Summary
İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.
Abstract
Yıllardır, iskelet kas lif türleri arasında ayrım en iyi myosin-ATPaz boyama tarafından görüntülenmiştir. Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama fiber türü daha ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA, IIX yazın yazın ve tip IIB lifleri şimdi onların MyHC profiline dayalı hassasiyetle tespit edilebilir; Ancak, bu verilerin el ile analiz yavaş ve aşağı doğru olabilir sıkıcı. Bu bağlamda, hızlı, doğru değerlendirme fiber türü kompozisyon ve Morfoloji çok arzu edilen bir araçtır. Burada, MyHCs fare hindlimb kas fiber türü ve lif morfolojisi analizini hızlandırır roman yarı otomatik bir algoritma ile uyum içinde elde edilen donmuş bölümlerinde, state-of--art immunohistokimyasal boyama için bir iletişim kuralı mevcut. Beklendiği gibi görüntülenen soleus kas-için boyama tip ı ve tip IIA lifleri, ama türü IIX ya da tip IIB lifleri için değil. Öte yandan, tibialis anterior kas türü IIX ve tip IIB liflerinin, tip IIA lifleri küçük bir kısmını ağırlıklı olarak bestelendi ve az veya hiç tip ı lifleri. Birkaç görüntü dönüşümleri lif morfolojisi (Yani, kesit alanı (CSA), maksimum ve minimum Feret çapı) farklı yönlerini ölçmek amacıyla olasılık haritalar oluşturmak için kullanılan. Bu parametreler sonra el ile elde edilen değerler ile karşılaştırıldı için elde edilen değerler. Hiçbir önemli farklılıklar analiz CSA, maksimum veya minimum Feret çapı açısından her iki mod arasında gözlendi (tüm p > 0,05), bizim yöntem doğruluğunu gösteren. Böylece, bizim immunostaining Çözümleme Protokolü Kas kompozisyonu yaşlanma ve myopathy birçok model üzerinde etkileri incelenmesi için uygulanabilir.
Introduction
Kas iskelet birçok türleri1tek liflerinin oluşan bir süredir bilinmektedir. Başlangıçta, iki grup liflerinin contractile özelliklerine göre karakterize ve adli, uygun şekilde, yavaş seğirme (tip ı) ve hızlı-seğirme (tip II). Bu kategoriler daha fazla lif metabolizma temelinde ayırt edildi. Beri tip ı lifleri mitokondri içinde zengin ve oksidatif metabolizma güvenen, onlar sağlam olumlu Nikotinamid adenin dinükleotit-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) diaphorase2 ya da süksinat dehidrogenaz (SDH)3 ile aydınlatılmamıştır boyama. Buna karşılık, tip II lifleri daha az sergilenen ve değişken derece NADH-TR diaphorase veya SDH boyama ve iki fast twitch alt gruplar ayrıldı (IIA ve IIB yazın) biraz kabaca göreli oksidatif kapasite üzerinde dayalı. Bu ayrımlar lifler arasında-var daha etkili bir şekilde görselleştirildiği myosin-ATPaz boyama tarafından nerede tip ı lifleri leke karanlık pH 4.0 öncesi bir kuluçka sonra ve tip IIB lifleri absorbe pH 10.0 tip IIA lifleri ile acele aşağıdaki ön kuluçka ayda4boyama.
Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama lif tipi5ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA yazın ve tip IIB lifleri tüm hassasiyetle onların MyHC profiline göre belirlenebilir. Ayrıca, başka bir fast twitch metabolik olarak orta fiber türü, IIX, yazın tanımlanan6oldu. Birden fazla MyHC ifade karma lifler de teyit edilen5,7,8olmuştur. Kedi ve maymun gibi bazı türler değil hızlı Tip IIb MyHCs6için bilinir. MyHC immunostaining Kas kompozisyonu state-of--art değerlendirilmesi şu anda olsa da, bu tekniği ile elde edilen verilerin analizi hantal ve zaman alıcı otomatik yardımı olmadan. Bu amaçla, bu verileri çözümlemek için yarı otomatik yöntemleri bir avuç gelişmiş5,9,10olmuştur. Burada, kas lif tipi5,7,8,10, immunohistokimyasal tanımlanması için nispeten standart bir protokol ile birlikte bir roman yarı otomatik mevcut fiber türü ve lif morfolojisi analizini hassasiyetle hızlandırır algoritması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fareler içeren tüm yordamları Colorado Üniversitesi-Anschutz tıbbi kampüs kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (91813(05)1D).
