Summary
Этот протокол был разработан для количественного определения компонентов микроокружения опухоли при резекциях пациентов с глиобластомой с использованием хромогенной иммуногистохимии и ImageJ.
Abstract
С ростом интереса к микроокружению опухоли мы приступили к разработке метода специфического определения компонентов микроокружения в образцах пациентов глиобластомы, самого смертоносного и самого инвазивного рака мозга. Не только количественные методы полезны для точного описания пораженных тканей, но также могут потенциально способствовать более точному прогнозу, диагностике и разработке систем и заменяемых тканей. В глиобластоме глиальные клетки, такие как микроглия и астроциты, независимо коррелируют с плохим прогнозом, основанным на классификации патологоанатомов. Однако состояние этих клеток и других компонентов глиальных клеток не было хорошо описано количественно. Это может быть затруднено из-за больших процессов, которые отмечают эти глиальные клетки. Кроме того, большинство гистологических анализов сосредоточено на общей выборке ткани или только в пределах основной массы опухоли, в отличие от определения количественных показателей на основе областейHin сильно гетерогенной ткани. Здесь мы описываем метод идентификации и количественного анализа популяций глиальных клеток в объемной опухолевой области и смежных областях резекции опухоли у пациентов с глиобластомой. Мы использовали хромогенную иммуногистохимию для идентификации популяций глиальных клеток в резекциях опухолей пациентов и ImageJ для анализа процентного покрытия окрашивания для каждой глиальной популяции. С помощью этих методов мы можем лучше описать глиальные клетки во всех областях микроокружения опухоли глиомы.
Introduction
Глиобластома (ГБМ), наиболее распространенный и злокачественный рак головного мозга, характеризуется очень диффузной инвазией от основной опухолевой массы в окружающую здоровую паренхиму головного мозга 1 , 2 . Это диффузное вторжение делает опухоль особенно трудной для резекции полностью, а инвазивные раковые клетки, которые остаются после терапии, являются наиболее распространенной причиной неизбежного рецидива 2 , 3 , 4 . Ранее мы обнаружили, что ингибирование инвазии диффузной глиомы является терапевтически полезным 5 , однако мало известно о сложных механизмах, способствующих вторжению GBM. Микроокружение опухоли или ткань, окружающая рак, были вовлечены в прогрессирование опухолей при множественных раковых заболеваниях 6 , 7 . Микроокружение опухоли глиобластомы, pСуставная, относительно недостаточно охарактеризована и является уникальным комплексом, состоящим из множественных глиальных клеток, таких как астроциты, микроглия и олигодендроциты, а также внеклеточный матрикс, растворимые факторы и биофизические факторы. Экспериментально показано, что астроциты и микроглия увеличивают прогрессию глиомы и инвазию 8 , 9 , 10 , но состав всех глиальных клеток в нативной микросреде мозга человека неизвестен.
Ранее мы показали, что микроэкологические компоненты могут предсказать выживаемость пациентов путем количественного анализа клеточных компонентов микроокружности глиобластомы и включения нашего анализа в модель пропорциональных рисков 11 . Здесь мы описываем метод количественного анализа для идентификации популяций глиальных клеток в объеме опухоли и смежных областях резекции опухоли от пациента глиобластомыs. Мы использовали хромогенную иммуногистохимию для идентификации популяций глиальных клеток и ImageJ для анализа процентного покрытия окрашивания для каждой глиальной популяции. Оценка процентного охвата создает простое измерение для определения морфологических различий клеток, особенно тех, которые затронуты взаимодействием с раковыми клетками. В предыдущих исследованиях для количественного определения гистопатологического окрашивания использовали стандартное окрашивание, такое как гематоксилин и эозин 12, или трихром 13 Массон, которые не используют специфичность окрашивания иммуногистохимическим антителом на основе антител. Наш метод был разработан для непосредственного количественного определения популяций глиальных клеток в резекциях опухоли глиобластомы, которые мы стремимся использовать для выяснения сложной микроокружности глиобластомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол идентифицирует клеточные компоненты в образцах, прикрепленных к формалину, прикрепленным к парафину (FFPE), что характерно для образцов клинических пациентов с бандитом. Вставка парафинов позволяет наилучшим образом поддерживать морфологию клеток и тканей, а также улучшает долговечность секций. Образцы, используемые для этого анализа, были доступны через Биорезистор Университета Вирджинии и Исследовательский центр тканей. Образцы пациентов были отобраны невропатологом на основе окончательного диагноза глиобластомы (астроцитомы, IV степени ВОЗ), которые завершили резекцию опухолей в Университете Вирджинии в период с 2010 по 2013 год и были деидентифицированы до этого анализа 11 .
