Summary
פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.
Abstract
עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.
Introduction
Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא 1 , 2 . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת 2 , 3 , 4 . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית 5 , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן 6 , 7 . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ 'ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה 8 , 9 , 10 , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע.
הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים 11 . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin 12 או Trichrome 13 של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מזהה רכיבים סלולריים דגימות פרפין קבוע מוטבע (FFPE) מוטבע (FFPE), כפי אופייני לדגימות המטופלים קליניים. הטבעה פרפין מאפשר תחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה הסלולר והרקמות, כמו גם יש אריכות ימים טובה יותר של חלקים. הדגימות המשמשות ניתוח זה היו לגשת דרך אוניברסיטת וירג 'יניה Biorepository ו מחקר רקמות מתקן. דגימות החולה נבחרו על ידי נוירופתולוג המבוסס על אבחנה סופית של גלובלסטומה (אסטרוציטומה, WHO דרגה IV), אשר סיימה את תהליך החזרת הגידול באוניברסיטה של וירג'יניה בין השנים 2010 ו -2013, וזוהו לפני ניתוח זה 11 .
1. FFPE דוגמה Deparaffinization ו התייבשות
הערה: חלק זה של הפרוטוקול הוא ספציפי דגימות FFPE. בעוד דגימות paraffin- מוטבע יכול להיות שימושי יותר עבור ניתוח זה בגלל שימור של תאים סלולריים ו- Tנושא מורפולוגיה, ניתוח זה יכול להיעשות גם עם חלקים קפואים. אם באמצעות מקטעים קפואים, חלק זה יכול להיות מושמט ולהמשיך ישירות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית.
- בצע את שוטף הבא 5 דקות כל: Xylene, קסילן, אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, מים deionized, מים deionized
2. אחזור אנטיגן
הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש צורך לשבור גשרים מתילן נוצר במהלך קיבעון פורמלין של דגימות FFPE ולחשוף אתרי אנטיגן עבור נוגדנים לאגד.
- לדלל טריס מבוסס גבוה pH אנטיגן מסיר פתרון על המלצה היצרן במים מזוקקים.
- בצע אחזור אנטיגן בחום באמצעות מיקרוגל. צורות אחרות של אחזור בתיווך חום (כגון סיר לחץ, סיר אדים או מים רותחים) יספיקו גם הם.
- מוסיפים את פתרון מסיר מדולל לתוך מיקרוגל לא חתוםכְּלִי שַׁיִט. המקום שקופיות לתוך כלי. המקום שקופיות לתוך מיקרוגל.
- מרתיחים במשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. לפקח על רמות נוזלים על אידוי, וכן לחדש עם מים מזוקקים לפי הצורך.
- אפשר דגימות להתקרר פתרון עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
3. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית
- מדגם רקמות מתאר עם עט הידרופובי כדי למזער נפח של ריאגנטים הדרושים כדי לכסות מדגם.
הערה: הקפד לשמור על דגימות רקמות hydrated ולא נותנים להם להתייבש כמו זה ישפיע על יעילות מכתים. - פתרון pipet מספיק permeabilization (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) + 0.01% Triton-X) כדי לכסות מדגם רקמות (בדרך כלל על 100-200 μL).
- הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.2.
- דגירה דגימות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת (פתרון הסרום 2.5% + פתרון permeabilization).
- דגירה דגימות לילה 4 מעלות צלסיוס עם נוגדנים ראשוניים בדילולב חסימת פתרון.
הערה: כל נוגדנים ראשוניים המשמשים כאן הם מדולל ב 1: 200, אבל דילולים אופטימלי ניתן לקבוע באמצעות דילולים סדרתי החל עם המלצה היצרן. מידע מפורט על נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה פורסם בעבר 11 . - זיהוי נוגדנים ראשוניים באמצעות חזרת peroxidase פולימדיאז מגיב המקביל עם החיה המארח העיקרי נוגדן, בעקבות פרוטוקול היצרנים.
- פיפטה פתרון permeabilization מספיק כדי לכסות מדגם הרקמה ו דגירה במשך 5 דקות.
- הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.7.
- דגירה שקופיות 0.3% H 2 O 2 ב 1x TBS במשך 15 דקות.
- לפתח דגימות עם dixinobenzidine peroxidase (DAB) המצע עבור 2 - 10 דקות עד עוצמת הכתם הרצוי מושגת.
- דגימות Counterstain לזהות גרעיני תאים, כגון עם hematoxylin, בעקבות פרוטוקול היצרן.
- מייבשים דגימות עם 100%אתנול וקסילן.
- הר דגימות לצמיתות עם התקשורת הרכבה.
4. אזורים של זיהוי אינטרסים
- שקופיות תמונה תחת מיקרוסקופ brightfield מסוגל תמונות ברזולוציה גבוהה.
הערה: השתמש ברכיבים סלולריים להדמיה ברזולוציה של 20x לפחות. - העבר מצלמה לאזורים ספציפיים של עניין בכל דגימות הרקמה.
- שמור תמונות כקובצי TIFF לכימות.
5. ניתוח תמונה
- פתח תמונות ב- ImageJ לכימות של כיסוי אחוזים.
- השתמש תוסף צבע הסף כדי להסיר צבע סגול מן הגרעיני hematoxylin מוכתם.
- המרת תמונה ל -8 סיביות.
- הוסף סף ללא רקע כהה.
- תהליך התמונה באמצעות אחד 17 טעון מראש מסננים סף ImageJ ( כלומר MaxEntropy) כך רק DAB מנות מוכתמות כלולים בסף.
הערה: בחר את מסנן הסף האופטימלי מראש ש - minimizהכללה של מכתים רקע. זה יכול לסמוך על איכות מכתים וספציפיות של נוגדנים. השתמש באותו סף עבור כל משכפל טכני בתוך כל מדגם המטופל. - החלת סף.
- מדוד את אזור האחוזים של התמונה הסופית.
- ממוצע אזור כיסוי כיסוי עבור אזורים מרובים בתוך כל מדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לצורך ניתוח זה, זוהו שני אזורים של אינטרסים בגידולים שלנו - הגידול העיקרי של הגידול והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמות בריאות עם תאים סרטניים פולשים פולשים ( איור 1 א ' , 1 ב' ) - זוהו על ידי נוירופתולוגים משתפי פעולה על hematoxylin ו- eosin דגימות. בתוך כל מדגם המטופל, מכתים חיובי עבור האסטרוציטים ( איור 1C ), microglia ( איור 1D ), ו oligodendrocytes ( איור 1E ) באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית זוהה. אוכלוסיות אלה זוהו באמצעות נוגדנים ראשוניים ALDH1L1, Iba1, ו Oligodendrocyte ספציפי חלבון (OSP1) בהתאמה 11 . אופטימיזציה של דילולים נוגדנים מומלץ, כמו גם התייעצות עם פרוטוקולי היצרן כדי לאשר אם מכתים היא מדויקת וחיובית ( איור 2 ). לדוגמה, ביצענו מכתים ללא נוגדן העיקרי עבור שליטה שלילית ( איור 2 א ), היצרן מומלץ ( איור 2 ב ), ו דילולים נוספים ( איור 2 ג , 2 ד ) לפני ההתיישבות על דילול 1: 200 ( איור 2 ג ) בשל מכתים חיובי אופטימלי של הגוף התא ותהליכים עם מזעור רקע נוגדן אנטי ALDH1L1.
