Summary
골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.
Abstract
수년간, 골격 근육 섬유 유형 사이 구분 했다 myosin ATPase 얼룩에 의해 최고의 시각 됩니다. 더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 타입의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA, IIX 입력 입력 하 고 유형 IIB 섬유는 정밀 프로필 기반으로 MyHC; 지금 확인 될 수 있다 그러나, 이러한 데이터의 수동 분석 느리고 다운 오른쪽 수 지루한. 이와 관련, 섬유 형 구성과 형태학의 신속, 정확한 평가 매우 바람직한 도구입니다. 여기, 우리는 최신의 immunohistochemical 마우스 hindlimb 근육 섬유 유형 및 섬유 형태 분석 가속 소설 반자동된 알고리즘으로 콘서트에서에서 얻은 냉동된 섹션에 MyHCs의 얼룩에 대 한 프로토콜을 제시. 표시 soleus 근육 유형 I에 얼룩이 지 고 입력 IIA 섬유, 예상 대로, 하지만 형식 IIX 또는 유형 IIB 섬유. 다른 한편으로, 앞쪽에 tibialis 근육 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유, 유형 IIA 섬유의 작은 일부분의 주로 구성 되었고 거의 또는 전혀 유형 I 섬유. 여러 이미지 변환 섬유 형태 (즉, 횡단면 지역 (CSA), 최대 및 최소 Feret 직경)의 다양 한 측면을 측정 하기 위해 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 값이 수동으로 얻은 다음 비교 했다에 대 한 얻은 값입니다. 체코, 최대 또는 최소 Feret 직경에 관하여 분석의 두 모드 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다 (모든 p > 0.05), 우리의 방법의 정확도 나타내는. 따라서, 우리의 immunostaining 분석 프로토콜 노화와 myopathy의 많은 모델에서 근육 구성에 대 한 효과의 조사에 적용할 수 있습니다.
Introduction
그것은 골격 근육 많은 종류1의 단일 섬유의 구성 된 시간에 대 한 알려져 있다. 처음, 섬유의 2 개 그룹 그들의 수축 성의 속성에 따라 특징 이었다 하 고, 적절 하 게, 느린-트 위치 (유형 I) 및 빠른 트 위치 (유형 II). 이러한 범주 추가 섬유 물질 대사에 바탕으로 구별 했다. 이후 유형 I 섬유는 미토 콘 드리 아에서 풍부 하 고 산화 물질 대사에 의존, 그들은 견고 하 게 긍정적인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-tetrazolium 환 원 효소 (NADH-TR) diaphorase2 또는 호박 효소 (SDH)3 에 의해 해명 되었다 얼룩. 대조적으로, 유형 II 섬유 전시 덜 NADH TR diaphorase 또는 SDH의 가변도 얼룩이 지 고 두 빠른 트 위치 하위 그룹으로 분할 되었다 (유형 IIA 및 IIB 입력) 그들의 상대적인 산화 용량에 따라 다소 조잡. 섬유 사이의 이러한 구분 myosin ATPase 얼룩에 의해 보다 효과적으로 시각화 되어 있다 어디 유형 I 섬유는 pH 4.0에서 사전 부 화 후 어두운 얼룩 및 유형 IIB 섬유 흡수 유형 IIA 섬유와 pH 10.0에서 촉진 다음 사전 부 화 4얼룩 판매인.
더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 유형5의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA를 입력 하 고 유형 IIB 섬유 확인 될 수 있다 모두 그들의 MyHC 프로 파일에 따라 정밀. 또한, 또 다른 빠른 트 위치-중급 metabolically 섬유 종류, IIX, 입력 되었습니다 확인된6. 하나 이상의 MyHC을 표현 하는 하이브리드 섬유도 확인된5,,78있다. 고양이 개 코 원숭이 등 일부 종 표현 유형 IIB MyHCs6하지 알려져 있습니다. MyHC immunostaining는 현재 근육 구성의-의 상태--예술 평가,이 기술을 통해 얻은 데이터의 분석은 복잡 하 고 자동화 된 도움 없이 소모. 이 위해 이러한 데이터를 분석 하는 반자동된 방법의 개발된5,,910되었습니다. 여기, 우리 소설 반자동된 함께 근육 섬유 타입5,,78,10, 의 immunohistochemical 식별에 대 한 상대적으로 표준 프로토콜 제시 섬유 유형 및 섬유 형태학의 분석 정확도와 가속 알고리즘입니다.
