Summary
La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.
Abstract
Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p > 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.
Introduction
Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi1. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi2 o succinato deidrogenasi (SDH)3 la macchiatura. Al contrario, fibre di tipo II hanno esibito minore e gradi variabili di NADH-TR diaforasi o SDH macchiatura e sono stati divisi in due sottogruppi di contrazione rapida (tipo IIA e tipo IIB) un po' rozzamente basato sulle loro capacità ossidativa relativa. Queste distinzioni tra le fibre hanno state visualizzate in modo più efficace di miosina-ATPasi-miosinica dove tipo I fibre macchia scure dopo una pre-incubazione a pH 4.0 e fibre di tipo IIB assorbono precipitato seguenti pre-incubazione a pH 10.0 con le fibre di tipo IIA la macchiatura intermedio4.
Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più fine di fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibre possono essere tutti identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC. Inoltre, un altro tipo di contrazione rapida metabolicamente intermedio-fibra, tipo IIX, è stato identificato6. Fibre ibride che esprimono più MyHC inoltre sono stati confermati5,7,8. Alcune specie come il gatto e il babbuino non sono noti a rapidi tipo IIB MyHCs6. Se MyHC immunostaining è attualmente la valutazione dello stato-of-the-art della composizione del muscolo, l'analisi dei dati ottenuti tramite questa tecnica è ingombrante e richiede molto tempo senza assistenza automatizzata. A tal fine, una manciata di metodi semi-automatici per analizzare questi dati sono stati sviluppati5,9,10. Qui, presentiamo un protocollo relativamente standard per l'identificazione immunohistochemical di fibra muscolare-tipo5,7,8,10, insieme a un romanzo semi-automatizzato algoritmo che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra con precisione.
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Protocol
tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).
1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco
- asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min 11. disegnare un bordo intorno alle sezioni utilizzando una penna PAP barriera idrofoba.
- Posto ~ 250 µ l di 5% BSA/tampone fosfato salino (BSA/PBS) su ogni diapositiva per bloccare il legame non specifico anticorpo. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h.
- Mentre il blocco, 01:50 di preparare diluizioni dell'anticorpo 1 ° surnatante nel 5% BSA/PBS (tutti sono anticorpi monoclonali di topo; cfr. tabella 1 6 , 12); preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Mantenere 1° anticorpo scorte e diluizioni su Ice.
tabella 1: anticorpi primari utilizzati per distinguere MyHCs.
- a seguito di aspirazione della soluzione blocco 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 1° alle diapositive appropriate. Aggiungere 250 µ l di 5% BSA/PBS al controllo di negativo solo anticorpo secondario (2°) scivola.
- Incubare a 4 ° C per 24-48 h in un ambiente umido.
Nota: Una capsula di Petri rivestito in alluminio con filtro di carta inumidito può servire come una camera di incubazione adatto.
2. Giorno 2:2 ° Immunostaining con anticorpi fluorescenti
- aspirare la soluzione di anticorpo di 1° o 5% BSA/PBS soluzione di controllo. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA.
- Durante il lavaggio, preparare diluizioni 1: 200 degli anticorpi purificati, coniugati fluoroforo 2 ° nel 5% BSA/PBS (Vedi tabella 2, sono tutti anti-topo di capra). Preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Tenere all'oscuro su Ice. anticorpi coniugati fluoroforo a 2°
tabella 2: anticorpi secondari coniugati fluoroforo utilizzato per visualizzare primario riconoscimento dell'anticorpo di MyHCs.
- a seguito di aspirazione della terza applicazione di soluzione bloccante di 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 2° a tutte le diapositive. Incubare per 90 min a temperatura ambiente in un ambiente buio, umido.
- Soluzione di anticorpo 2° aspirato. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA/PBS.
- Risciacquare con PBS. Secco per 10 min.
- Montare il coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso non permanente, bassa viscosità.
- Quando asciutto, sigillare i bordi di diapositiva con smalto. Asciugare e conservare in un contenitore scuro.
