción mecánica (figura 4, F); con cuidado se extrae sangre por punción cardiaca corazón y la médula ósea es procesada por cortar ambos extremos del fémur y lavado con una jeringa de 2 mL llena con Medio RPMI o PBS (figura 4). Las células son más procesadas por citometría de flujo utilizando marcadores específicos de células humanas de la B como CD19/CD20 y CD45. Se utilizaron marcadores específicos de células B humanas aquí porque la cepa de ratón receptor (NSG) carece de las células de B. Figura 4B - F representa la colección de órganos después del sacrificio y los pasos de procesamiento posterior. El grado de engraftment de células MCL de dos pacientes se representa en la figura 4. El patrón de injerto en diversos órganos y entre pacientes puede compararse siguiendo esta técnica.
Figura 1: aislamiento de PBMCs de sangre. Sangre de un paciente MCL es diluido 1:1 en Medio RPMI (A) y coloca con cuidado encima de la capa media del gradiente de densidad (B) sin mezclar la sangre en este medio de gradiente de densidad (C). Centrifugación a 400 x g durante 45 minutos separa las células mononucleares, que aparecen como anillo blanquecino (la flecha indica la capa de células mononucleares) (D). Esta capa se pipetea suavemente sin mezclar con otras capas en un tubo limpio para tratamiento posterior (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: enriquecimiento de B las células de PBMCs. Aislado por centrifugación gradiente densidad PBMCs se lavan dos veces con PBS. Utilizando el negativo B celular kit de enriquecimiento y siguiendo el protocolo del fabricante, una población pura de células de B se obtiene (1–4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: análisis FACS de células MCL y pureza de B las células antes y después de enriquecimiento de. Las células mononucleares de MCL se caracterizan por el análisis FACS utilizando diferentes marcadores como CD45, CD19, CD20, CD23, CD200, CD5, kappa y lambda. Las células que son positivas para CD45, CD19, CD20, CD5 y negativo para CD23 y CD200 son seleccionan (A–F). G representa la población de la célula después de enriquecimiento mediante el kit de selección negativa en comparación con E, que es antes de enriquecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ratones NSG como un modelo de xenoinjerto de engraftment de células MCL. Células B de pacientes MCL fueron inyectadas i.v. vía la vena lateral de la cola de los ratones del grupo (A). Después de permitir que varios días por el tumor al engraft, los ratones fueron sacrificados y disecado (B) para recoger diversos órganos como la médula ósea (C), bazo (D), sangre periférica (E) (dibujados por punción cardiaca corazón), y hígado (F). Estos órganos fueron procesados más y analizados por citometría de flujo para detectar la presencia de células B. G representa el patrón de engraftment de células MCL en diferentes órganos derivados de MCL inyectó ratones NSG. Se muestran los resultados de dos pacientes. Datos se muestran como media ± SEM, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los ensayos clínicos son posibles para los medicamentos que están en una etapa avanzada de desarrollo pero no se puede utilizar para el descubrimiento de medicamentos. Esfuerzos para desarrollar a animales destinatarios para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido llevadas a cabo. Aquí presentamos un modelo animal que evita el rechazo al injerto humano y puede establecer un modelo para enfermedades humanas, como MCL. Esto es en la actualidad un modelo de xenoinjerto de vanguardia para el estudio de los mecanismos del engraftment tumorales humanas y el crecimiento del tumor. Aquí utilizamos ratones NSG, uno de los modelos de ratón deficientes más inmunes a la fecha con el fin de lograr el mayor éxito del engraftment del linfoma. Ratones NSG carecen de células T maduras, las células B y células NK. También han deteriorado citoquinas señalización y tener defectos en la respuesta inmune innata.