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Protocol
쥐와 관련 된 모든 절차는 콜로라도의 대학-Anschutz 의료 캠퍼스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (91813(05)1D).
1. 주 1: 기본 (1 °)와 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 Immunostaining
마우스 hindlimb 근육 (예를 들어, 앞쪽에 tibialis, soleus)의- Air-dry 냉동된 섹션에 대 한 청구 슬라이드에 장착 ~ 30 분 11. 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하 여 섹션 주위에 테두리를 그립니다.
- 장소 ~ 5 %BSA / 인산 염 버퍼 식 염 수 (BSA/PBS) 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 각 슬라이드의 250 µ L. 1 헤에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어
- 차단, 하는 동안 준비 1시 50분의 5%에서 표면에 뜨는 1 ° 항 체 희석 BSA/PBS (모든 마우스 단일 클론 항 체는; 표 1 6 , 12 참조); 250 µ L의 준비 슬라이드 당 솔루션입니다. 얼음에 1 ° 항 체 주식 및 희석 유지
표 1: MyHCs를 구별 하는 데 사용 하는 기본 항 체.
- 5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 열망에 따라 적절 한 슬라이드에 1 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 추가 250 µ L 5 %BSA / PBS 보조 (2 °) 항 체 전용 부정적인 제어 슬라이드.
- 품 습 한 환경에서 24-48 h 4 ° C에서.
참고: 페 트리 접시 약화 필터 종이와 알루미늄 호 일에 커버 수 있습니다 역할을 적합 한 보육 실.
2. 주 2: 2 ° 형광 항 체와 Immunostaining
- 1 ° 항 체 솔루션을 발음 하거나 5 %BSA / PBS 솔루션 제어. 워시 모든 슬라이드 3 번, 5 %BSA 10 분.
- 세척, 동안 준비 1: 200의 5%에서 정화, fluorophore 활용 2 ° 항 체 희석 BSA/PBS (표 2 참조 하십시오 모두 염소 반대로 마우스). 슬라이드 당 솔루션의 250 µ L를 준비 합니다. 얼음에 어둠 속에서 2 ° fluorophore 활용 된 항 체를 유지
표 2: Fluorophore 활용 된 이차 항 체 MyHCs 하는의 시각화 기본 항 체 인식 하는 데 사용.
- 5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 세 번째 응용 프로그램의 포부, 다음 모든 슬라이드에 2 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 어두운, 습 한 환경에서 실 온에서 90 분 동안 품 어.
- Aspirate 2 ° 항 체 솔루션입니다. 세척 모든 슬라이드 3 번, 10 분 5 %BSA / PBS.
- 린스 PBS입니다. 10 분 동안 건조
- 비 영구, 저 점도 수성 장착 매체 coverglass 탑재.
- 건조 하면, 매니큐어와 슬라이드 가장자리 물개. 건조 하 고 어두운 slidebox에 저장.
3. Epifluorescence 현미경 검사 법으로 슬라이드 이미징
- 는 작은, 70% 에탄올 배어 연구소-삭제 기능으로 슬라이드를 청소.
- 사진 장치 (재료의 표 참조)를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained 근육 섹션의 디지털 이미지를 얻기.
- 약 1 m m 2 (10 X 목표, 1.4 나)의 영역을 선택 합니다.
- 보기는 505 통해 2 ° 알 렉 사 488 활용 된 항 체 형광 nm 긴 통과 필터. 595 nm 긴-패스 필터를 통해 2 ° 알 렉 사 594 활용 된 항 체의 흥분에 의해 생성 된 형광 볼. 호환 하는 이미징 소프트웨어를 갖춘 PC 컴퓨터와 이미지를 디지털화 합니다. 나중에 분석 소프트웨어 이미징에서 눈금 막대 포함.
4. 피지와 이미지의 분석
참고: 분석을 계속 하기 전에 https://imagej.net/Fiji/Downloads를 통해 피지 (는 건강의 국가 학회, 베 데스 다, 메릴랜드에서 자유롭게 사용 가능)를 설치 해야 합니다. 또한,이 과정에서 사용 하는 매크로 추가 파일에 제공 됩니다. 매크로 파일을 쉽게 액세스할 수 있는 디렉터리에 배치.