באמצעות ImageJ, את אחוז כיסוי OSP1 + oligodendrocyte מכתים היה לכמת בסופו של דבר להשוות הבדלים באזורים שלנו של עניין ( איור 3 א ). הסרנו את הגרעינים counterstained מן התמונה באמצעות תוסף צבע סף כדי להעריך אך ורק את מכתים DAB חיובי ( איור 3 ב ). לאחר המרת התמונה ל 8bit (Ss = "xfig"> איור 3 ג), אנו מכן להחיל את סף ברירת המחדל MaxEntropy כדי הנותרים DAB חיובי מכתים ( איור 3D ). כאן, השתמשנו סף ברירת המחדל MaxEntropy כי זה ברירת מחדל סף הטוב ביותר שנתפסו כתם חיובי שלנו תוך מזעור רקע, אבל ספים שונים ניתן להשתמש כדי להבטיח ניתוח של האוכלוסייה של עניין. לאחר סף המתאים הוחל על התמונה ( איור 3E ), את אחוז כיסוי הסף ניתן למדוד ( איור 3F ) בהשוואה לחולים מרובים. כאן, אנו לכמת 3 - 5 אזורים בתוך כל אזור של עניין, בהתאם לאזור הכולל של האזור של עניין, והשווה קבוצות באמצעות זווגות בדיקות עם תוכנת GraphPad פריזמה. השוונו גם את הניתוחים שלנו עם GBM עם מכתים המתאימים שנמצאו ברקמת מוח בריאה במאגר אטלס חלבון ( איור 3F ). בשלנו פרסום קודם, השתמשנו בניתוח זה עבור רכיבים microenvrionmental מרובים (astrocytes, microglia, oligodendrocytes וכלי דם) על פני 33 חולים לפתח מודל סיכונים יחסיים לניבוי הישרדות החולה הכולל 11 .
איור 1 : השוואה של הגידול בתפוצה רחבה וגידול אזורים קרובים של עניין עבור תאים גליה.
א) מדגם הגידול כולו מהחולה 63 מוכתם hematoxylin ו eosin עם בתפזורת אזורים סמוכים ציין. ב) Hematoxylin ו eosin מכתים, C) ALDH1L1 + astrocytes, D) Iba1 + microglia, ו- E) Oligodendrocyte ספציפי חלבון 1 (OSP1) + oligodendrocytes. סולם בר = 100 מיקרומטר. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : דוגמה טיטרציה של נוגדן אנטי-ALDH1L1.
א) שליטה שלילית, ב) 1:70 דילול המלצת היצרן מהמלאי, ג) דילול 1: 200 מהמלאי, ו D) דילול 1: 400 מהמלאי. דילול 1: 200 שימש מכתים וניתוח בשל מכתים חיובי אופטימלי של גוף התא ותהליכים עם מזעור רקע. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Jpg "/>
איור 3 : ניתוח ImageJ וכימות כיסוי שטח עבור Oligodendrocytes.
א) מקורי OSP1 + מכתים של המטופל 52. ב) הסרת גרעינים סגולים באמצעות תוסף Threshold_Colour. ג) המרה ל 8bit. D) MaxEntropy סף שנתפסו E) להחיל על צמצום מכתים ברקע. F) השוואה של אזורים סמוכים ו בכמות גדולה בחמישה דגימות של מטופלים, כמו גם רקמת מוח בריאה באמצעות אטלס חלבון, עבור כיסוי OSP1 + אחוזים. *** p <0.001, **** p <0.0001 באמצעות בדיקות t משויכות. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, נדרשת הבנה מדויקת יותר של האיפור הסלולרי, כגון הבנה טובה יותר של ההטרוגניות הקשורה בגידולים וסיכום מדויק של גידולים למחקרים חוץ גופית.
פרוטוקול זה מדגים טכניקה פשוטה עבור כמותי ניתוח אוכלוסיות של תאים גליה בתוך microenvironment הגידול במוח. טכניקה זו ניתנת להתאמה רחבה וניתנת להרחבה על מנת לזהות רכיבים רבים אחרים של המיקרו-סביבה, כגון כלי דם, כימוקינים ועוד, וכן סוגי סרטן אחרים, כגון השד או הלבלב, שבהם ניתן לבצע את הניתוחים של הגידולאזורי פרנכימלים גדולים יותר. יתר על כן, טכניקה זו ניתן להתאים לרכוש מדידות אחרות, כגון סעיפים, ואת היקף התאים כדי להעריך את צורת התא, כמו גם המורפולוגיה המורכבת יותר תוצאות איזוטרופיה, אשכולות, אוריינטציה, ועוד. טכניקות אלה אינן מוגבלות גם לסרטן, שכן ניתן להשתמש במתודולוגיות אלה של צביעה וכמות כדי לבצע ניתוחי מוח, כפי שהוכח בכמות המייצרת של פרוטאין אטלס של הרקמה הבריאה, וההשוואה הקודמת שלנו עם רקמות מוח אפילפטיות 11 .