Preparación de linfocitos de la muestra primaria de MCL por gradiente de densidad es un paso importante para eliminar otros tipos de células como glóbulos rojos y plaquetas. Tradicionalmente, una centrifugación del gradiente de densidad permite aislamiento exitoso de linfocitos. Tratamiento ulterior de estos linfocitos para enriquecer la población de la célula de B se obtiene por el uso de un equipo de enriquecimiento de células B siguiendo el protocolo como se describe en este manuscrito. Debe tenerse cuidado para lograr una alta pureza de las poblaciones de linfocitos B a engraftment óptima de las células del linfoma. Las células MCL se inyectan por vía intravenosa (por lo menos 40-60 x 106 células/ratón) a través de la cola lateral la vena y los ratones podían desarrollar linfoma durante 10 semanas. Los ratones fueron examinados de cerca todos los días para los síntomas de la enfermedad incluyendo, pérdida de peso, rizado de cabello, disminución de la actividad, parálisis de extremidades, etc. análisis de los diferentes órganos como el bazo, hígado, médula ósea y sangre por citometría de flujo reveló MCL engraftment. Recientemente, se ha demostrado que las células primarias de MCL engraft en médula ósea y bazo de ratones irradiados de NSG en 20 semanas de inyección9. Independiente de este hallazgo, hemos desarrollado con éxito nuestro propio modelo de xenoinjerto de MCL primaria con formación más rápida del tumor.
Este modelo de ratón de xenoinjerto puede convertirse en una herramienta extremadamente útil para el estudio de la progresión de la enfermedad de tipos diferentes de linfoma. Modelos de xenoinjerto también proporcionan herramientas poderosas para efectuar la prueba preclínica de fármacos candidatos para las malignidades hematológicas como MCL, sin embargo, con ciertas limitaciones por ejemplo, el clon dominante presente en la recaída en un paciente no es necesariamente el clon emergentes en el xenotrasplante10. Esto podría ser debido a la presión selectiva diferente que pasa por el xenoinjerto en diferentes hosts. La composición hematopoyética en esta variedad no recapitular completamente hematopoyesis humana, por lo tanto, limita el mantenimiento a largo plazo de las células humanas. Las ventajas en la utilización de xenoinjertos de tumores humanos anula las limitaciones como se obtienen resultados en pocas semanas de una biopsia del tumor humano en respuesta a la terapia. Respuestas de drogas no se correlacionan a menudo con actividad clínica en pacientes11 líneas de células humanas en lugar de las células del tumor primario se utilizan como xenoinjertos, pero ayudan a formar las bases para la posible respuesta terapéutica. El uso de los tumores primarios como un xenoinjerto ortotrópico tiene un fuerte valor predictivo de la respuesta, particularmente cuando una dosis de drogas clínicamente relevante es usado11,12,13. Autoguiado hacia el blanco de las células del linfoma a los nichos es un requisito previo importante para sobrevivir y establecer engraftment del tumor. Este proceso está regulado mayormente a través del sistema linfático, y la entrada de linfocitos a través de los altos venules endoteliales circulantes mantiene la homeostasis de los linfocitos en los ganglios linfáticos.
Circulación de linfocitos B a través de los ganglios linfáticos requiere cruce barreras endoteliales y migración celular desencadenados por chemoattractant por la coordinada interacción con moléculas de adhesión diferentes. Por lo tanto, dirigida a las moléculas que controlan el homing de linfocitos a sus nichos de supervivencia podría constituir una nueva estrategia de tratamiento para los linfomas de células B como se comportan similar a los linfocitos normales. Nuestro objetivo era orientar la molécula JAM-C, una molécula de adherencia junctional, que está presente en MCL. Este modelo de xenoinjerto Endobon® se utilizará para estudiar los efectos terapéuticos del anticuerpo C mermelada de autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células de linfoma primario a sus nichos de supervivencia. Recientemente hemos demostrado un efecto de anticuerpos anti-JAM-C en ratones que recibieron una línea celular MCL, Jeko-114. Este anticuerpo tenía un efecto de bloqueo en autoguiado hacia el blanco de las células Jeko-1 y también cuando se administra en intervalos regulares, previno eficientemente el engraftment de células Jeko-1. Además de su efecto en autoguiado hacia el blanco, el tratamiento de anticuerpo erradicar el linfoma engrafted en la mayoría de los órganos en este ratones14.
A la luz de la pregunta científica y clínica se aborda, estos tumores investigaciones representan en la actualidad, un interesante modelo para el estudio de los resultados terapéuticos de MCL.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ligue Genevoise contre le Cancer, Fundación Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 y 2914-02-2012 y subvención de Fundación de ciencia nacional suizo 31003A_156760 y 310030-153456.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | for separation of mononuclear cells |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | for dilution of blood sample |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | washing of cells |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Cell surface protein typically absent in MCL |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Charles River Laboratories | 5557 | used to develop MCL xenografts in this study |
| Easy sep Human B cell enrichment kit | Stem cell technologies | 19054 | used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment |
| 1X ammonium chloride potassium buffer | red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l ) |
References
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