피지에서 선택한 섹션의- 부하는 명시 이미지. 플러그인으로 이동 → 세분화 → Trainable Weka 세분화.
- 섹션의 세포질 영역을 규정 하기 위해 라인에는 섬유, 그리고 클릭 " 클래스 1에 추가 ". 그런 다음, 섬유, 사이 공간에 선을 그릴을 클릭 " 클래스 2에 추가 " 세포 외 도메인을 표시. 각 클래스에 있는 5-10 레이블이 될 때까지 반복 합니다.
- 클릭 기차 분류자입니다. 결과 빨간색과 초록색 오버레이에 추가 더 많은 레이블을 수동으로 (단계 4.2 참조) 이미지, 필요한 경우의 잘못 된 조각. 섬유 (레드) 섬유 (녹색) 사이의 공간에서 적절 하 게 분리 될 때까지 반복.
- 클릭 " 얻을 확률 " 새로 레이블이 지정 된 폴더에 이미지를 저장 하 고.
- 같은 필드에서 가져온 형광 이미지 (4.2-4.3 단계) 위의 절차를 반복 합니다. 으로 immunostained 섬유 라벨 " 클래스 1 "로 모든 비 형광 지역 " 클래스 2 ". 결과 확률 지도 처리 명시 이미지 저장 된 동일한 폴더에 저장.
- 피지에서 이전에 저장 된 확률 지도 중 하나를 엽니다. 이미징 소프트웨어에 의해 제공 눈금 막대에 직선을 그립니다. 이동 분석 → 규모 설정. 눈금 막대에 의해 주어진 그들의 적절 한 값을 매개 변수 (즉, 알려진된 거리, 길이 단위)를 변경 후 확인은 " 글로벌 " 표준화 각 이미지에 대 한 규모를 상자.
- 탐색 플러그인을 → 매크로 → 실행 → Tyagi 외. 섬유 부 량 macro.ijm (보조 파일 참조). 즉시, 탐색 창에 표시 됩니다. 이미지를 열고 ' s 호스트 폴더; 대화 상자가 표시 됩니다. 각 대화 상자에 대 한 변경 된 " 배경 " 드롭다운 값을 " 빛. "
참고: 폴더 이제 채워집니다 섬유 윤곽선의 이미지와 스프레드시트 소프트웨어 파일 (체코와 Feret 직경은 가장 관련 된 결과의 측정 섬유 형태; 측정 된 매개 변수를 조정할 수 있습니다 설정 측정 분석). 스프레드시트 소프트웨어 파일에 대 한 두 형광 및 밝은 분야 이미지 피지의 기 공 분석 기능에 의해 생성 하는 섬유 형태 데이터를 자동으로 옮겨질 것 이다. - 계산 하는 필드에 지정 된 MyHC 필드에 해당 필드 밝은 이미지에 총 섬유의 수에 의해 형광 섬유의 수를 분할 하 여 표현 하는 섬유의 분수.
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Representative Results
알 수 없는 나이의 남성 C57BL/6 마우스 해 부 Hindlimb 근육 (즉, 앞쪽에 tibialis, soleus) 액체 질소 냉각 isopentane 화합물 10 월에는 근육을 포함 하는 플라스틱 금형을 침 몰 하 여 냉동 플래시 했다. 그런 다음는 cryotome를 사용 하 여, 8-10 µ m 직렬 섹션-20 ° C에서 잘라 되었고 다른 긍정적으로 위탁 유리 슬라이드12전송.
이 근육은 주로 빠른-및 느린-섬유 트 위치, 각각13,14로 구성 하기 때문에 우리는 앞쪽에 tibialis와 soleus 선택. 개별 유형 I, IIA, IIX 및 IIB MyHCs, 얼룩 immunohistochemical 다음 명시 및 형광 이미지 캡처 했다. 그림 1 의 왼쪽된 패널 표시 형식과 soleus 근육 immunostained의 섹션 I, IIA, IIX 및 IIB MyHC 특정 항 체는 표 1에 나열 된.
