Summary
Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.
Abstract
Jahrelang wurden Unterschiede zwischen skelettartigen Muskel Fasertypen am besten durch Myosin-ATPase Färbung sichtbar gemacht. Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp entwickelt. Typ I, Typ IIA, Typ IIX und Typ IIB Fasern jetzt mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil identifiziert werden können; manuelle Auswertung dieser Daten kann jedoch langsam und unten-rechts langweilig. Schnelle, präzise Bewertung der Fasertyp Zusammensetzung und Morphologie ist in dieser Hinsicht ein sehr wünschenswert Werkzeug. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für State-of-the-Art immunhistochemische Färbung des MyHCs in Gefrierschnitte gewonnenen Maus Megalosauridae Muskel im Konzert mit einem neuartigen semi-automatischen Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie beschleunigt. Wie erwartet, Musculus soleus angezeigt Färbung für Typ I und Typ IIA Fasern, aber nicht für Typ IIX oder Typ IIB Fasern. Auf der anderen Seite der Tibialis anterior-Muskel setzte sich überwiegend aus Typ IIX und Typ IIB Fasern, ein kleiner Bruchteil der Typ IIA Fasern und wenig oder gar keine Typ-I-Fasern. Mehrere Bildtransformationen wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit Karten zum Zwecke der Messung der verschiedenen Aspekte der Faser Morphologie (d.h.Querschnittsfläche (CSA), maximale und minimale Feret Durchmesser) zu generieren. Die Werte für diese Parameter dann mit manuell erhaltenen Werten verglichen wurden. Keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Modi der Analyse im Hinblick auf CSA, maximal- bzw. Minimalwert Feret Durchmesser beobachtet wurden (alle p > 0,05), die Genauigkeit unserer Methode angibt. So kann unser Immunostaining Analyse Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen auf die Muskelmasse Zusammensetzung in vielen Modellen des Alterns und Myopathie angewendet werden.
Introduction
Es hat seit einiger Zeit bekannt, die Skelettmuskulatur aus Einzelfasern von vielen Arten1besteht. Zunächst wurden zwei Gruppen von Fasern anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften charakterisiert und benannt, entsprechend langsam zuckenden (Typ I) und Fast-Twitch (Typ II). Diese Kategorien wurden auf der Grundlage der Faser Stoffwechsel weiter unterschieden. Da Typ-I-Fasern sind reich an Mitochondrien und angewiesen auf oxidativen Stoffwechsel, wurden sie aufgeklärt durch robust positiven Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR) Diaphorase2 oder Succinat Dehydrogenase (SDH)3 Färbung. Im Gegensatz dazu, Typ-II-Fasern weniger ausgestellt und Variablen Grad von NADH-TR Diaphorase oder SDH Färbung und wurden in zwei Fast-Twitch-Untergruppen unterteilt (Typ IIA und IIB Typ) etwas grob anhand ihrer relativen oxidativen Kapazitäten. Diese Unterscheidungen zwischen Fasern haben effektiver durch Myosin-ATPase Färbung visualisiert worden wo Typ I Fasern färben dunkel nach einer Vorinkubation bei pH 4.0 und Typ IIB Fasern absorbieren überstürzten folgende Vorinkubation bei pH 10,0 mit Typ IIA Fasern Färbung immer4.
Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp5entwickelt. Typ I, Typ IIA und Typ IIB Fasern können alle identifiziert werden mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil. Darüber hinaus eine weitere Fast-Twitch-metabolisch-Intermediate Fasertyp, Typ IIX, identifizierten6wurde. Hybrid-Fasern mit dem Ausdruck mehrere MyHC wurden auch bestätigten5,7,8. Einige Arten wie die Katze und der Pavian sind keine ausdrückliche Typ IIB MyHCs6bekannt. Obwohl MyHC Immunostaining derzeit die State-of-the-Art-Beurteilung der Muskel Zusammensetzung ist, ist die Analyse der Daten über diese Technik umständlich und zeitaufwändig ohne automatisierte Unterstützung. Zu diesem Zweck wurden eine Handvoll semi-automatischen Methoden, um diese Daten zu analysieren entwickelten5,9,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein relativ Standardprotokoll für immunhistochemische Identifizierung der Muskelfaser-Typ5,7,8,10, zusammen mit einer teilautomatisierten Roman Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie mit Genauigkeit beschleunigt.
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Protocol
alle Verfahren, die Mäuse wurden von der University of Colorado-Anschutz Medical Campus institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt (91813(05)1D).