3. Diapositive con epifluorescenza di imaging
- pulire i vetrini con un piccolo, 70% imbevuto di etanolo lab-wipe.
- Ottenere immagini digitali di sezioni di muscolo immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un apparecchio fotografico (Vedi la Tabella materiali).
- Selezionare un'area di circa 1 mm 2 (obiettivo 10x, NA 1,4). Filtro passa-lungo di
- Vedi fluorescenza degli anticorpi coniugati Alexa 488 2° tramite un 505 nm. Mostra la fluorescenza generata da eccitazione degli anticorpi coniugati Alexa 594 2° tramite un filtro di passa-lungo 595 nm. Digitalizzare immagini con un computer PC equipaggiato con un software di imaging compatibile. Includere la barra della scala da imaging software per analisi successive.
4. Analisi delle immagini con Fiji
Nota: prima di procedere con l'analisi, Fiji (disponibile gratuitamente dal National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve essere installato tramite https://imagej.net/Fiji/Downloads. Inoltre, la macro utilizzata in questo processo è fornita nel File supplementare. Inserire il file di macro in una directory accessibile.
- Carico un campo chiaro l'immagine di una sezione selezionata in Fiji. Passare al plugin → segmentazione → segmentazione Weka Trainable.
- Al fine di stabilire le zone cellulari della sezione, tracciare una linea su una fibra e fare clic " aggiungere alla classe 1 ". Quindi, tracciare una linea sullo spazio tra le fibre e fare clic " aggiungere alla classe 2 " per contrassegnare i domini extracellulari. Ripetere fino a quando ci sono 5-10 etichette in ogni classe.
- Clic treno classificatore. La sovrapposizione risultante di rosso e verde, aggiungere altre etichette manualmente (Vedi punto 4.2) a pezzi in modo non corretto segmentate dell'immagine, se necessario. Ripetere fino a fibre (rosso) in modo appropriato sono separati dallo spazio tra le fibre (verde).
- Clic " probabilità di ottenere " e salvare l'immagine in una cartella nuova con etichetta.
- Ripetere la procedura di cui sopra (punti 4.2-4.3) con l'immagine fluorescente prelevato dallo stesso campo. Etichetta immunostained fibre come " classe 1 " e tutte le regioni non fluorescenti come " classe 2 ". Salvare la mappa di probabilità risultante nella stessa cartella in cui è memorizzata l'immagine trasformati brightfield.
- Aprire una delle mappe di probabilità precedentemente salvato in Fiji. Disegnare una linea retta nella barra della scala fornita dal software di imaging. Vai a analizzare → impostare scala. Modificare i parametri (cioè, distanza nota, unità di lunghezza) al loro valori appropriati come dato dalla barra della scala, quindi controllare il " Global " casella per standardizzare la scala per ogni immagine.
- Passa al plugin → macro → eseguire → Tyagi et al fibra quantificazione macro.ijm (vedere il File supplementare). Immediatamente, verrà visualizzato un riquadro di navigazione. Aprire l'immagine ' cartella host s; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Per ogni finestra di dialogo, modificare il " sfondo " a discesa valore per " luce. "
Nota: la cartella ora verrà popolata con immagini dei contorni della fibra e file di software di calcolo dei risultati (CSA e Feret diametro sono più pertinenti allo quantificare la morfologia delle fibre; parametri misurati possono essere regolati in analizzare impostare misure). Dati di morfologia fibra generati dalla funzione di poro-analisi di Fiji saranno trasferiti automaticamente ai file di software di foglio di calcolo per entrambe le immagini fluorescenti e luminose campo. - Calcolare la frazione di fibre che esprime un determinato MyHC in un campo dividendo il numero di fibre fluorescenti nel campo per il numero di fibre totale nell'immagine corrispondente campo luminoso.
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Representative Results
Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive12sezioni di serie di 8-10 µm.