그림 1 : MyHC의 Immunohistochemical 얼룩 유형 I, IIA, IIX, IIB 마우스 soleus 근육에. 왼쪽된 패널 조사 유형 I (바-F8; 이동 주 항 체와 마우스 soleus 근육의 섹션에서 얻은 형광 이미지를 표시 A) IIA (사우스 캐롤라이나-71;을 입력 B) 입력 IIX (6 H 1; C) IIB (BF-F3;를 입력 하 고 D) MyHCs입니다. 오른쪽 패널 표시 섹션 해당 왼쪽된 패널에 표시 된 실험에 사용 된 1 차적인 항 체 생략 되었다. 바 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
특히, 관찰 표현 유형 섬유의 상당한 분수 I (그림 1A, 왼쪽) 및 유형 IIA MyHCs (그림 1B, 왼쪽) 형식에 대 한 긍정적인 얼룩이 표시 나머지 섬유의 정당한 금액을 IIX MyHCs (그림 1C, 왼쪽) 대조적으로, 거의 아무 유형 IIB 섬유 분명 (그림 1D, 왼쪽) 했다. 이러한 관측은 soleus 근육은 이전 보고로 일관 된 주로 형식의 구성, IIA를 입력 하 고 입력 IIX 섬유 (덜 그렇게) 거의 아무 유형 IIB 섬유5,,1012. 중요 한 것은, 얼룩이 지는 기본 항 체 프로토콜, 항 체 (그림 1A-D, 오른쪽 패널)의 특이성을 시연에서 생략 했다 섹션에서 관찰 되었다.
그림 2 : MyHC의 Immunohistochemical 얼룩 IIB, 입력 IIX, IIA 나 마우스 tibialis 앞쪽 근육에. 왼쪽된 패널 IIB (A) 입력 IIX (B)를 입력, IIA (C)를 입력 하 고 유형 I (D) MyHCs 감독 1 차 항 체를 탐지 마우스 tibialis 앞쪽 근육의 섹션에서 얻은 형광 이미지를 표시 합니다. 오른쪽 패널 표시 섹션 인접 한 왼쪽된 패널에 표시 된 실험에 사용 된 1 차적인 항 체 생략 되었다. 바 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
우리는 또한 상기 항 체와 tibialis 앞쪽 근육 스테인드. Tibialis 앞쪽 근육 섬유 유형 IIA MyHCs (그림 2C, 왼쪽); 표현에서 작은 기여와 함께 주로 유형 IIB 유형과 IIX MyHC 양성 섬유 (그림 2A-B, 왼쪽 패널)의 흑운모 거의 아무 섬유 유형 표현 나 MyHC (그림 2D, 왼쪽) 관찰 되었다. 우리의 데이터 마우스 앞쪽에 tibialis 구성 되어 주로 빠른 트 위치 유형 IIA, IIB를 입력 하 고 유형 IIX 섬유는 이전 연구5,,1013일치를 나타내는. 다시, 얼룩이 지는 기본 항 체 프로토콜 (그림 2A D, 오른쪽 패널)에서 생략 했다 섹션에서 관찰 되었다.
그림 3 : 반복된 전산화 섬유 세분화. 마우스 tibialis 앞쪽 섹션 (A)의 명시 이미지. 우리의 반 자동화 알고리즘 (B)를 사용 하 여 같은 이미지의 변환입니다. 유형 IIA MyHC (C)의 immunostaining를 보여주는 동일한 섹션의 형광 이미지. 변환 이미지 보여주는 유일한 유형 IIA MyHC 표현 섬유 (D). 바 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
형태학 분석을 목적으로 immunostained 필드의 명시 이미지도 획득 했다. 그림 3A 의 예에서는 IIA MyHCs13입력을 지시 하는 SC-71 항 체와 조사 tibialis 근육 앞쪽 섹션에서입니다. 우리의 원래 반자동된 알고리즘을 사용 하 여 여러 이미지 변환 명시 이미지에서 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 그림 3A 명시 이미지에서 파생 된 전형적인 이미지 변환 그림 3B에 제공 됩니다. 우리 의미 CSA (891.4 ± 45.0 μ m2), 최대 (46.9 ± 1.3 µ m) 고 각 섬유 분야에서의 최소 (26.0 ± 0.8 µ m) 평균 Feret 직경 측정 변환 및 피지의 기 공 분석 기능을 사용 하 여. 우리의 측정의 정확도 테스트 하려면 우리 평가 명시 이미지에 이러한 매개 변수가 수동으로. 의미 CSA (867.0 ± 52.0 µ m2), 최대 (45.7 ± 3.5 µ m) 및 최소 (25.6 ± 1.9 µ m) 더 지루한 수동 수집 방법을 사용 하 여 얻은 Feret 직경 이었다 반자동된 방법과 크게 다른 의미 (모든 p > 0.05, 짝이 없는 t-테스트; 표 3)입니다.
