Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Published: August 31, 2017 doi: 10.3791/56024

Summary

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Abstract

Jarenlang waren best onderscheid tussen skelet spiervezel typen gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring. Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator van fiber-type. Type I, type IIA, typ IIX en type IIB vezels kunnen nu worden geïdentificeerd met precisie op basis van het profiel van hun MyHC; Handmatige analyse van deze gegevens kan echter traag en omlaag-rechts vervelend. Snelle, nauwkeurige beoordeling van het type vezel samenstelling en morfologie is in dit verband een zeer wenselijk hulpmiddel. Hier presenteren we een protocol voor state-of-the-art immunohistochemische kleuring van MyHCs in bevroren secties muis stuk spier in concert met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels verkregen. Zoals verwacht, de Musculus soleus weergegeven kleuring voor type I en type IIA vezels, maar niet voor type IIX of type IIB vezels. Aan de andere kant, de tibialis anterior spier bestond voornamelijk uit type IIX en type IIB vezels, een klein deel van het type IIA vezels en weinig of geen typ ik vezels. Meerdere afbeelding transformaties werden gebruikt voor het genereren van waarschijnlijkheid kaarten met het oog op het meten van de verschillende aspecten van de morfologie van de vezel (d.w.z., doorsnede (CSA), maximale en minimale Feret diameter). De waarden voor deze parameters vervolgens met handmatig verkregen waarden vergeleken werden. Geen significante verschillen werden waargenomen tussen beide modus van analyse met betrekking tot CSA, maximale of minimale Feret diameter (alle p > 0,05), met vermelding van de nauwkeurigheid van onze methode. Dus kan onze immunokleuring analyse protocol worden toegepast op het onderzoek van de effecten op de spier samenstelling in vele modellen van veroudering en myopathie.

Introduction

Het is gekend voor enige tijd dat skeletspier uit één vezels van vele typen1 bestaat. Aanvankelijk twee soorten vezels werden gekenmerkt op basis van hun contractiele eigenschappen en genoemd, naar behoren, slow-twitch (type I) en fast-twitch (type II). Deze categorieën werden verder onderscheiden op basis van glasvezel metabolisme. Daar typ ik vezels zijn rijk aan mitochondriën en afhankelijk van het oxidatieve metabolisme, ze werden toegelicht door krachtig positieve nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase2 of succinaat dehydrogenase (SDH)3 kleuring. Daarentegen, type II vezels minder tentoongesteld en variabele graden van NADH-TR diaphorase of SDH kleuring en werden verdeeld in twee subgroepen van de fast-twitch (typt u IIA en IIB) enigszins ruw op basis van hun relatieve oxidatieve capaciteit. Dit onderscheid tussen vezels hebben effectiever zijn gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring wanneer type-I vezels donkere vlekken na een pre-incubatie bij pH 4.0 en type IIB vezels absorberen overhaaste volgende pre-incubatie bij pH 10.0 met type IIA vezels kleuring gearchiveerd4.

Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator type vezel5. Type I, type II en type IIB vezels kunnen worden alle geïdentificeerd met precisie op basis van hun MyHC profiel. Bovendien, een ander type van de fast-twitch metabolisch intermediair vezel, IIX, typ geweest geïdentificeerde6. Hybride vezels uiting van meer dan één MyHC zijn ook bevestigde5,7,8. Sommige soorten zoals de kat en de baviaan bekend er niet uitdrukkelijke Type IIB MyHCs6. MyHC immunokleuring is momenteel de state-of-the-art beoordeling van spier samenstelling, wel de analyse van de gegevens die zijn verkregen via deze techniek omslachtig en tijdrovend zonder geautomatiseerde hulp. Te dien einde geweest een handvol semi-geautomatiseerde methoden voor het analyseren van deze gegevens ontwikkelde5,9,10. Hier presenteren we een relatief standaardprotocol voor de immunohistochemische identificatie van spiervezel-type5,7,8,10, samen met een semi-automatische roman algoritme dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels met nauwkeurigheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle procedures waarbij muizen door de Universiteit van Colorado-Anschutz medische Campus institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd (91813(05)1D).