1. gün 1: İlköğretim (1°) sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ile Immunostaining
fare hindlimb kas (örneğin, tibialis anterior, soleus)- Air-dry donmuş bölümlerini monte için şarj edilmiş slaytlarda ~ 30 dk 11. bir hidrofobik bariyer PAP kalem kullanma bölümlerine bir kenarlık çiz.
- Yer ~ 250 µL % 5 BSA/fosfat tamponlu tuz (BSA/PBS) non-spesifik antikor bağlama engellemek için her bir slayt. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h. için kuluçkaya
- Engelleme iken, 1:50 hazırlamak dilutions 1° antikor süpernatant % 5'in BSA/PBS (tüm fare monoklonal antikorlar; bkz. Tablo 1 6 , 12); in 250 µL hazırlamak çözüm slayt başına. 1 ° antikor stokları ve dilutions buz üzerinde tutmak
Tablo 1: birincil MyHCs ayırt etmek için kullanılan antikorlar.
- % 5 BSA/PBS engelleme çözüm aspirasyon 1 ° antikor seyreltme 250 µL uygun slaytlara ekleyin. 250 eklemek µL % 5'lik BSA/PBS ikincil (2°) salt antikor negatif kontrol için slaytlar.
- Incubate için 24-48 h nemli bir ortamda 4 ° C'de.
Not: Alüminyum folyo nemlendirilmiş filtre kağıdı ile kaplı bir petri uygun kuluçka odası hizmet verebilir.
2. Gün 2:2 ° floresan antikor ile Immunostaining
- Aspire 1° antikor çözüm ya da %5 BSA/PBS çözüm kontrol. Yıkama tüm slaytlar üç kez, 10 min %5 BSA ile.
- Yıkama sırasında arıtılmış, fluorophore Birleşik 2 ° antikorlar % 5, 1: 200 dilutions hazırlamak BSA/PBS (bkz. Tablo 2, tüm keçi Anti-fare vardır). Çözüm slayt başına 250 µL hazırlayın. Buz üzerinde 2 ° fluorophore Birleşik antikorlar anlatmamanı
Tablo 2: Fluorophore Birleşik ikincil görselleştirmek birincil antikor tanıma, MyHCs için kullanılan antikorlar.
- üçüncü uygulama %5 BSA/PBS engelleme çözümün aspirasyon 2 ° antikor seyreltme 250 µL tüm slaytlara ekleyin. Karanlık, nemli bir ortamda oda sıcaklığında 90 dk için kuluçkaya.
- Aspire edin 2° antikor çözüm. Yıkama tüm slaytlar üç kez, % 5 ile 10 dk BSA/PBS. PBS ile
- durulama. 10 dakika süreyle kuru
- Coverglass bir kalıcı olmayan, düşük viskozite sulu montaj orta ile mount.
- Zaman kuru, slayt kenarları oje ile kapatın. Kuru ve mağaza içinde karanlık bir slidebox.
3. Epifluorescence mikroskobu ile slaytlar Imaging
- temiz bir bezle küçük, % 70 etanol bulanmış laboratuvar-slaytlar.
- İmmunostained kas bölümlerin (Tablo reçetesi görmek) bir fotoğraf cihazları ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edilir.
- Yaklaşık 1 mm 2 (10 X amaç, 1.4 NA) alanı seçin.
- View 2° Alexa 488 Birleşik antikor floresan bir 505 üzerinden nm uzun geçiren Filtre. Uyarma 595 nm uzun geçiren Filtre üzerinden 2 ° Alexa 594 Birleşik antikorların tarafından oluşturulan Floresans görüntüleyin. Görüntüleri dijital ortama uyumlu bir görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar ile. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı daha sonraki analizler için ölçek çubuğu içerir.