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
표 3: 섬유 형태 및 유형에 대 한 tibialis 앞쪽 근육 immunostained의 구성 I, IIA, IIB, 수동 및 자동 분석 방법을 정한 IIX MyHCs. Feret 지름과 제시 알고리즘 대 전통적인 수동 평가 통해 계량 마우스 tibialis 앞쪽에 MyHC 종류를 의미, 섬유 CSA를 의미 한다. 결합 된 분수 1 개 이상의 MyHC 타입을 표현 하는 섬유의 존재 때문에의 값을 초과 note 하시기 바랍니다.
그림 3 C 는 IIA MyHCs 입력을 지시 하는 항 체와 같은 필드 immunostained의 형광 이미지를 보여줍니다. 분야에서 긍정적으로 얼룩이 섬유 수 (그림 3D)로 선정 되었고 명시 변환 필드 (표 3 섬유의 총 수로 나누어 유형 IIA MyHC 표현 섬유의 일부를 결정 하는 데 사용 ). Feret 유형 IIA 섬유의 직경은 다음 평균 체코, 최대 및 최소 평가 (표 3). 비율이 나, 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유 뿐 아니라 그들의 치수 입력, 직렬 섹션 immunostained 바 F8, 6 H 1와 BF-F3 항 체, 각각6,12(표 4에서에서이 프로토콜을 반복 하 여 결정 ; 그림 4 A-D)입니다.
표 4: MyHC 콘텐츠 및 마우스 soleus 및 앞쪽에 tibialis 형태학. 섬유 유형 작곡 soleus 및 앞쪽에 tibialis의 대표 섹션의. 평균 CSA의 정량화, 최소 및 최대 Feret 직경의 type I, IIA, IIX 타입과 유형 IIB soleus 및 앞쪽에 tibialis 표시 됩니다. 데이터는 평균 ±SEM으로 부여 됩니다.
우리는 또한 soleus 근육 (표 4;에서 얻은 필드에 이러한 매개 변수를 평가 그림 4 A-D)입니다. 3052 2,876 개별 섬유는 각각 앞쪽에 tibialis와 soleus 근육에 대 한 계산 했다. 함께 찍은, 이러한 데이터는 섬유 유형 및 형태학 분석에서 우리의 방법의 타당성을 보여 줍니다.
그림 4 : 형태학 분석 데이터 요약. 앞쪽에 tibialis soleus 근육 (A)의 대표 섹션의 섬유 형 작곡. 평균 CSA의 정량화, minimimal 및 최대 Feret 직경의 유형 I, 유형 IIA, IIX 타입과 tibialis anteriort와 soleus 유형 IIB fivers (B-D)에 표시 됩니다. 데이터는 의미 ±SEM. 앞쪽에 tibialis 사이의 중요 한 차이점으로 주었고 soleus 표시 됩니다 (* p 를 나타냅니다 < 0.05: * * p 를 나타냅니다 < 0.01; * * * p 를 나타냅니다 < 0.005; t-검정). 3052 2,876 개별 섬유는 각각 앞쪽에 tibialis와 soleus 근육에 대 한 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 파일: 섬유 정량화 매크로. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리 골격 근육 섬유 종류의 식별에 유용한 방향 제공. 이렇게, 우리는 데이터의 분석을 위한 새로운 알고리즘을 설명 합니다.
때문에 우리의 결과 크게 이전 보고서5,,810 의 확인 하 고 우리 자신의 수동 측정을 반영, 알고리즘은 정확 하 게 나타납니다. 아직도, 우리는 유물 단면에서 결과 불분명 섬유 테두리를 포함 하 여 몇 가지 드문 실험 함정이 발생. 주의 단면화 및 분석 이전에 처리 된 부분의 경계 검사를 통해이 이미지 들의 영향을 최소화할 수 있습니다. 특히, 선명한 대비를 달성 하기 위해 같은 이미지에 재분류의 여러 라운드를 통해 보다 최적의 이미지 세분화를 피할 수 있습니다.
우리의 프로토콜에서 가장 중요 한 단계는 우리 규정 섹션의 세포와 extracellular 영역 특정된 섬유에 선을 그려 그로 인하여 "클래스 1" 또는 "클래스 2" 영역을 구별 하는 4.2를 단계 이다. 물론,이 수동 구별은 중요 한 그것 근육 섬유;의 경계를 결정 하기 때문에 이 단계에서 오류가 섬유 크기의 평가 저하 됩니다.
이 연구에서 우리가 주어진된 직렬 섹션에서 하나의 MyHC에 대 한 섹션을 조사. 그러나, 하이브리드 섬유 등 일부 섬유 두 가지 유형의 MyHC, 신진 대사 기능 프로필 (예를 들어, IIX 입력 하 고 입력 IIB) 중복을 나타내는 표현. 따라서, 섬유 타입 값을 표현 하는의 분수 > soleus 및 앞쪽에 tibialis(그림 4)1. 하이브리드 섬유 더블-, 또는 심지어 트리플-, 리 외. 에 의해 설명 된 같은 프로토콜 라벨 확인 될 수 있다 7, Bloemberg 및 Quadrilatero5, 각각. 중요 한 것은, 우리의 방법은 분석의이 더 복잡 한 얼룩 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜의 또 다른 한계는 그것이 완전 자동; 그러나, 우리는이 작은 양보 우리의 방법은 경직 속도 위해 타협 하지 않는 보장을 믿습니다.
이 연구에서 관찰 된 soleus와 tibialis 앞쪽 근육의 MyHC 작곡 하는 동안 이전 연구5,6,7,,1014 의 결과 반영 체코의 평가 관한 이전 연구와 몇 가지 대조 있습니다. 예를 들어 평균 CSA의 우리의 측정은 Bloemberg 및 Quadrilatero5 와 알 렌 외에 의해 보고 그 보다 다소 작습니다. 15 특히, 우리의 체코 측정에서에서 배열 했다 539.86 ± 24.44 µ m2 1319.50 ± 57.47 µ m2 섬유 종류에서 그들의 대략 735.7 ± 31.2 µ m2 3073.8 ± 51.3 µ m2에 걸쳐 하다 니. 그러나, 우리의 가치 더 유사한 그 아우 외 에 의해 관찰 13 과 루카스 외. 6 각각 2404 ± 412.5 µ m2 , 815 ± 221 µ m2 1904 ± 570 µ m2, 436 ± 605 µ m2 에서 배열 하는 평균 CSAs 보고. 따라서, 마우스 hindlimb 섬유의 형태학 분석에서 몇 가지 변화는 문학에서 존재합니다.
Immunohistochemistry 레이블 및 MyHC 콘텐츠 기초 근육 섬유를 분류 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 정확한 정량화의 immunohistochemical 실험 데이터;에 대 한 의미 있는 결론을 만들기 위해 필수적 이다 이 위해, 분석의 지루한 부분을 자동화할 수 있는 방법 수백, 또는 수천, 섬유의 측정을 분류 해야 하는 경우에 특히 유용한 것을 이다. 수동 관측에 유사한 측정 뿐 아니라 우리의 알고리즘 바이어스; 없이 이러한 데이터의 정확한 평가 제공 합니다. 이 이점이 수동 측정 하면 과학적인 엄 함. 이와 관련, 우리의 방법론 근육 무결성에 영향을 주는 실험과 유전자 조작의 효과의 특성 분석에 유용할 수 있습니다. 특히, 우리의 신속한 분석 방법으로 결합 된 MyHC immunohistochemistry 근육 근육 dystrophies 질병 모델의 형태학 및 대사 변화를 평가 하기 위해 채택 될지도 모른다 ALS 그리고 암 악. 또한, 비 대 또는 위축 방지는 개입의 효능 평가 또한 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개를 전혀 상반 되는 관심사를 있다.
Acknowledgments
우리는이 연구의 그들의 지원을 위해 Boettcher 재단과 루 경화 증 협회 (#17-II-344)에 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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