Abbiamo scelto il tibiale anteriore e soleo perché questi muscoli sono composti principalmente di fibre a contrazione rapida e lenta, rispettivamente13,14. A seguito di immunoistochimica per singolo tipo I, IIA, IIX e IIB MyHCs, campo chiaro e fluorescenti immagini sono state catturate. I pannelli a sinistra della Figura 1 Visualizza sezioni di un immunostained muscolo soleo con il tipo I, IIA, IIX e IIB MyHC specifici anticorpi elencati nella tabella 1.
Figura 1 : La macchiatura di Immunohistochemical di MyHC tipo I, IIA, IIX e IIB nel muscolo soleo mouse. Pannelli a sinistra Visualizza immagini fluorescenti ottenute da sezioni di un muscolo soleo del mouse sondato con gli anticorpi primari diretti di tipo I (BA-F8; A), tipo IIA (SC-71; B), digitare IIX (6h 1; C) e tipo IIB (BF-F3; D) MyHCs. Pannelli di destra Visualizza le sezioni in cui è stato omesso l'anticorpo primario utilizzato nell'esperimento raffigurato nel pannello di sinistra corrispondente. Bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In particolare, abbiamo osservato notevoli frazioni delle fibre di tipo I (Figura 1A, sinistra) e tipo IIA MyHCs (Figura 1B, sinistra) con una discreta quantità di fibre rimanenti visualizzati da macchiatura positiva per tipo IIX MyHCs (Figura 1C, sinistra). Al contrario, praticamente fibre di tipo IIB non erano evidenti (Figura 1D, sinistra). Queste osservazioni sono coerenti con i rapporti precedenti che muscoli soleo sono composti principalmente di tipo I, tipo IIA e tipo IIX fibre (meno così) con quasi nessun tipo IIB fibre5,10,12. D'importanza, nessuna macchiatura è stata osservata nelle sezioni in cui l'anticorpo primario era stato omesso dal protocollo, dimostrando la specificità degli anticorpi (Figura 1A-D, pannelli di destra).
Figura 2 : La macchiatura di Immunohistochemical di MyHC tipo IIB, IIX, IIA e io nel muscolo anteriore di tibialis mouse. Pannelli a sinistra Visualizza immagini fluorescenti ottenute da sezioni di un muscolo anteriore di tibialis mouse sondato con gli anticorpi primari diretti di tipo IIB (A), digitare IIX (B), tipo IIA (C) e (D) MyHCs di tipo I. Pannelli di destra Visualizza le sezioni in cui è stato omesso l'anticorpo primario utilizzato nell'esperimento raffigurato nel pannello di sinistra adiacente. Bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo anche macchiato tibialis muscoli anteriori con gli anticorpi di cui sopra. Tibialis muscoli anteriori sono stati composti principalmente di fibre di tipo IIB e tipo IIX MyHC-positive (Figura 2A-B, pannelli a sinistra) con i più piccoli contributi da fibre di tipo IIA MyHCs (Figura 2C, sinistra); praticamente nessun fibre esprimendo tipo ho MyHC fossi osservato (Figura 2D, sinistra). I nostri dati che indicano che il mouse tibiale anteriore è composto principalmente di contrazione veloce tipo IIA, tipo IIB e fibre di tipo IIX sono coerente con precedenti studi5,10,13. Ancora una volta, nessuna macchiatura è stata osservata nelle sezioni in cui l'anticorpo primario era stato omesso dal protocollo (Figura 2A-D, pannelli di destra).
Figura 3 : Fibra computerizzato iterati segmentazione. Campo chiaro l'immagine di una sezione anteriore di tibialis mouse (A). Trasformazione della stessa immagine usando il nostro algoritmo semi-automatizzato (B). Immagine fluorescente della stessa sezione risultati immunostaining del tipo MyHC IIA (C). Immagine di trasformazione Mostra unico tipo MyHC IIA-esprimendo fibre (D). Bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ai fini dell'analisi morfometrica, campo chiaro immagini dei campi immunostained inoltre sono stati ottenuti. L'esempio mostrato in Figura 3A è da una sezione di muscolo anteriore di tibialis sondata con SC-71 anticorpi diretti verso tipo IIA MyHCs13. Utilizzando il nostro algoritmo originale semi-automatizzato, parecchie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità dalle immagini campo chiaro. Una trasformazione tipica immagine derivata dall'immagine brightfield mostrato in Figura 3A è presentata nella Figura 3B. Utilizzando la trasformazione e la funzione di analisi di poro delle Figi, abbiamo misurato il CSA medio (± 891.4 45.0 µm2), massimo (46,9 ± 1.3 µm) e minimo (26.0 ± 0,8 µm) media Feret diametri di ogni fibra nel campo. Per verificare la fedeltà delle nostre misurazioni, inoltre abbiamo valutato questi parametri nell'immagine brightfield manualmente. Il cattivo CSA (867.0 ± 52,0 µm2), massimo (45,7 ± 3.5 µm) e minimo (25,6 ± 1,9 µm) significa Feret diametri ottenuti utilizzando il metodo di acquisizione manuale più noioso non erano significativamente differenti dal metodo semi-automatico (tutti p > spaiato 0,05, t-test; Tabella 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tabella 3: fibra morfologia e composizione di immunostained muscolo anteriore di tibialis per tipo I, IIA, IIB e IIX MyHCs come determinato da metodi analitici manuali e semiautomatici. Dire fibra CSA, dire Feret diametri e tipo MyHC, in un mouse tibiale anteriore, quantificati tramite valutazione tradizionale manuale contro l'algoritmo presentato. Siete pregati di notare che combinate frazioni superino un valore di 1 per la presenza di fibre che esprimono più tipi MyHC.
Figura 3 C Mostra un'immagine fluorescente della stessa campo immunostained con gli anticorpi diretti verso tipo IIA MyHCs. Fibre marcate positivamente nel campo sono stati selezionati dal numero (Figura 3D) e serve a determinare la frazione delle fibre di tipo IIA MyHC-esprimendo dividendo per il numero totale di fibre nel campo di trasformazione campo chiaro (tabella 3 ). La media CSA, massimo e minimo Feret diametri delle fibre di tipo IIA sono stati poi valutati (tabella 3). La proporzione di tipo I, fibre di tipo IIX e tipo IIB, così come le loro dimensioni, sono stati determinati ripetendo questo protocollo in sezioni seriali immunostained con BA-F8, 6h 1 e BF-F3 anticorpi, rispettivamente6,12(tabella 4 ; Figura 4 A-D).
Tabella 4: MyHC contenuto e morfologia in mouse soleo e tibiale anteriore. Composizioni di tipo fibra di sezioni rappresentative del soleo e tibiale anteriore. Quantificazione del CSA media, massimi e minimi Feret diametri di tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB nel soleo e tibiale anteriore sono mostrati. Dati sono riportati come valori medi.
Abbiamo anche valutato questi parametri in un campo ottenuti dal muscolo soleo (tabella 4; Figura 4 A-D). 3.052 e 2.876 singole fibre sono stati contati per il tibiale anteriore e muscoli soleo, rispettivamente. Presi insieme, questi dati dimostrano la fattibilità del nostro metodo in analisi morfometrica e tipo di fibra.
Figura 4 : Dati di analisi morfometrica riepilogo. Composizioni di fibra-tipo di sezioni rappresentative del tibiale anteriore e muscoli soleo (A). Quantificazione della media CSA, assicurando e massima Feret diametri di tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB fivers in entrambe le anteriort tibialis e soleo sono mostrati in (B-D). I dati sono dati come dire valori. differenze significative tra il tibiale anteriore e soleo sono indicati (* denota p < 0,05: * * denota p < 0,01; * * * denota p < 0,005; t-test). 3.052 e 2.876 singole fibre sono stati contati per il tibiale anteriore e muscoli soleo, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare: macro di quantificazione di fibra. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.
Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infrequenti inclusi i bordi poco chiaro fibra risultanti dal sezionamento artefatto. L'impatto di questi elementi può essere minimizzato attraverso sezionamento attenta e vigile esame della sezione trasformati prima dell'analisi. In particolare, less-than-ottimali segmentazione di immagini può essere aggirato attraverso più cicli di riclassificazione sulla stessa immagine per ottenere il contrasto più nitido.
La fase più cruciale nel nostro protocollo è passo 4.2 in cui si prevedono le zone cellulari ed extracellulari della sezione tracciando una linea su una determinata fibra, distinguendo quindi una "classe 1" o "classe 2". Ovviamente, questa distinzione manuale è fondamentale perché determina i confini delle fibre muscolari; un errore in questo passaggio influirà negativamente la valutazione delle dimensioni della fibra.
In questo studio, abbiamo sondato sezioni per sola MyHC in una determinata sezione seriale. Tuttavia, alcune fibre, quali le fibre ibride, esprimono due tipi di MyHC, indicativo di sovrapposizione profili metabolici/funzionali (ad es., tipo IIX e tipo IIB). Così, le frazioni di fibra-tipo sommato a un valore > 1 per il soleo e tibiale anteriore (Figura 4A). Fibre ibride possono essere identificati con doppio- o addirittura triple-, etichettatura protocolli come quelli descritti da Lee et al. 7e Bloemberg e Quadrilatero5, rispettivamente. D'importanza, il nostro metodo di analisi può essere applicato a questi protocolli di colorazione più complessi. Un'altra limitazione del nostro protocollo è che non è completamente automatico; Tuttavia, crediamo che questa concessione minore assicura che il nostro metodo non comprometta rigore per motivi di velocità.
Mentre le composizioni MyHC di muscoli anteriori sia soleo e tibiale, osservati in questo studio riflettono i risultati di precedenti studi5,6,7,10,14 , ci sono alcuni contrasti con precedenti studi per quanto riguarda la valutazione del CSA. Ad esempio, le nostre misurazioni di CSA medio sono un po ' più piccoli di quelli segnalati da Bloemberg e Quadrilatero5 e da Allen et al. 15 In particolare, le nostre misurazioni di CSA ha variato da 539.86 ± 24.44 µm2 1319.50 ± 57,472 µm attraverso tipi della fibra mentre loro ha misurato circa 735.7 ± 31,2 µm2 3073.8 ± 51,32µm. Tuttavia, i nostri valori più strettamente si assomigliano a quelli osservati da Augusto et al. 13 e Lucas et al. 6 , che ha riferito CSAs medio che vanno da 436 ± 605 µm2 a 2404 ± 412.5 µm2 e 815 ± 221 µm2 a 1904 ± 570 µm2, rispettivamente. Così, alcuni variabilità nell'analisi morfometrica delle fibre hindlimb del mouse esiste attraverso la letteratura.
Immunohistochemistry presenta un modo efficiente per etichettare e classificare le fibre muscolari in base al loro contenuto MyHC. Quantificazione accurata degli esperimenti di immunoistochimica è essenziale per rendere significative conclusioni sui dati; a tal fine, un metodo che può automatizzare le parti noiose di analisi è una utile, soprattutto quando centinaia o addirittura migliaia di fibre deve essere misurati e classificati. Oltre a fornire misure simili alle osservazioni manuale, il nostro algoritmo fornisce una valutazione accurata di questi dati senza pregiudizi; Questo vantaggio sopra misurazioni manuali assicura rigore scientifico. A questo proposito, la nostra metodologia può essere utile nella caratterizzazione degli effetti delle manipolazioni genetiche e sperimentali che hanno un impatto l'integrità del muscolo. In particolare, immunohistochemistry MyHC accoppiato con il nostro metodo di analisi rapide possono essere impiegati per valutare i cambiamenti morfologici e metabolici nel muscolo dei modelli di malattia come distrofie muscolari, ALS e cancro cachessia. Inoltre, l'efficacia degli interventi che impedire l'atrofia o causare l'ipertrofia può anche essere valutato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi di divulgare.
Acknowledgments
Siamo grati alla Fondazione Boettcher e l'associazione sclerosi laterale amiotrofica (n. 17-II-344) per il loro supporto di questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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