1. Депарафинизация и регидратация образцов FFPE
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта часть протокола относится к образцам FFPE. В то время как образцы, встроенные в парафин, могут быть более полезными для этого анализа из-за сохранения клеточного и tМорфологию выпуска, этот анализ также может быть выполнен с замороженными разделами. При использовании замороженных секций эту часть можно опустить и перейти непосредственно к хромогенной иммуногистохимии.
- Выполните следующие промывки по 5 мин каждый: ксилол, ксилол, 100% этанол, 100% этанол, 95% этанол, 95% этанол, 70% этанол, деионизированная вода, деионизированная вода
2. Получение антигена
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта часть протокола необходима для разрушения метиленовых мостиков, образующихся при фиксации формалином образцов FFPE, и выявления сайтов антигена для связывания антител.
- Разбавьте раствор анти-антигена с высоким значением pH на основе Tris по рекомендации производителя в дистиллированной воде.
- Выполните функцию опосредованного теплом антигена, используя микроволновую печь. Также достаточно было бы использовать другие формы опосредованного теплом поиска (такие как скороварка, растительный паром или кипящая вода).
- Добавьте разбавленный раствор для разоблачения в герметичную микроволновую печьсудно. Поместите слайды в сосуд. Поместите слайды в микроволновую печь.
- Кипятите в течение 20 мин при высокой мощности. Контролируйте уровни жидкости для испарения и по мере необходимости пополняйте дистиллированной водой.
- Дайте образцам остыть в растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Хромогенная иммуногистохимия
- Проведите образец ткани с помощью гидрофобного пера, чтобы свести к минимуму объем реагентов, необходимых для покрытия образца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно держите образцы тканей гидратированными и не дайте им высохнуть, так как это повлияет на эффективность окрашивания. - Раствор достаточного количества проницаемости для растворения (трис-буферный солевой раствор (TBS) + 0,01% Triton-X) для покрытия образца ткани (обычно около 100-200 мкл).
- Удалите и отбросьте решение и повторите шаг 3.2.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре с помощью блокирующего раствора (2,5% раствора лошадиной сыворотки + пермеабилизирующий раствор).
- Инкубируйте образцы в течение ночи в 4 ºC с разведенными первичными антителамиВ блокирующем растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ. Все первичные антитела, используемые здесь, разводят при 1: 200, но оптимальные разведения можно определить с помощью серийных разведений, начиная с рекомендации производителя. Подробная информация об антителах, используемых в этом протоколе, была ранее опубликована 11 . - Обнаружение первичных антител с использованием реагента полимера пероксидазы хрена, соответствующего животному-хозяину первичного антитела, по протоколу производителя.
- Пипет достаточно для решения проницаемости для покрытия образца ткани и инкубировать в течение 5 мин.
- Удалите и отбросьте решение и повторите шаг 3.7.
- Инкубировать слайды в 0,3% H 2 O 2 в 1x TBS в течение 15 мин.
- Разработайте образцы с субстратом пероксидазы диаминобензидина (DAB) в течение 2-10 минут до достижения желаемой интенсивности пятен.
- Противоположные образцы для идентификации ядер клеток, таких как гематоксилин, по протоколу производителя.
- Образцы дегидрата со 100%Этанола и ксилола.
- Постоянно монтируйте образцы с помощью монтажных сред.
4. Идентификация регионов
- Изображения слайдов под яркой полевой микроскопией, способной к изображениям с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте изображения сотовых компонентов с разрешением не менее 20 раз. - Переместите камеру в определенные области, представляющие интерес, во всех образцах тканей.
- Сохраняйте изображения как файлы TIFF для количественной оценки.
5. Анализ изображений
- Открывайте изображения в ImageJ для количественного определения процентного охвата.
- Используйте плагин Threshold Color, чтобы удалить фиолетовый цвет из окрашенных гематоксилином ядер.
- Преобразование изображения в 8 бит.
- Добавьте порог без темного фона.
- Образ процесса с использованием одного из 17 предварительно загруженных пороговых фильтров ImageJ ( т.е. MaxEntropy), поэтому в порог включены только окрашенные в DAB части.
ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите оптимальный предварительно загруженный пороговый фильтр, который минимизируетВключение фонового окрашивания. Это может зависеть от качества окрашивания и специфичности антител. Используйте один и тот же порог для всех технических повторений в каждом образце пациента. - Применить порог.