4. Fiji görüntülerle analizi
Not: analizi ile devam etmeden önce Fiji (serbestçe Ulusal Sağlık enstitüleri, Bethesda, MD kullanılabilir) https://imagej.net/Fiji/Downloads yüklenmesi gerekir. Bu süreç içinde kullanılan makro içinde belgili tanımlık Ek dosya mevcuttur. Makro dosyasını kolayca erişilebilir bir dizine yerleştirin.
Seçilen kısımda Fiji- yük bir aydınlık alan görüntüsü. Eklentileri gidin → segmentasyon → öğretilebilir Weka segmentasyon. Bölüm, hücresel alanlarında şart için
- bir kumaş üzerinde bir çizgi çizin ve'ı tıklatın " class 1 Ekle ". O zaman, uzay lifler arasında bir çizgi çizin ve'ı tıklatın " class 2 Ekle " ekstrasellüler etki alanları işaretlemek için. Her sınıfta 5-10 etiketleri kadar yineleyin.
- Tıklayın tren Sınıflandırıcısı. Elde edilen kırmızı ve yeşil yerleşim üzerinde daha fazla etiket el ile eklemek (bkz. Adım 4.2) görüntü, gerekirse yanlış kesimli bölümlerine. Lifleri (kırmızı) uygun şekilde lifleri (yeşil) arasındaki boşluğu ayrılır kadar yineleyin.
- 'I tıklatın " olasılık almak " ve görüntü yeni etiketli bir klasöre kaydedin.
- İle aynı alandan alınan floresan görüntü (Adım 4.2-4.3) Yukarıdaki yordamı yineleyin. Etiket immunostained lifleri olarak " sınıf 1 " ve tüm sigara floresan bölgeleri olarak " sınıf 2 ". Elde edilen olasılık harita işlenmiş aydınlık alan görüntünün depolandığı klasöre kaydedin.
- Önceden kaydedilmiş olasılık haritalardan biri Fiji'de açın. Düşsel bilgisayar yazılımı tarafından sağlanan ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi çizin. Analiz gitmek → ayarla ölçek. Ölçek çubuğu tarafından verilen uygun değerlerine (Yani, bilinen mesafesi, uzunluk birimi) parametreleri değiştirmek sonra kontrol " Global " kutusunu her görüntü için ölçek standartlaştırmak için.
- Eklentileri gidin → makroları → çalıştırmak → Tyagi'yi vd. fiber miktar macro.ijm (Ek dosya bakın). Hemen, bir gezinti bölmesi görünür. Açık belgili tanımlık imge ' s ana klasör; bir iletişim kutusu görüntülenir. Her iletişim kutusu için değiştirmek " arka plan " açılan değerine " ışık. "
Not: klasörü şimdi görüntüler fiber özetliyor ve elektronik yazılım dosyaları (CSA ve Feret çapı için en uygun sonuçları ile doldurulur lif morfolojisi miktarının; ölçülen parametreler analiz ayarla ölçümlerde ayarlanabilir). Fiji gözenek analiz işlevi kullanılarak oluşturulan lif morfolojisi veri otomatik olarak her iki floresan ve parlak alan görüntüler için elektronik tablo yazılımı dosyalar için transfer. - Lifleri floresan lifleri alanındaki sayıya karşılık gelen parlak alan resimdeki toplam liflerinin sayısı bölerek bir alanda belirli bir MyHC ifade kısmını hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilinmeyen yaş bir erkek C57BL/6 fareden kesmiştim Hindlimb kasları (Yani, tibialis anterior, soleus) sıvı azot soğutmalı isopentane bileşik kas Ekim içeren bir plastik kalıp batan tarafından dondurulmuş flaş. Sonra bir cryotome kullanarak, 8-10 µm seri bölümler-20 ° C'de kesmek ve farklı olumlu tahsil cam slayt12' ye transfer.
Bu kaslar ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş-seğirme liflerinin, sırasıyla13,14oluşur çünkü tibialis anterior ve soleus seçti. Ben, IIA, IIX ve IIB MyHCs, bireysel türü için boyama immunohistokimyasal aydınlık alan ve floresan görüntüleri ele geçirildi. Şekil 1 sol panelleri soleus kas immunostained türü ile bölümlerini göster ben IIA, IIX ve IIB MyHC özel antikorlar listelenen Tablo 1' de.