1. dag 1: primaire (1°) immunokleuring met boviene serumalbumine (BSA) blokkeren

  1. luchtdroge bevroren secties van muis stuk spier (bijvoorbeeld tibialis anterior, soleus) gemonteerd op geladen geleiders voor ~ 30 min 11. een rand rond de secties met een hydrofobe barrière PAP pen tekenen.
  2. Plaats ~ 250 µL 5% BSA/fosfaatgebufferde zoutoplossing (BSA/PBS) op elke dia te blokkeren van niet-specifieke antilichaam binding. Incubeer dia's bij kamertemperatuur voor 1 h.
  3. Terwijl het blokkeren, bereiden 1:50 verdunningen van het 1° antilichaam supernatant in 5% BSA/PBS (alle zijn muis monoklonale antilichamen; Zie tabel 1 6 , 12); 250 µL van bereiden oplossing per dia. Houd 1° antilichaam voorraden en verdunningen op ice.

Table 1
tabel 1: primaire antilichamen gebruikt om te onderscheiden MyHCs.

  1. na aspiratie van de 5% BSA/PBS blokkerende oplossing, 250 µL van 1° antilichaam verdunning aan de juiste dia's toevoegen. Toevoegen van 250 µL van 5% BSA/PBS aan secundaire (2°) antilichaam-alleen negatieve controle slides.
  2. Incubate bij 4 ° C gedurende 24-48 uur in een vochtige omgeving.
    Opmerking: Een petrischaal bedekt met aluminiumfolie met vochtige filterpapier kan dienen als een kamer geschikt incubatie.

2. Dag 2:2 ° immunokleuring met fluorescerende antilichamen

  1. 1° antilichaam oplossing gecombineerd of controle van 5% BSA/PBS-oplossing. Wassen all dia's drie keer, 10 min met 5% BSA.
  2. Tijdens het wassen, maak 1:200 verdunningen van het gezuiverde, fluorophore-geconjugeerde 2 ° antistoffen bij 5% BSA/PBS (Zie tabel 2, allemaal geit anti-muis). 250 µL van oplossing per dia voor te bereiden. 2° fluorophore-geconjugeerde antilichamen in het donker op ice. houden

Table 2
tabel 2: Fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen gebruikt om te visualiseren primaire antilichaam erkenning van MyHCs.

  1. na aspiratie van de derde toepassing van blokkerende oplossing van 5% BSA/PBS, voeg 250 µL van 2° antilichaam verdunning op alle dia's. Incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur in een donkere, vochtige omgeving.
  2. Aspirate 2° antilichaam oplossing. Wassen all dia's drie keer, 10 min met 5% BSA/PBS.
  3. Uitspoelen met PBS. 10 min. drogen
  4. Mount het dekglaasje met een niet-permanente, lage viscositeit waterige montage medium.
  5. Droog, verzegelen de randen van de dia met nagellak. Droog en bewaar in een donkere slidebox.

3. Dia's met Epifluorescence microscopie Imaging

  1. de dia's met een kleine, 70% ethanol doordrenkte lab-veeg schoon.
  2. Verkrijgen digitale beelden van immunostained spier secties met behulp van een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met een fotografische apparatuur (Zie de Tabel van de materialen).
    1. Selecteer een gebied van ongeveer 1 mm 2 (10 X doelstelling, 1.4 nb).
    2. View 2° Alexa 488-geconjugeerde antilichaam fluorescentie via een 505 nm long pass filter. Bekijk de fluorescentie gegenereerd door excitatie van 2° Alexa 594-geconjugeerde antilichamen via een 595 nm long pass filter. Afbeeldingen digitaliseren met een PC uitgerust met een compatibele imagingsoftware. Omvatten van de bar van de schaal van de denkbaar software voor een latere anayse.

4. Analyse van beelden met Fiji

Opmerking: voordat u verdergaat met analyse, Fiji (beschikbaar vrij van de National Institutes of Health, Bethesda, MD) moet worden geïnstalleerd via https://imagej.net/Fiji/Downloads. De macro gebruikt in dit proces is ook voorzien in het Aanvullende bestand. Plaats van het macro-bestand in een gemakkelijk toegankelijke map.