1. Tag1: primäre (1°) Immunostaining mit Bovine Serum Albumin (BSA) Blockierung
- an der Luft trocknen Gefrierschnitte Maus Megalosauridae Muskel (z. B. m. Tibialis anterior, Soleus) montiert auf aufgeladene Folien für ~ 30 min 11. zeichnen Sie einen Rahmen um die Abschnitte, die mit einem Stift hydrophobe Barriere PAP.
- Ort ~ 250 µL 5 % BSA/Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (BSA/PBS) auf jeder Folie, unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur für 1 h
- Beim Blocken, bereiten 01:50 Verdünnungen des 1° Antikörpers Überstand in 5 % BSA/PBS (alle Maus monoklonale Antikörper sind; siehe Tabelle 1- 6 ,- 12) 250 µL vorbereiten Lösung pro Folie. ICE 1° Antikörper Aktien und Verdünnungen behalten
Tabelle 1: Primärantikörper verwendet, um zu unterscheiden MyHCs.
- nach Aspiration von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung hinzufügen 250 µL 1° Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Folien. Fügen Sie 250 µL 5 % BSA/PBS, sekundäre (2°) Antikörper nur negative Kontrolle gleitet.
- Inkubation bei 4 ° C für 24-48 h in einer feuchten Umgebung.
Hinweis: Eine Petrischale in Alufolie mit angefeuchtetes Filterpapier bedeckt als eine geeignete Inkubationszeit Kammer dienen können.
2. Tag 2:2 ° Immunostaining mit fluoreszierenden Antikörpern
- Aspirieren 1° Antikörperlösung oder 5 % BSA/PBS Kontrolllösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA.
- Beim Waschen, vorbereiten 1: 200 Verdünnungen der gereinigten, Fluorophor konjugiert 2° Antikörper in 5 % BSA/PBS (siehe Tabelle 2, alle sind Ziege Anti-Maus). Bereiten Sie 250 µL Lösung pro Folie. Halten Sie 2° Fluorophor-konjugierten Antikörpern im Dunkeln auf Ice
Tabelle 2: Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verwendet, um zu visualisieren primären Antikörper Anerkennung von MyHCs.
- nach Aspiration der dritten Anwendung von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung, 250 µL 2° Antikörper Verdünnung auf alle Folien hinzufügen. 90 min bei Raumtemperatur in einem dunklen, feuchten Umgebung inkubieren.
- Aspirat 2° Antikörperlösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA/PBS.
- Spülen mit PBS. Für 10 min. trocken
- Montieren das Deckglas mit eine befristete, niedrigviskose wässrige Eindeckmedium.
- Nach dem Trocknen die Folie Schnittflächen mit Nagellack versiegeln. Trocknen und bewahren Sie in einem dunklen Slidebox.
3. Folien mit Epifluoreszenz Microscopy Imaging
- reinigen Sie die Folien mit einem kleinen, 70 % Ethanol getränkten Lab-abwischen.
- Erhalten digitale Bilder von Immunostained Muskel Abschnitte mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem fotografischen Apparat (siehe die Tabelle der Materialien) ausgestattet.
- Wählen Sie einen Bereich von ungefähr 1 mm 2 (10 X Objektiv, 1,4 NA).
- Ansicht Alexa 488 konjugiert 2° Antikörper Fluoreszenz über eine 505 nm lang-Pass-Filter. Anzeigen der Fluoreszenz durch Anregung von Alexa 594 konjugiert 2° Antikörper über einen 595 nm lang-Pass-Filter erzeugt. Digitalisieren von Bildern mit einem PC-Computer mit einem kompatiblen imaging-Software ausgestattet. Gehören die Maßstabsleiste von imaging-Software für die spätere Analyse.
4. Analyse von Bildern mit Fidschi
Hinweis: bevor Sie mit der Analyse, Fidschi (frei von den National Institutes of Health, Bethesda, MD erhältlich) über https://imagej.net/Fiji/Downloads installiert werden muss. Auch, wird das Makro in diesem Prozess verwendet in der Ergänzenden Datei bereitgestellt. Legen Sie die Makrodatei in einem leicht zugänglichen Verzeichnis.
- Last ein Hellfeld Bild eines ausgewählten Bereichs in Fidschi. Navigieren Sie zu Plugins → Segmentierung → trainierbar Weka Segmentierung.
- Um die zelluläre Bereiche des Abschnitts, vorschreiben zeichnen Sie eine Linie auf einer Faser, und klicken Sie auf " Klasse 1 hinzufügen ". Dann zeichnen Sie eine Linie auf den Raum zwischen den Fasern, und klicken Sie auf " Klasse 2 hinzufügen " anlässlich der extrazellulären Domänen. Wiederholen Sie, bis in jeder Klasse gibt es 5-10 Etiketten.
- Klick Zug Sichter. Auf die daraus resultierenden roten und grünen Overlay mehr Beschriftungen manuell hinzufügen (siehe Punkt 4.2), nicht falsch segmentierte Stücke des Bildes, wenn nötig. Wiederholen Sie, bis die Fasern (rot) aus dem Raum zwischen den Fasern (grün) entsprechend getrennt werden.
- Klicken Sie " erhalten Wahrscheinlichkeit " und speichern Sie das Bild in einem neu beschrifteten Ordner.
- Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritte 4.2 4.3) mit dem fluoreszierenden Bild vom gleichen Feld übernommen. Beschriften Immunostained Fasern als " Klasse 1 " und alle nicht-fluoreszierende Regionen als " Klasse 2 ". Speichern Sie die resultierende Wahrscheinlichkeit Karte im selben Ordner wo das verarbeitete Hellfeld-Bild gespeichert.
- Öffnen Sie eine der zuvor gespeicherten Wahrscheinlichkeit Karten in Fidschi. Zeichnen einer geraden Linie auf der Skala von der imaging-Software zur Verfügung gestellt. Gehe zu analysieren → Maßstab festlegen. Ändern Sie die Parameter (d.h., bekannten Abstand und Einheit der Länge) auf ihre entsprechenden Werte als von der Maßstabsleiste gegeben, dann überprüfen Sie die " Global " Feld, um den Maßstab für jedes Bild zu standardisieren.
- Navigieren zu Plugins → Makros → laufen → Tyagi Et Al. Faser Quantifizierung macro.ijm (siehe die Zusätzliche Datei). Sofort erscheint ein Navigationsbereich. Öffnen Sie das Bild ' s Host Ordner; ein Dialogfeld wird angezeigt. Für jedes Dialogfeld ändern Sie die " Hintergrund " Dropdown-Wert zu " Licht. "
Hinweis: der Ordner wird nun mit Bildern der Faser Umrisse und Tabellenkalkulationsdateien Software der Ergebnisse (CSA und Feret Durchmesser sind am relevantesten, gefüllt Quantifizierung der Faser Morphologie; gemessenen Parameter gesetzt Messungen analysieren einstellbar). Faser Morphologie Daten generiert durch die Pore-Analysefunktion von Fidschi Tabellenkalkulation Software-Dateien für beide Leuchtstoff- und hellen Bereich Bilder automatisch übertragen werden. - Berechnet den Anteil der Fasern mit dem Ausdruck einer bestimmten MyHC in einem Feld dividiert die Anzahl der Fluoreszierende Fasern im Feld durch die Anzahl der insgesamt Fasern in das entsprechende Hellfeld Bild.
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Representative Results
Megalosauridae Muskeln (d.h., m. Tibialis anterior und Soleus) von einer männlichen C57BL/6-Maus des unbekannten Alters seziert wurden Flash-durch das Versenken eines Kunststoff-Formenbau, enthalten die Muskeln im OAT Verbindung in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane eingefroren. Dann, mit einem Cryotome, 8-10 µm Schnittserien wurden schneiden bei-20 ° C und anderen positiv geladenen Glas-Folien-12übertragen.
Wir wählten Tibialis anterior und Soleus, weil diese Muskeln überwiegend von Fast und slow-Twitch-Fasern, beziehungsweise13,14zusammengesetzt sind. Nach der immunhistochemischen Färbung für individuelle Typ I, IIA, IIX und IIB MyHCs waren Hellfeld und Leuchtstoffröhren Bilder eingefangen. Die linken Panels der Abbildung 1 zeigen Querschnitte von einer Soleus Muskel Immunostained mit dem Typ I, IIA, IIX und IIB MyHC-spezifische Antikörper in Tabelle 1aufgeführt.
Abbildung 1 : Immunhistochemische Färbung von MyHC Typ I, IIA, IIB in Maus Soleus Muskel und IIX. Linken Tafeln zeigen fluoreszierende Bilder von Abschnitten eines Maus Soleus Muskels sondiert mit primären Antikörper, Typ I (BA-F8; ( A), Typ IIA (SC-71; ( B), Typ IIX (6 H 1; ( C) und Typ IIB (BF-F3; ( D) MyHCs. Richtige Tafeln zeigen die Abschnitte, in denen die primäre Antikörper in das Experiment in der entsprechenden linken dargestellt verwendet weggelassen wurde. Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Speziell, beobachteten wir erhebliche Brüche der Fasern mit dem Ausdruck Typ I (Abbildung 1A, links) und Typ IIA MyHCs (Abbildung 1B, links) mit einer angemessenen Menge der verbleibenden Fasern anzeigen positive Färbung für Typ IIX MyHCs (Abbildung 1C, links). Im Gegensatz dazu waren praktisch keine Typ-IIB-Fasern deutlich (Abbildung 1D, links). Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit früheren Berichten, die Soleus Muskeln sind meist bestehend aus Typ I, Typ IIA und Typ IIX-Fasern (so) mit fast keinen Typ IIB Fasern5,10,12. Wichtig ist, keine Flecken in den Abschnitten beobachtet der primäre Antikörper aus dem Protokoll, Nachweis der Spezifität der Antikörper (Abbildung 1A-D, richtigen Platten) weggelassen hatte.
Abbildung 2 : Immunhistochemische Färbung von MyHC IIB, IIX, IIA und ich Maus Tibialis anterior Muskel geben. Linken Tafeln zeigen fluoreszierende Bilder von Abschnitten eines Maus-Tibialis anterior Muskels sondiert mit primären Antikörper, Typ IIB (A), Typ IIX (B), Typ IIA (C) und Typ I (D) MyHCs. Richtige Tafeln zeigen die Abschnitte, in denen die primäre Antikörper in das Experiment in der benachbarten linken dargestellt verwendet weggelassen wurde. Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Wir gebeizt auch Tibialis anterior Muskeln mit den oben genannten Antikörper. M. Tibialis anteriore Muskeln bestanden meist aus Typ IIB und Typ IIX MyHC-positiven Fasern (Abbildung 2A-B, links Platten) mit kleineren Beiträgen von Fasern mit dem Ausdruck Typ IIA MyHCs (Abbildung 2C, links); praktisch keine Fasern mit dem Ausdruck Typ ich MyHC beobachtet (Abb. 2D, links). Unsere Daten, die darauf hinweist, dass die Maus Tibialis anterior überwiegend aus schnell zuckenden Typ IIA besteht, IIB geben und Typ IIX-Fasern stehen im Einklang mit früheren Studien5,10,13. Wieder wurde keine Flecken in den Abschnitten beobachtet der primäre Antikörper aus dem Protokoll (Abbildung 2A-D, richtigen Platten) weggelassen hatte.
Abbildung 3 : Iterierten EDV Faser Segmentierung. Hellfeld-Bild von einer Maus Tibialis anterior Abschnitt (A). Transformation des gleichen Bildes mit unseren semi-automatischen Algorithmus (B). Fluoreszierende Bild des gleichen Abschnitts zeigt Immunostaining vom Typ IIA MyHC (C). Transformation-Bild zeigt nur Typ IIA MyHC exprimierenden Fasern (D). Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Für die Zwecke der morphometrische Analyse wurden Hellfeld-Bilder der Immunostained Felder auch erhalten. Das Beispiel in Abbildung 3 ist aus einem Tibialis anterior Muskel Abschnitt sondiert mit SC-71 Antikörper IIA MyHCs13eingeben. Mit Hilfe unserer ursprünglichen semi-automatischen Algorithmus, wurden mehrere Bildtransformationen zur Wahrscheinlichkeit Karten aus dem Hellfeld-Bilder zu generieren. Eine typische Bildtransformation abgeleitet aus dem Hellfeld-Bild in Abbildung 3 dargestellt ist in Abbildung 3Bdargestellt. Mit der Transformation und die Pore-Analyse-Funktion der Fidschi-Inseln, haben wir die mittlere CSA (891.4 ± 45,0 µm2), Maximum (46,9 ± 1,3 µm) und minimale (26,0 ± 0,8 µm) mittlere Feret Durchmesser jede Faser im Bereich gemessen. Um die Treue unserer Messungen zu testen, beurteilen wir auch diese Parameter im Hellfeld Bild manuell. Mittlere CSA (867.0 ± 52,0 µm2), Maximum (45,7 ± 3,5 µm) und Minimum (25,6 ± 1,9 µm) meine Feret Durchmessern unter Verwendung der mehr mühsame manuelle Erwerbsmethode waren nicht signifikant verschieden von der semi-automatischen Methode (alle p > 0,05, ungepaarten t-tests; ( Tabelle 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tabelle 3: Fiber Morphologie und Zusammensetzung des m. Tibialis anterior Muskel Immunostained für Typ I, IIA, IIB und IIX MyHCs wie durch manuelle und halbautomatische analytische Methoden ermittelt. Meine Faser CSA, meine Feret Durchmessern und MyHC geben eine Maus Tibialis anterior über traditionelle manuelle Auswertung im Vergleich zu den vorgestellten Algorithmus quantifiziert. Bitte beachten Sie, dass kombinierte Brüche übersteigen den Wert 1 durch die Anwesenheit von Fasern, die mehr als eine MyHC Art zum Ausdruck zu bringen.
Abbildung 3 C zeigt eine fluoreszierende Bild das gleiche Feld Immunostained mit Antikörpern IIA MyHCs eingeben. Positiv-gefärbten Fasern im Feld wurden von Nummer (Abbildung 3D) ausgewählt und verwendet, um den Bruchteil der Typ IIA MyHC exprimierenden Fasern bestimmen dividiert durch die Gesamtzahl der Fasern im Feld Hellfeld Transformation (Tabelle 3 ). Die durchschnittliche CSA, maximal- und Minimalwerte Feret Durchmesser Typ IIA Fasern dann wurden bewertet (Tabelle 3). Der Anteil der Typ ich, Typ IIX und Typ IIB Fasern, sowie ihre Abmessungen, waren bestimmt durch die Wiederholung dieses Protokolls in Schnittserien Immunostained mit BA-F8, 6H 1 und BF-F3 Antikörper bzw.6,12(Tabelle 4 ; Abbildung 4 A-D).
Tabelle 4: MyHC Inhalt und Morphologie in Maus Soleus und m. Tibialis anterior. Faser Art Kompositionen von repräsentativen Abschnitte der Soleus und m. Tibialis anterior. Quantifizierung der durchschnittliche CSA, minimale und maximale Feret-Durchmessern von Typ I, Typ IIA, IIX geben und Typ IIB in den Soleus und m. Tibialis anterior gezeigt. Daten werden als mittlere ±SEM gegeben.
Wir bewerten auch diese Parameter in einem Feld gewonnenen Musculus soleus (Tabelle 4; Abbildung 4 A-D). 3.052 und 2.876 Einzelfasern zählten für die Tibialis anterior und Soleus Muskeln. Zusammengenommen zeigen diese Daten die Machbarkeit unserer Methode in Faser-Typ und morphometrische Analyse.
Abbildung 4 : Morphometrische Analyse Datenzusammenfassung. Fasertyp Kompositionen von repräsentativen Abschnitte des m. Tibialis anterior und Soleus Muskeln (A). Quantifizierung des Durchschnitts CSA, Minimimal und maximaler Feret Durchmessern von Typ I, Typ IIA, IIX Typ und Typ IIB Fivers in den Tibialis Anteriort und Soleus (B-D) dargestellt. Daten sind gegeben, wie meine ±SEM. signifikante Unterschiede zwischen den m. Tibialis anterior und Soleus angegeben (* kennzeichnet p < 0,05: ** bezeichnet p < 0,01; *** bezeichnet p < 0,005; t-Test). 3.052 und 2.876 Einzelfasern zählten für die Tibialis anterior und Soleus Muskeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei: Fiber Quantifizierung Makro. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Hier haben wir nützliche Richtung für die Identifizierung des skelettartigen Muskels Fasertypen bereitgestellt. Dabei beschreiben wir einen neuartigen Algorithmus zur Analyse der Daten.
Da unsere Ergebnisse frühere Berichte5,8,10 bestätigen weitgehend und spiegeln unsere eigenen manuellen Messungen, erscheint der Algorithmus um genau zu sein. Allerdings stießen wir auf einige seltene experimentelle Fallstricke einschließlich unklar Faser Grenzen aus Artefakt-Schnitt. Die Auswirkungen dieser Artefakte kann durch Schneiden Sie vorsichtig und wachsam Prüfung der verarbeiteten Abschnitt vor der Analyse minimiert werden. Insbesondere kann weniger als optimale Bild Segmentierung durch mehrfache Umläufe der Umgliederung auf dem gleichen Bild zu schärferen Kontrast zu erzielen umgangen werden.