Resim 1 : MyHC immunohistokimyasal boyama tip ı, IIA ve IIB fare soleus kas IIX. Sol kapı aynası yazın ben (BA-F8; yönelik birincil antikorlar ile probed fare soleus kas bölümlerini elde edilen floresan resimleri göster A), IIA (SC-71; yazın B), yazın IIX (6 H 1; C) ve tip IIB (BF-F3; D) MyHCs. Doğru kapı aynası içinde karşılık gelen sol panelde tasvir deneyinde kullanılan birincil antikor ihmal bölümlerde gösterilmiştir. Barlar 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Özellikle, biz gözlenen türü ifade liflerinin önemli kesirler ben (şekil 1A, sol) ve tip IIA MyHCs (şekil 1B, sol) ile adil bir miktar kalan liflerinin olumlu türü için boyama görüntüleme IIX MyHCs (şekil 1C, sol). Buna karşılık, hemen hemen hiçbir türü IIB lifleri belirgin (şekil 1D, sol) vardı. Bu gözlemler soleus kaslar daha önceki raporları ile tutarlı türü çoğunlukla oluşmaktadır, IIA yazıp IIX lifleri (çok az) neredeyse hiçbir türüyle IIB lifleri5,10,12. Da önemlisi, hiçbir boyama hangi antikor (şekil 1A-D, doğru kapı aynası) özgüllük gösteren iletişim kuralından birincil antikor atlanmış bölümlerde gözlendi.
Resim 2 : MyHC immunohistokimyasal boyama IIB, IIX, IIA ve ben fare tibialis anterior kas yazın. Sol kapı aynası bir fare tibialis anterior kas IIB(a)yazın, IIX (B) yazın, IIA (C) yazın ve yazın (D) MyHCs Yönetmen: birincil antikorlar ile probed bölümlerini elde edilen floresan resimleri göster. Doğru kapı aynası içinde bitişik sol panelde tasvir deneyinde kullanılan birincil antikor ihmal bölümlerde gösterilmiştir. Barlar 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ayrıca söz konusu antikorlar ile tibialis anterior kaslar lekeli. Tibialis anterior kas liflerinden tip IIA MyHCs (Şekil 2C, sol); ifade daha küçük katkılarıyla çoğunlukla Tip IIb ve türü IIX MyHC pozitif liflerinin (panelleri yaptıŞekil 2A-B) oluşturuldu hemen hemen hiçbir elyaf türü ifade ben MyHC (Resim 2D, sol) gözlendi. Fare tibialis anterior IIB yazın hızlı twitch tip IIA, ağırlıklı olarak oluşur ve türü IIX lifleri daha önceki çalışmaları5,10,13ile tutarlı olduğunu gösteren bizim veri. Yine, hiçbir boyama hangi Protokolü (Şekil 2A-D, doğru kapı aynası) birincil antikor atlanan bölümlerdeki gözlendi.
Şekil 3 : Tekrarlayan bilgisayarlı fiber segmentasyon. Aydınlık alan görüntü bir fare tibialis anterior bölümün(a). Bizim yarı otomatik algoritması (B) ile aynı görüntü dönüşümü. İmmunostaining tip IIA MyHC (C) gösterilen aynı bölüm floresan görüntü. Tek tip IIA MyHC ifade lifleri (D) gösterilen dönüştürme görüntü. Barlar 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Xarakteristikaları analizi amacıyla, aydınlık alan görüntüleri immunostained alanlarının da elde ettim. Şekil 3'A gösterilen örnek tibialis anterior kas bölümünden IIA MyHCs13yazın yönelik SC-71 antikorlar ile probed olduğunu. Bizim orijinal yarı otomatik algoritması kullanan birkaç görüntü dönüşümleri olasılık haritalar aydınlık alan görüntüleri oluşturmak için kullanılan. Şekil 3' teA gösterilen aydınlık alan görüntüden türetilmiş bir tipik görüntü dönüştürme şekil 3' teBsunulmaktadır. Dönüşümün ve Fiji gözenek analiz işlevini kullanarak, biz ortalama CSA (891.4 ± 45.0 µm2), en fazla (46.9 ± 1.3 µm) ve en az (26.0 ± 0,8 µm) ortalama Feret çapları her lif alanında ölçülen. Bizim ölçümleri kalitesini test etmek için biz de bu parametreler aydınlık alan görüntü el ile değerlendirildi. Feret çapları daha sıkıcı el ile satın alma yöntemi kullanılarak elde edilen yarı otomatik yönteminden farklı değildi demek CSA (867.0 ± 52.0 µm2), (45,7 ± 3.5 µm) maksimum ve minimum (25,6 ± 1.9 µm) demek (tüm p > 0,05, unpaired t-testleri; Tablo 3).
= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / >
Tablo 3: lif morfolojisi ve tibialis anterior kas immunostained türünün bileşimi ben, IIA ve IIB IIX manuel ve yarı otomatik analitik yöntemleri tarafından belirlenen MyHCs. Fiber CSA demek, Feret çap ve MyHC tipinde geleneksel el ile değerlendirme karşı sunulan algoritma üzerinden sayısal bir fare tibialis anterior. Kombine kesirler 1 birden fazla MyHC türü ifade lifleri varlığı nedeniyle değeri aşan unutmayın.
Şekil 3 C IIA MyHCs yazın yönelik antikorlar ile aynı alan immunostained floresan bir görüntüsünü gösterir. Olumlu lekeli lifleri alanındaki sayı (şekil 3D) tarafından seçilen ve lifleri (Tablo 3 aydınlık alan dönüşüm alanında toplam sayısı bölünerek tip IIA MyHC ifade lifleri kısmını belirlemek için kullanılan ). Feret çapları tip IIA liflerinin o zamanlar ortalama CSA, maksimum ve minimum (Tablo 3) değerlendirildi. Oranı yazın ben, türü IIX ve tip IIB lifler, aynı zamanda onların boyutları, bu protokol için seri bölümler immunostained sırasıyla6,12(Tablo 4 BA-F8, 6 H 1 ve BF-F3 antikorlar, tekrar ederek belirlendi ; Şekil 4 A-D).
Tablo 4: MyHC içerik ve Morfoloji fare soleus ve tibialis anterior. Fiber türü besteleri soleus ve tibialis anterior temsilcisi bölüm. Miktar ortalama CSA, minimal ve maksimal Feret çapları, tip ı, IIA, yazın IIX yazın ve soleus ve tibialis anterior Tip IIb gösterilir. Verileri ortalama ±SEM verilir.
Biz de bu parametreler soleus kas (Tablo 4; elde bir alanda değerlendirildi Şekil 4 A-D). 3,052 ve 2,876 bireysel lifler tibialis anterior ve soleus kaslar, için sırasıyla sayıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler bizim yöntem fiber türü ve xarakteristikaları analizi fizibilite göstermek.
Şekil 4 : Xarakteristikaları analiz veri özeti. Tibialis anterior ve soleus kaslar(a)temsilcisi bölümlerini fiber türü kompozisyonlar. Miktar ortalama CSA, minimimal ve maksimal Feret çapları, tip ı, IIA, yazın IIX yazın ve tip IIB fivers tibialis anteriort ve soleus (B-D) gösterilir. Veri anlamına ±SEM. tibialis anterior arasında önemli farklılıklar verilen ve soleus belirtilir (* p gösterir < 0,05: ** p gösterir < 0,01; *** p gösterir < 0,005; t-Testi). 3,052 ve 2,876 bireysel lifler tibialis anterior ve soleus kaslar, için sırasıyla sayıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya: Fiber miktar makro. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bizim iskelet kas lif türleri tanımlanması için yararlı yön vermişlerdir. Bunu yaparken, biz veri analizi için yeni bir algoritma tanımlamak.
Bizim sonuçları büyük ölçüde bu önceki raporlar5,8,10 onaylayın ve bizim kendi el ile ölçümleri yansıtmak beri algoritma doğru gibi görünüyor. Yine de, yapı kesit sonucu belirsiz fiber Kenarlıklar dahil olmak üzere bazı nadir deneysel tuzaklar ile karşılaştı. Dikkatli kesit ve analiz önce işlenmiş bölüm uyanık incelenmesi yoluyla bu eserler etkisini en aza indirilebilir. Özellikle, daha az optimum görüntü segmentasyonu sınıflandırma daha keskin kontrast elde etmek için aynı görüntü üzerinde birden fazla mermi ile hile.