צעדים קריטיים במסגרת פרוטוקול זה כוללים הדגירה נכונה ופיתוח של המשני chromogenic. יש להקפיד כך שצבע הכרומוגנים לא יתפתח יתר על המידה. זה יקשה על ההבחנה בין מכתים חיובי רקע. זמן הפיתוח משתנה בהתאם מגיב המצע בשימוש ואת זיקה של הנוגדן העיקרי. אנו משתמשים בשדה בהירמיקרוסקופיה כדי לפקח על הפיתוח כדי להבטיח מכתים אופטימלי תוך צמצום מכתים ברקע. לאחר מכתים, סף תקין במהלך הניתוח יכול לעזור להבדיל רקע מכתים חיובית. המגבלה העיקרית עבור שיטה זו היא חוסר יכולת מרכיבים מרובים כתם בתוך מדגם הרקמה אותו בשל השימוש בפיתוח מכתים כרומוגנית. ניתוח אימונופלורסנציה יכול להתבצע באופן דומה, אך דורש שינוי של כלים דנו בשיטה זו.
ספציפית גליובלסטומה, ישנם מספר סמנים וכתמים הסלולר אשר שימשו כדי לנתח דגימות החולה. אלה כוללים IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 כמו סמנים פרוגנוסטיים, כמו גם CD11b ו CD45 עבור microglia ומקרופאגים 18 , 19 . השיטה שלנו מרחיבה סוג זה של ניתוחכדי microenvironment הסלולר, מרכיב להתעלם לעתים קרובות של microenvironment הגידול ב glioblastoma. מחקרים בחנו נוכחות מיקרוגליה וצפיפות בגידולים 20 , 21 , 22 וכן תרומות של האסטרוציטים 9 , 23 , 24 . כאן פיתחנו פרוטוקול הבוחן את כל הגליה - אסטרוציטים, מיקרוגליאה ואוליגודנדרוציטים - בגידול של המיקרו-סביבה של הגידול במוח, וכדי להבדיל בין האזורים הסמוכים או הפולשניים של הגידול מהכמות הגדולה של הגידול, שבה מסומנים בדרך כלל בגידולים אלה. בעשותנו זאת, אנו מאמינים שאנו יכולים להעריך בצורה מדויקת יותר את מצב המטופל, משום שקבענו הטרוגניות בין המטופלים והפרסום הקודם שלנו הראה כי ניתוח של מיקומים אלו והכללה במודלים סטטיסטיים הוא חזק יותר בעת ניבוי תוצאות מאשר במיקומים אלוNe או דוגמאות כלליות 11 . יתר על כן, מאז הפלישה glioblastoma הוא מפוזר כל כך, מה שהופך את זה קשה לעקור לחלוטין 1 , 2 , אנו מאמינים הרקמה באזורים הסמוכים מייצג יותר של הרקמה הפולשנית שהושארו אחרי כריתה, מה שגורם להישנות בלתי נמנעת. לכן, הבנה טובה יותר של האזורים הסמוכים עשויה לספק מידע נוסף על הישנות המחלה והתכנון הטיפול בחולה, בניגוד לרקמה בתפזורת שנחקרה באופן מסורתי, שנכרתה לפני הטיפול בחולי גליובלסטומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר. פאהד באפאקיה וג'ים מנדל על רכישת וזיהוי דגימות החולה, גארט פ'ביילי לעזרה עם אימונוהיסטוכימיה, וכן מאגר ביאורוספטורי ומחקר מחקר רקמות, המרכז לחקר הלב וכלי הדם במרכז ההיסטולוגיה ומכון המחקר ביומולקולרי באוניברסיטה של וירג'יניה. רכישת מדגם, אימונוהיסטוכימיה, והדמיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