  1. Belasting een helderveld afbeelding van een geselecteerde sectie in Fiji. Ga naar Plugins → segmentatie → trainbaar Weka segmentatie.
  2. Om te bepalen van de cellulaire gebieden van de afdeling, trek een lijn op een vezel, en klik op " toevoegen aan de klasse 1 ". Vervolgens een lijn op de ruimte tussen de vezels trekken, en op " toevoegen aan klasse 2 " ter gelegenheid van de extracellulaire domeinen. Herhaal totdat er 5-10 labels in elke klasse zijn.
    1. Klik op trein classificatie. Op de resulterende rode en groene overlay, handmatig meer labels toevoegen (zie stap 4.2) onjuist gesegmenteerde stukken van de afbeelding, indien nodig. Herhaal totdat vezels (rood) op de juiste manier zijn gescheiden van de ruimte tussen de vezels (groen).
  3. Klik " krijgen kans " en sla de afbeelding op in een nieuw label map.
  4. Herhaal de bovenstaande procedure (stap 4.2-4.3) met de fluorescerende beeld genomen uit hetzelfde veld. Label immunostained vezels als " klasse 1 " en alle niet-belichting fluorescerende regio's als " klasse 2 ". De resulterende kans-kaart opslaan in dezelfde map waar de verwerkte helderveld afbeelding is opgeslagen.
  5. Open één van de eerder opgeslagen waarschijnlijkheid kaarten in Fiji. Een rechte lijn tekenen op de werkbalk van de schaal verstrekt door de imaging software. Ga naar het analyseren → schaal instellen. Wijzigen van de parameters (d.w.z., bekende afstand, lengte-eenheid) naar de bijbehorende waarden als gegeven door de schaal bar, controleer dan de " Global " vak op de standaardisering van de schaal voor elk beeld.
  6. Navigeer naar Plugins → macro's → uitvoeren → Tyagi et al. vezel kwantificering macro.ijm (Zie het Aanvullende bestand). Onmiddellijk, zal een ruit van de navigatie verschijnen. Open de afbeelding ' s host map; Er verschijnt een dialoogvenster. Voor elk dialoogvenster, veranderen de " achtergrond " dropdown waarde aan " licht. "
    Opmerking: de map wordt nu gevuld met beelden van de vezel omtrekken en spreadsheet-bestanden van de software van de resultaten (CSA en Feret diameter zijn meest relevant zijn voor kwantificeren van de vezel de morfologie; gemeten parameters kunnen worden aangepast in analyseren Set metingen). Vezel morfologie gegevens gegenereerd door de functie van de porie-analyse van Fiji zal automatisch worden overgedragen aan de spreadsheet-bestanden van de software voor beide TL en helder veld beelden.
  7. Berekenen van de Fractie van de vezels uiting geven aan een bepaalde MyHC in een veld door het verdelen van het aantal fluorescerende vezels in het veld door het aantal totale vezels in het beeld helder veld overeenkomstige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stuk spieren (dat wil zeggen, tibialis anterior, soleus) ontleed van een mannelijke C57BL/6 muis van onbekende leeftijd waren flash bevroren door het zinken van een plastic mal de spier in LGO met samengestelde in vloeibare stikstof-gekoelde tolueen. Met behulp van een cryotome, waren 8-10 µm seriële secties Knip bij-20 ° C en vervolgens overgebracht naar verschillende positief-geladen glas dia's12.

We kozen voor tibialis anterior en soleus omdat deze spieren bestaan hoofdzakelijk uit snelle - en slow-twitch vezels, respectievelijk13,14. Naar aanleiding van immunohistochemische kleuring voor individuele type I, II, IIX en IIB MyHCs, helderveld en TL beelden werden gevangen. De linker panelen van Figuur 1 weergegeven secties van een soleus spier immunostained met het type I, II, IIX en IIB MyHC-specifieke antilichamen vermeld in tabel 1.

Figure 1
Figuur 1 : Immunohistochemische kleuring van MyHC type I, II, IIX en IIB in muis Musculus soleus. Linker panelen Toon fluorescerende beelden verkregen uit delen van een muis Musculus soleus gesondeerd met primaire antilichamen gericht op typ ik (BA-F8; A), typ IIA (SC-71; B), typ IIX (6 H 1; C) en type IIB (BF-F3; D) MyHCs. Rechts panelen tonen de secties waarin het primaire antilichaam gebruikt in het experiment afgebeeld in het overeenkomstige linker paneel werd weggelaten. Bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Specifiek, waargenomen we aanzienlijke breuken van vezels uiting van type I (Figuur 1A, links) en type IIA MyHCs (Figuur 1B, links) met een redelijk bedrag van de resterende vezels weergeven positieve kleuring voor type IIX MyHCs (Figuur 1C, links). Daarentegen waren vrijwel geen type IIB vezels duidelijk (Figuur 1D, links). Deze opmerkingen zijn in overeenstemming met eerdere rapporten die soleus spieren bestaat meestal van het type I, type IIA en typ IIX vezels (minder zo) met bijna geen type IIB vezels5,10,12. Nog belangrijker is, werd geen kleuring waargenomen in secties waarin het primaire antilichaam had weggelaten uit het protocol, aan te tonen de specificiteit van de antilichamen (Figuur 1A-D, juiste panelen).