Der wichtigste Schritt in unserem Protokoll ist Schritt 4.2 in dem wir die zellulären und extrazellulären Bereichen des Abschnitts festlegen durch Ziehen einer Linie auf eine bestimmte Faser, dadurch zu unterscheiden, eine "Klasse 1" oder "Klasse 2" Bereich. Offensichtlich ist diese manuelle Unterscheidung kritisch, denn sie die Grenzen der Muskelfasern bestimmt; ein Fehler in diesem Schritt wird die Bewertung der Faser Dimensionen beeinträchtigen.
In dieser Studie untersucht wir Abschnitte für nur eine MyHC in einem bestimmten seriellen Abschnitt. Allerdings äußern einige Fasern, wie Hybrid-Fasern, zwei Arten von MyHC, bezeichnend für überlappende metabolic/funktionelle Profile (z. B.Typ IIX und Typ IIB). So, die Fraktionen der Fasertyp zusammengefasst um einen Wert > 1 für den Soleus und m. Tibialis anterior (Abb. 4A). Hybrid-Fasern können mit Doppel- oder sogar dreifach-, Kennzeichnung Protokolle wie Lee Et Al. beschrieben identifiziert werden 7und Bloemberg und Quadrilatero5, beziehungsweise. Wichtig ist, kann unsere Methode der Analyse auf diese komplexere Färbung Protokolle angewendet werden. Eine weitere Einschränkung unserer Protokoll ist, dass es nicht vollautomatisch; Wir glauben jedoch, dass dieses kleine Zugeständnis sorgt dafür, dass unsere Methode strenge aus Gründen der Geschwindigkeit nicht beeinträchtigt.
Während die MyHC Zusammensetzungen der Soleus und m. Tibialis anterior Muskeln in dieser Studie beobachtet spiegeln Sie die Ergebnisse der bisherigen Studien5,6,7,10,14 , es gibt einige Gegensätze mit früheren Studien über die Beurteilung der CSA. Zum Beispiel sind unsere Messungen der durchschnittliche CSA etwas kleiner als die von entweder Bloemberg und Quadrilatero5 und Allen Et al.berichtet. 15 insbesondere reichten unsere CSA-Messungen von 539.86 ± 24.44 µm2 1319.50 ± 57.47 µm2 über Fasertypen während Ihnen ungefähr 735.7 ± 31,2 µm2 3073.8 ± 51,3 µm2überspannt. Jedoch ähneln unsere Werte genauer beobachtet von Augusto Et al. 13 und Lucas Et al. 6 , die durchschnittliche CSAs reichen von 436 ± 605 µm2 2404 ± 412.5 µm2 und 815 ± 221 µm2 bis 1904 ± 570 µm2, bzw. gemeldet. So gibt es gewisse Variabilität in morphometrische Analyse der Maus Megalosauridae Fasern in der Literatur.
Immunohistochemistry stellt eine effiziente Möglichkeit, beschriften und Muskelfasern auf der Grundlage ihrer MyHC Inhalte zu klassifizieren. Genaue Quantifizierung der immunhistochemischen Experimente ist wichtig, dass sinnvolle Rückschlüsse auf die Daten; zu diesem Zweck ist eine Methode, die die langweiligen Teile der Analyse zu automatisieren, kann ein nützliches, besonders wenn Hunderte oder sogar Tausende von Fasern müssen gemessen und klassifiziert werden. Neben Messungen ähnlich wie manuelle Beobachtungen bietet unser Algorithmus eine genaue Beurteilung dieser Daten ohne Vorurteile; dieser Vorteil gegenüber manuellen Messungen gewährleistet Wissenschaftlichkeit. In diesem Zusammenhang sein unsere Methodik in die Charakterisierung der Auswirkungen der genetischen und experimentelle Manipulationen nützlich, die Integrität der Muskel auswirken. Insbesondere kann MyHC Immunohistochemistry gepaart mit unserer Methode der schnellen Analyse eingesetzt werden, um morphologische und metabolische Veränderungen im Muskel Krankheitsmodelle wie Muskeldystrophien, bewerten ALS und Krebs Kachexie. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit von Interventionen die Atrophie verhindern oder Hypertrophie verursachen auch bewertet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Wir sind dankbar die Boettcher-Stiftung und die Amyotrophe Lateralsklerose Association (#17-II-344) für ihre Unterstützung dieser Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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