- Измерьте процентную область порогового изображения.
- Среднее процентное покрытие территории для нескольких регионов в каждом образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для этого анализа были выявлены две области интересов в наших опухолевых резекциях - первичной опухолевой массе и смежных областях, в основном состоящих из здоровой ткани с диффузными инвазивными раковыми клетками ( фиг. 1A , 1B ) - с помощью сотрудничающих невропатологов на фоне гематоксилинов и окрашенных эозином пациентов образцы. В каждом образце пациента было идентифицировано положительное окрашивание астроцитов ( фиг. 1C ), микроглия ( фиг. 1D ) и олигодендроциты ( фиг. 1E ) с помощью хромогенной иммуногистохимии. Эти популяции идентифицировали с использованием первичных антител ALDH1L1, Iba1 и олигодендроцитарного специфического белка (OSP1) соответственно 11 . Рекомендуется оптимизация разведений антител, а также консультации с протоколами производителя, чтобы подтвердить, что окрашивание является точным и положительным ( Рисунок 2 ). Например, мы провели окрашивание без первичного антитела для отрицательного контроля ( рис. 2А ), рекомендованного изготовителя ( рис. 2В ) и дальнейших разведений ( рис. 2С , 2D ) до осаждения на разбавление 1: 200 ( рисунок 2С ) из-за Оптимальное позитивное окрашивание тела клетки и процессов с минимизацией фона для анти-ALDH1L1-антитела.
Используя ImageJ, процентное покрытие окрашивания ОСП1 + олигодендроцитов было количественно оценено, чтобы в конечном итоге сравнить различия в наших регионах, представляющих интерес ( рис. 3А ). Мы удалили встречные ядра из изображения, используя плагин Threshold Color, чтобы полностью оценить положительное окрашивание DAB ( рисунок 3B ). После преобразования изображения в 8 бит (Ss = "xfig"> Рисунок 3C), мы применили порог по умолчанию MaxEntropy к оставшемуся положительному окрашиванию DAB ( рисунок 3D ). Здесь мы использовали порог MaxEntropy по умолчанию, потому что этот конкретный порог по умолчанию лучше всего зафиксировал наше положительное пятно при минимизации фона, но для обеспечения анализа интересующей популяции можно использовать разные пороговые значения. Как только соответствующий порог будет применен к изображению ( рис. 3Е ), процентное покрытие от порога можно измерить ( рис. 3F ) и сравнить для нескольких пациентов. Здесь мы подсчитали 3 - 5 областей в пределах каждого интересующего региона в зависимости от общей площади интересующего региона и сравнили группы, используя парные t-тесты с программным обеспечением GraphPad Prism. Мы также сравнили наши анализы GBM с соответствующим окрашиванием, обнаруженным в здоровой ткани головного мозга в базе данных Protein Atlas ( рисунок 3F ). В нашем В предыдущей публикации мы использовали этот анализ для нескольких микроэнвриментальных компонентов (астроцитов, микроглии, олигодендроцитов и кровеносных сосудов) у 33 пациентов для разработки модели пропорциональных рисков для прогнозирования общей выживаемости пациентов 11 .
Рисунок 1 : Сравнение смежных областей опухоли и опухолей соседних регионов для глиальных клеток.
A) Образец всей опухоли у пациента 63, окрашенного гематоксилином и эозином, с указанием объемных и смежных областей. B) окрашивание гематоксилином и эозином, C) ALDH1L1 + астроциты, D) Iba1 + microglia и E) олигодендроцитарный специфический белок-1 (OSP1) + олигодендроциты. Шкала шкалы = 100 мкм. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Пример титрования антитела против ALDH1L1.
A) Отрицательный контроль, B) 1:70 рекомендация производителя от разбавления со склада, C) разведение 1: 200 со склада и D) разведение 1: 400 со склада. Разведение 1: 200 использовали для окрашивания и анализа за счет оптимального позитивного окрашивания тела клетки и процессов с минимизацией фона. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Jpg "/>
Рисунок 3 : ImageJ Анализ и количественное определение площади покрытия для олигодендроцитов.