Figure 2
Figuur 2 : Immunohistochemische kleuring van MyHC type IIB, IIX, IIA en ik in muis tibialis anterior spier. Linker panelen tonen fluorescerende beelden verkregen van secties van een muis tibialis anterior spier gesondeerd met primaire antilichamen gericht type IIB (A), en te typen IIX (B), typ IIA (C) ik (D) MyHCs. Rechts panelen tonen de secties waarin het primaire antilichaam gebruikt in het experiment afgebeeld in het aangrenzende linker paneel werd weggelaten. Bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

We ook gekleurd tibialis anterior spieren met de eerder genoemde antilichamen. Anterior tibialis spieren werden meestal van het type IIB en type IIX MyHC-positieve vezels (Figuur 2A-B, verliet panelen) samengesteld met kleinere bijdragen van vezels uiten type IIA MyHCs (Figuur 2C, links); vrijwel geen uiting van type vezels ik MyHC werden waargenomen (Figuur 2D, links). Onze gegevens waaruit blijkt dat de muis tibialis anterior is voornamelijk samengesteld uit snel kramp type IIA, type IIB en type IIX vezels zijn in overeenstemming met eerdere studies5,10,13. Nogmaals, geen kleuring werd waargenomen in de secties waarin het primaire antilichaam had weggelaten uit het protocol (Figuur 2A-D, juiste panelen).

Figure 3
Figuur 3 : Herhaalde geautomatiseerde vezel segmentatie. Helderveld afbeelding van een muis tibialis anterior deel (A). Transformatie van het zelfde beeld met behulp van onze semi-geautomatiseerde algoritme (B). Fluorescerende afbeelding van dezelfde sectie tonen van immunokleuring van het type IIA MyHC (C). Transformatie afbeelding toont enige type IIA MyHC-uiten vezels (D). Bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Met het oog op de analyse van de Morfometrische, helderveld beelden van de immunostained velden, ook werden verkregen. Het voorbeeld in Figuur 3A is uit een tibialis anterior spier sectie gesondeerd met SC-71 antilichamen gericht aan het type IIA MyHCs13. Met behulp van onze oorspronkelijke semi-geautomatiseerde algoritme, werden meerdere afbeelding transformaties gebruikt voor het genereren van kaarten van de waarschijnlijkheid van de helderveld beelden. De transformatie van een typisch beeld afgeleid van de helderveld afbeelding weergegeven in Figuur 3A wordt in Figuur 3Bgepresenteerd. Met behulp van de transformatie en de porie analyse functie van Fiji, we de gemiddelde CSA (891.4 ± 45.0 µm2), maximaal (46.9 ± 1,3 µm) en minimale (26.0 ± 0.8 µm) gemiddelde Feret diameters van elke vezel in het veld gemeten. Om te testen de trouw van onze metingen, beoordeeld wij ook deze parameters in de helderveld afbeelding handmatig. De gemiddelde CSA (867.0 ± 52.0 µm2), maximum (45.7 ± 3,5 µm) en minimum (25.6 ± 1.9 µm) betekenen Feret diameters opgehaald met de methode handmatige overname meer vervelend waren niet significant verschillend van de semi-geautomatiseerde methode (alle p > 0,05, ongepaarde t-test; Tabel 3).

Table 3= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tabel 3: Fiber morfologie en samenstelling van de tibialis anterior spier immunostained voor type I, IIA, IIB en IIX MyHCs zoals bepaald door handmatige en semi-automatische analytische methoden. Bedoel van vezel CSA, bedoel Feret diameters en type van de MyHC in een muis tibialis anterior gekwantificeerd via traditionele handmatige evaluatie ten opzichte van de gepresenteerde algoritme. Houd er rekening mee dat gecombineerde breuken groter zijn dan de waarde 1 als gevolg van de aanwezigheid van vezels uiting van meer dan één type van de MyHC.