Bizim protokolü en önemli adımda hangi biz kısmındaki hücresel ve ekstraselüler alanlarında belirli bir lif üzerinde bir çizgi çizerek böylece "sınıf 1" veya "sınıf 2" alan ayrım şart 4.2 adım. Belli ki, kas lifleri sınırlarını belirler çünkü el ile bu ayrım önemlidir; bir hata bu adımda lif boyutları değerlendirilmesi olumsuz yönde etkiler.
Bu çalışmada, belirli bir seri bölümünde tek bir MyHC için bölümler probed. Ancak, karma lifler gibi bazı lifler MyHC, (örneğin, IIX yazıp IIB) metabolik/fonksiyonel profilleri örtüşen gösterge niteliğindeki iki tür ifade. Böylece, kesirler fiber türü için bir değer özetlenebilir > soleus ve tibialis anterior (şekil 4A) için 1. Karma lifler-ebilmek var olmak identified ile çift-, ya da hatta üçlü Lee ve ark. tarafından açıklanan gibi protokoller etiketleme, 7ve Bloemberg ve Quadrilatero5, anılan sıraya göre. Önemlisi, bizim yöntemi analiz bu daha karmaşık boyama iletişim kuralları için uygulanır. Bizim Protokolü'nün başka bir sınırlama tam otomatik değil mi; Ancak, bu küçük imtiyaz bizim yöntem rigor hız uğruna ödün vermeyen sağlar inanıyoruz.
Bu çalışmada gözlenen soleus ve tibialis anterior kaslar MyHC kompozisyonlar önceki çalışmalar5,6,7,10,14 sonuçlar yansıtacak iken , CSA değerlendirilmesi ile ilgili olarak daha önceki çalışmalar bazı kontrastlı vardır. Örneğin, bizim ölçümleri ortalama CSA biraz bu Bloemberg ve Quadrilatero5 ve Allen ve arktarafından rapor daha küçüktür. 15 iken onların kabaca 735.7 ± 31.2 µm2 ile 3073.8 ± 51.3 µm2yayılmış özellikle bizim CSA ölçümleri 539.86 ± 24.44 µm2 den 1319.50 ± 57.47 µm2 için lif türleri arasında değişiyordu. Ancak, Değerlerimiz daha yakından bu Augusto vd tarafından gözlenen benzer 13 ve Lucas vd. sırasıyla 2404 ± 412.5 µm2 ve 815 ± 221 µm2 ile 1904 ± 570 µm2, 436 ± 605 µm2 arasında değişen ortalama CSAs bildiren 6 . Böylece, fare hindlimb lifleri xarakteristikaları analizi bazı değişkenlik edebiyat arasında bulunmaktadır.
İmmünhistokimya etiket ve kas lifleri MyHC içeriklerini temelinde sınıflandırmak için etkili bir yol sunar. İmmunohistokimyasal deneyler doğru miktar veriler hakkında anlamlı sonuçlar yapmak için önemlidir; Özellikle yüz, ya da hatta bin liflerinin ölçülen ve sınıflandırılmış gerekir bu amaçla, analiz sıkıcı parçalarını otomatikleştirebilirsiniz bir yararlı bir yöntemdir. Ölçümler için elle yapılan gözlemler benzer sağlamanın yanı sıra, bizim algoritma önyargı olmadan bu verilerin doğru bir değerlendirme sağlar; el ile yapılan ölçümler bu avantaj bilimsel rigor sağlar. Bu bağlamda, metodolojimiz kas bütünlük etkisi genetik ve deneysel manipülasyonlar etkileri karakterizasyonu yararlı olabilir. Özellikle, bizim hızlı analiz yöntemi ile birleştiğinde MyHC immünhistokimya kas hastalığı modelleri gibi kas dystrophies, morfolojik ve metabolik değişiklikler değerlendirmek için istihdam edilebilir ALS ve kanser kaşeksi. Ayrıca, hangi Atrofi önlemek veya hipertrofisi neden müdahalelerin etkinliğini de tabi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Boettcher Vakfı ve amyotrofik Lateral skleroz Derneği (#17-II-344) bu araştırma verdikleri destek için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, dilute to 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