A) Оригинальное OSP1 + окрашивание пациента 52. B) Удаление пурпурных ядер с использованием Threshold_Colour плагина. C) Преобразование в 8 бит. D) Максимальный порог захвата и E) применяется для минимизации фонового окрашивания. F) Сравнение смежных и объемных областей в пяти образцах пациентов, а также здоровой ткани головного мозга через Протеиновый атлас для покрытия OSP1 +%. *** p <0,001, **** p <0,0001 через парные t-тесты. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предлагаемый нами метод представляет собой количественный подход к анализу гистологических образцов, окрашенных с использованием традиционной хромогенной иммуногистохимии. Текущая методология для такого типа анализа включает в себя аналогичные протоколы окрашивания, за которыми следует сортировка независимыми патологоанатомами. Этот метод является надежным, но для ряда применений требуется более точное понимание клеточного состава, например, лучшее понимание гетерогенности, связанной с опухолями, и точная рекапитуляция опухолей для исследований in vitro.
Этот протокол демонстрирует простой метод количественного анализа популяций глиальных клеток в микроокружении опухоли головного мозга. Этот метод широко адаптируется и может быть расширен, чтобы идентифицировать многие другие компоненты микроокружения, такие как кровеносные сосуды, хемокины и т. Д., А также другие виды рака, такие как грудь или поджелудочная железа, где резекция опухоли может иметьБолее крупные паренхимные области. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для получения других измерений, таких как подсчеты и периметр клеток для оценки формы клеток, а также более сложные морфологические результаты изотропии, кластеризации, ориентации и т. Д. Эти методы также не ограничиваются раком, поскольку эти методы окрашивания и количественного определения могут быть использованы для любых анализов головного мозга, как показано в нашей количественной оценке здорового тканевого атласа белка, а также в нашем ранее опубликованном сравнении с эпилептической мозговой тканью 11 .
Критические шаги в этом протоколе включают правильную инкубацию и развитие хромогенного вторичного. Следует проявлять осторожность, чтобы хромогенный краситель не перерабатывался. Это затруднит дифференциацию положительного окрашивания и фона. Время разработки варьируется в зависимости от используемого реагента субстрата и сродства первичного антитела. Мы используем яркое полеМикроскопии для мониторинга развития для обеспечения оптимального окрашивания при минимизации фонового окрашивания. После окрашивания правильное пороговое значение во время анализа может помочь дифференцировать фон от положительного окрашивания. Основным ограничением для этого метода является невозможность окрашивать несколько компонентов в один и тот же образец ткани из-за использования развития хромогенного окрашивания. Иммунофлуоресцентный анализ можно проводить аналогичным образом, но требует модификации инструментов, обсуждаемых в этом методе.
Для глиобластомы характерен ряд маркеров и клеточных пятен, которые были использованы для анализа образцов пациентов. К ним относятся IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 в качестве прогностических маркеров, а также CD11b и CD45 для микроглии и макрофагов 18 , 19 . Наш метод расширяет этот тип анализаК клеточному микроокружению, часто упускаемому из виду компоненту микроокружения опухоли в глиобластоме. Исследования изучали присутствие и плотность микроглии в опухолях 20 , 21 , 22, а также вклад астроцитов 9 , 23 , 24 . Здесь мы разработали протокол, изучающий все глиароциты, микроглии и олигодендроциты - в микроокружении опухоли головного мозга, и чтобы дифференцировать смежные или инвазивные области опухоли от объема опухоли, в которой маркеры обычно идентифицируются в этих опухолях. Делая это, мы считаем, что мы можем более точно оценить ситуацию с пациентом, потому что мы определили внутрипатентную гетерогенность, и наша предыдущая публикация показала, что анализ этих местоположений и включение в статистические модели сильнее при прогнозировании результатов, чем в любом местоположенииNe или общие образцы 11 . Кроме того, поскольку инвазия глиобластомы настолько рассеянна, что затрудняет резюмировать полностью 1 , 2 , мы полагаем, что ткань в смежных областях более характерна для инвазивной ткани, оставленной после резекции, что способствует неизбежному рецидиву. Поэтому лучшее понимание соседних регионов может дать больше информации о рецидиве заболевания и планировании лечения пациентов, в отличие от традиционно изученной объемной ткани, которая решается перед терапией у пациентов с глиобластомой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никто.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность докторам. Фахад Бафаки и Джим Манделл для получения и идентификации образцов пациентов Гарретта Ф. Бигли для оказания помощи в иммуногистохимии, а также в Исследовательском учреждении по биоресурсам и тканям, сердечнике гистологического центра сердечно-сосудистых исследований и в Институте биомолекулярного анализа в Университете Вирджинии за помощью Взятие образцов, иммуногистохимия и визуализация.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