Figuur 3 C toont een fluorescerende beeld van de dezelfde veld immunostained met antilichamen gericht IIA MyHCs typt. Positief gebeitste vezels in het veld geselecteerd door nummer (Figuur 3D) en gebruikt om te bepalen van de Fractie van de vezels van het type IIA MyHC-uiten door te delen door het totale aantal vezels in het helderveld transformatie veld (tabel 3 ). De gemiddelde CSA, maximale en minimale Feret diameters van type IIA vezels vervolgens werden beoordeeld (tabel 3). Het aandeel van type I, type IIX en type IIB vezels, alsmede hun afmetingen, werden bepaald door het herhalen van dit protocol in seriële secties immunostained met BA-F8, 6H 1 en BF-F3 antilichamen, respectievelijk6,12(tabel 4 ; Figuur 4 A-D).

Table 4
Tabel 4: MyHC inhoud en morfologie in muis soleus en tibialis anterior. Vezel type composities van representatieve secties van de soleus en de tibialis anterior. Kwantificering van gemiddelde CSA, minimale en maximale Feret diameters van type I, type IIA, typ IIX en type IIB in zowel de soleus en de tibialis anterior worden weergegeven. Gegevens worden gegeven als de gemiddelde ±SEM.

Wij ook beoordeeld deze parameters in een veld dat is verkregen van de Musculus soleus (tabel 4; Figuur 4 A-D). 3,052 en 2,876 individuele vezels werden geteld voor de tibialis anterior en de soleus spieren, respectievelijk. Samen genomen, aantonen deze gegevens de haalbaarheid van onze werkwijze in type vezel en Morfometrische-analyse.

Figure 4
Figuur 4 : Morfometrische analysegegevens samenvatting. Vezel-achtige composities van representatieve secties van de tibialis anterior en de soleus spieren (A). Berekening van de gemiddelde CSA, minimimal en maximale Feret diameters van type I, type IIA, typ IIX en type IIB fivers in zowel de tibialis anteriort en de soleus staan in (B-D). Gegevens worden gegeven zoals bedoel ±SEM. significante verschillen tussen de tibialis anterior en soleus worden aangegeven (* duidt p < 0.05: ** duidt p < 0,01; *** duidt p < 0.005; t-test). 3,052 en 2,876 individuele vezels werden geteld voor de tibialis anterior en de soleus spieren, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental File
Aanvullend bestand: Fiber kwantificering macro. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij hebben hier nuttig richting voor de identificatie van skeletale spiervezel typen verstrekt. Daarbij beschrijven we een nieuw algoritme voor analyse van de gegevens.

Omdat onze resultaten grotendeels die van eerdere verslagen5,-8,10 te bevestigen en onze eigen handmatige metingen weerspiegelen, weergegeven het algoritme nauwkeurig te zijn. Nog steeds, ondervonden we sommige zeldzame experimentele valkuilen, met inbegrip van onduidelijk vezel grenzen die voortvloeien uit het segmenteren van artefact. De impact van deze artefacten kan geminimaliseerd worden door middel van zorgvuldige segmenteren en waakzaam onderzoek van het verwerkte gedeelte vóór de analyse. In het bijzonder kan minder-dan-optimale beeldsegmentatie worden omzeild via meerdere rondes van herindeling op hetzelfde beeld te bereiken scherper contrast.

De meest cruciale stap in ons protocol is stap 4.2 waarin bepalen we de cellulaire en extracellulaire gebieden van de sectie door een streep op een bepaalde vezel, waardoor een "klasse 1" of "klasse 2" gebied onderscheid te maken. Natuurlijk, deze handleiding onderscheid is essentieel, omdat het bepaalt de grenzen van de spiervezels; een fout in deze stap zal nadelige gevolgen hebben voor de beoordeling van de afmetingen van de vezel.

In deze studie peilden we secties voor slechts één MyHC in een bepaalde seriële sectie. Sommige vezels, zoals hybride vezels, express echter twee soorten MyHC, indicatieve overlappende metabole/functionele profielen (bijvoorbeeld, typt u IIX en IIB). Dus, de breuken van fiber-type op een andere waarde opgeteld > 1 voor zowel de soleus en de tibialis anterior (Figuur 4A). Hybride vezels kunnen worden geïdentificeerd met dubbel- of zelfs triple-, etikettering van protocollen zoals die beschreven door Lee et al. 7en Bloemberg en Quadrilatero5, respectievelijk. Nog belangrijker is, kan onze analysemethode worden toegepast op deze kleuring complexere protocollen. Een andere beperking van onze protocol is dat er geen volautomatische; Wij zijn echter van mening dat deze kleine concessie zorgt ervoor dat onze methode strengheid omwille van de snelheid niet ten koste.

Terwijl de MyHC composities van zowel de soleus en de tibialis anterior spieren in deze studie waargenomen rekening gehouden met de resultaten van eerdere studies5,6,7,10,14 , er zijn sommige contrasten met eerdere studies met betrekking tot de beoordeling van de CSA. Bijvoorbeeld, zijn onze metingen van gemiddelde CSA iets kleiner dan die gerapporteerd door ofwel Bloemberg en Quadrilatero5 en Allen et al.. 15 In het bijzonder onze CSA metingen varieerden van 539.86 ± 24.44 µm2 tot 1319.50 ± 57.47 µm2 in verschillende typen vezel terwijl hunne ongeveer 735.7 ± 31.2 µm2 tot 3073.8 ± 51.3 µm2 overspannen. Echter, onze waarden meer lijken op die waargenomen door Augusto et al. 13 en Lucas et al. 6 die gemeld gemiddelde CSAs variërend van 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 en 815 ± 221 µm2 tot 1904 ± 570 µm2, respectievelijk. Aldus, sommige variabiliteit in Morfometrische analyse van muis stuk vezels bestaat in de literatuur.

Immunohistochemistry presenteert een efficiënte manier om te labelen en te classificeren spiervezels op basis van de inhoud van hun MyHC. Nauwkeurige kwantificering van immunohistochemical experimenten is essentieel voor het maken van zinvolle conclusies over de gegevens; te dien einde is een methode die de vervelende delen van analyse kunt automatiseren een nuttig, vooral wanneer honderden of zelfs duizenden, vezels moeten worden gemeten en ingedeeld. Naast het verstrekken van metingen vergelijkbaar met handmatige opmerkingen, biedt ons algoritme een nauwkeurige beoordeling van deze gegevens zonder vooringenomenheid; Dit voordeel ten opzichte van handmatige metingen zorgt voor wetenschappelijke strengheid. In dit verband kan onze methodologie zinvol zijn in de karakterisering van de effecten van genetische en experimentele manipulaties die van invloed zijn spier integriteit. Specifiek, MyHC immunohistochemistry in combinatie met onze methode voor snelle analyse kan worden gebruikt voor de beoordeling van de morfologische en metabole veranderingen in spier ziekte modellen zoals muscular dystrophie, ALS en kanker cachexia. Bovendien kan de effectiviteit van interventies die verhinderen atrofie of hypertrofie veroorzaken ook worden beoordeeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen openbaar te maken.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan de Boettcher-Stichting en de vereniging Amyotrofische laterale sclerose (#17-II-344) voor hun steun aan dit onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418-100G 5% in PBS
Hydrophobic Barrier Pap Pen Scientific Device Laboratory 9804-02
Microscope Slides Globe Scientific 1358W
Coverglass Fisher Scientific 12-544-E
Immumount Thermo Scientific 9990402
Nail Polish L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope Discontinued
SPOT RT/KE SPOT Imaging Solutions RT940
Dell Optiplex
BA-F8 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgG2b; 1:50
SC-71 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monclonal mouse IgG1; 1:50
BF-F3 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgGM; 1:50
6H1 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b Invitrogen A21145 goat anti-mouse; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1 Invitrogen A21121 goat anti-mouse;1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM Invitrogen A21044 goat anti-mouse;1:200
OCT Sakura Finetek 4583
isopentane Fisher Scientific O3551-4 cool with liguid nitrogen
PBS Fisher Bioreagents BP665-1 10x, dilute to 1x
Kim wipes Kimberly-Clark 06-666A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
  3. Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
  4. Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
  5. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  6. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
  7. Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
  8. Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
  9. Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
  10. Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
  11. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
  12. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
  13. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  14. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  15. Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).

Tags

Geneeskunde kwestie 126 skeletspieren type vezel histologie immunohistochemistry myosin zware ketting geautomatiseerde analyse
Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tyagi, S., Beqollari, D., Lee, C.More

Tyagi, S., Beqollari, D., Lee, C. S., Walker, L. A., Bannister, R. A. Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition. J. Vis. Exp. (126), e56024, doi:10.3791/56024 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter