Summary
该方案被开发用于使用显色免疫组织化学和ImageJ定量鉴定成胶质细胞瘤患者切除中的肿瘤微环境成分。
Abstract
随着对肿瘤微环境的兴趣越来越大，我们着手开发一种方法，专门确定患者胶质母细胞瘤，最致命和最具侵袭性脑癌患者样本中的微环境成分。不仅定量方法有利于准确描述患病组织，而且还可能有助于更精确的预后，诊断和组织工程系统和替代品的发展。在胶质母细胞瘤中，胶质细胞，如小神经胶质细胞和星形胶质细胞，与病理学家分级的不良预后独立相关。然而，这些细胞和其他神经胶质细胞成分的状态在定量上尚未得到很好的描述。由于标记这些胶质细胞的大过程，这可能是困难的。此外，大多数组织学分析集中在整体组织样本或仅在大部分肿瘤内，而不是基于区域的划分量化在高度异质的组织。在这里，我们描述了一种用于鉴定和定量分析来自成胶质细胞瘤患者的肿瘤切除肿瘤体积和相邻区域内的神经胶质细胞群体的方法。我们使用显色免疫组织化学来鉴定患者肿瘤切除术和ImageJ中的胶质细胞群，以分析每个胶质细胞群体的染色百分比。通过这些技术，我们能够更好地描述胶质瘤肿瘤微环境区域的神经胶质细胞。
Introduction
成胶质细胞瘤（GBM），最常见的恶性脑肿瘤，从初级肿瘤主体，其特征在于高度扩散侵入周围健康脑实质1,2。此漫入侵使得肿瘤尤其难以完全切除，并且保持治疗后入侵癌细胞是不可避免的复发2，3，4中的最常见的原因。以前，我们发现抑制弥漫性胶质瘤细胞侵袭是治疗有益的5 ，但是对于有助于GBM入侵的复杂机制知之甚少。肿瘤微环境中，或组织中癌症周围，已牵涉于肿瘤的进展在多种癌症6,7。胶质母细胞瘤肿瘤微环境，关节炎，相对低于特征，是独特复杂的，由多种胶质细胞组成，如星形胶质细胞，小神经胶质细胞和少突胶质细胞，以及细胞外基质，可溶性因子和生物物理因素。在实验上，星形胶质细胞和小胶质细胞已被证明能增加神经胶质瘤进展和侵袭8，9，10，但所有的神经胶质细胞中的天然人脑微环境中的组合物是未知的。
我们以前显示微环境成分可以通过定量分析胶质母细胞瘤微环境的细胞成分并将我们的分析纳入比例风险模型来预测患者存活11 。在这里，我们描述了定量分析方法，用于鉴定胶质母细胞瘤患者肿瘤切除肿瘤体积和相邻区域内胶质细胞的数量秒。我们使用显色免疫组织化学来鉴定胶质细胞群和ImageJ，以分析每个胶质细胞群体的染色百分比。评估百分比覆盖率创建一个简单的测量来确定细胞的形态学差异，特别是那些受癌细胞相互作用影响的细胞。以前的定量组织病理学染色的研究使用标准染色，如苏木精和曙红12或Masson的三色染色体13 ，其不利用基于抗体的免疫组织化学染色的特异性。我们的方法被开发直接量化胶质母细胞瘤患者肿瘤切除术中的胶质细胞群，我们旨在阐明复杂胶质母细胞瘤微环境。
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Protocol
该方案鉴定了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中的细胞组分，如同样的临床患者样本。石蜡包埋允许细胞和组织形态的最佳维持以及具有更好的切片寿命。用于该分析的样品通过弗吉尼亚大学生物原理和组织研究设施进行访问。根据2010年至2013年在弗吉尼亚大学完成肿瘤切除术的胶质母细胞瘤（星形细胞瘤，WHO IV级）的确定性诊断，由神经病理学家选择患者样本，并在该分析之前被去除11 。
FFPE样品脱蜡和再水化
注意：该协议的这一部分是针对FFPE样本的。而石蜡包埋的样品由于保留细胞和t而可能对这一分析更有用问题形态，这个分析也可以用冻结部分完成。如果使用冷冻切片，该部分可以省略，直接进行显色免疫组织化学。
- 进行以下洗涤5分钟：二甲苯，二甲苯，100％乙醇，100％乙醇，95％乙醇，95％乙醇，70％乙醇，去离子水，去离子水
2.抗原检索
注意：该方案的这一部分是破坏FFPE样品福尔马林固定期间形成的亚甲基桥所必需的，并暴露抗原位点以进行结合。
- 稀释Tris型高pH抗原揭示溶液，制造商推荐在蒸馏水中。
- 使用微波进行热介导的抗原检索。其他形式的热介导回收（如压力锅，蔬菜蒸笼或沸水）也足够了。
- 将稀释后的未曝光溶液加入非密封微波炉中船只。将幻灯片放入血管。将幻灯片放入微波炉。
- 在大功率下煮20分钟。监测液体的蒸发量，并根据需要用蒸馏水补充。
- 使样品在室温下在溶液中冷却1小时。
3.显色免疫组织化学
- 用疏水笔勾画组织样本，以尽量减少覆盖样品所需的试剂体积。
注意：确保保持组织样本的水分，不要让它们变干，因为这会影响染色效果。 - 吸管足够的透化溶液（Tris缓冲盐水（TBS）+ 0.01％Triton-X）以覆盖组织样品（通常约100-200μL）。
- 取出并丢弃溶液并重复步骤3.2。
- 在室温下用封闭溶液（2.5％马血清+透化溶液）孵育样品。
- 在4℃孵育样品过夜，用一级抗体稀释在阻塞解决方案。
注意：此处使用的所有初级抗体均以1:200稀释，但最佳稀释度可用制造商推荐的连续稀释度确定。此协议中使用的抗体的详细信息先前已发布11 。 - 使用与一抗体宿主动物相对应的辣根过氧化物酶聚合物试剂检测一抗，按照制造商方案。
- 吸取足够的透化溶液以覆盖组织样品并孵育5分钟。
- 删除并丢弃解决方案并重复步骤3.7。
- 在1×TBS中的0.3％H 2 O 2中孵育15分钟。
- 用过氧化物酶二氨基联苯胺（DAB）底物开发样品2-10分钟，直到达到所需的染色强度。
- 复制样品以鉴定细胞核，如用苏木精，按照制造商协议。
- 用100％脱水样品乙醇和二甲苯。
- 使用安装介质永久安装样品。
4.利益区域识别
- 图像幻灯片在明场显微镜下能够进行高分辨率图像。
注意：使用成像细胞组分至少20x分辨率。 - 将相机移动到整个组织样本的特定感兴趣区域。
- 将图像保存为TIFF文件进行定量。
图像分析
- 在ImageJ中打开图像以量化百分比覆盖率。
- 使用阈值颜色插件从苏木精染色的核中去除紫色。
- 将图像转换为8位。
- 添加阈值，不带深色背景。
- 使用17个预加载的ImageJ阈值滤波器（ 即 MaxEntropy）中的一个处理图像，因此只有DAB染色部分被包括在阈值中。
注意：选择最小化的最佳预加载阈值过滤器包括背景染色。这可以取决于抗体的染色质量和特异性。对每个患者样本中的所有技术重复使用相同的阈值。 - 应用阈值。
- 测量阈值图像的百分比面积。
- 每个样本中多个区域的平均面积百分比覆盖率。
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Representative Results
对于这一分析，我们的肿瘤切除术中的两个兴趣区域 - 主要肿瘤体积和相邻区域，主要由具有扩散性侵袭性癌细胞的健康组织组成（ 图1A ， 1B ） - 通过合成神经病理学家在苏木精和伊红染色患者样本。在每个患者样品中，通过显色免疫组织化学鉴定了星形胶质细胞（ 图1C ），小胶质细胞（ 图1D ）和少突胶质细胞（ 图1E ）的阳性染色。这些群体分别使用11初级抗体ALDH1L1，Iba1，少突胶质细胞和特异性蛋白（OSP1）标识。推荐优化抗体稀释液，以及咨询制造商协议，以确认染色是否准确和正面 （ 图2 ）。例如，对于阴性对照（ 图2A ），制造商推荐（ 图2B ）和进一步稀释（ 图2C ， 2D ），在进行1：200稀释（ 图2C ）沉淀之前，对细胞体的最佳阳性染色和抗ALDH1L1抗体背景最小化的方法。
使用ImageJ，量化了OSP1 +少突胶质细胞染色的百分比覆盖率，以最终比较我们感兴趣区域的差异（ 图3A ）。我们使用阈值颜色插件从图像中去除了复染的细胞核，以便仅评估阳性DAB染色（ 图3B ）。将图像转换为8位（ss =“xfig”>图3C），我们然后将MaxEntropy默认阈值应用于剩余的正DAB染色（ 图3D ）。在这里，我们使用MaxEntropy阈值默认值，因为这个特定的默认阈值最大程度地捕获了我们的正面污点，同时使背景最小化，但是可以使用不同的阈值来确保对感兴趣的人群的分析。一旦将适当的阈值应用于图像（ 图3E ），可以测量来自阈值的百分比覆盖（ 图3F ），并对多个患者进行比较。在这里，我们根据感兴趣区域的总面积量化每个感兴趣区域内的3 - 5个区域，并使用GraphPad Prism软件对配对t检验进行比较。我们还将我们的GBM分析与蛋白质Atlas数据库中健康脑组织中发现的相应染色进行比较（ 图3F ）。在我们的在以前的出版物中，我们对33名患者中的多种微血管组分（星形胶质细胞，小胶质细胞，少突胶质细胞和血管）进行了分析，以开发出比例风险模型来预测总体患者生存11 。
图1 ：胶质细胞的肿瘤体积和肿瘤相邻区域的比较。
A）来自患者63的整个肿瘤样品用苏木精和曙红染色，具有体积和相邻区域。 B）苏木精和伊红染色， C） ALDH1L1 +星形胶质细胞， D） Iba1 +小胶质细胞，和E）少突胶质细胞特异性蛋白-1（OSP1）+少突胶质细胞。刻度棒=100μm。 25fig1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：抗ALDH1L1抗体的实施例滴定。
A）阴性对照， B） 1:70来自库存的制造商推荐稀释， C）从原料稀释1：200，D）从原料稀释1：400。 1：200稀释用于染色和分析，因为细胞体和过程的最佳阳性染色使背景最小化。刻度棒=100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3 ：少突胶质细胞区域覆盖的ImageJ分析和定量。
A）患者52的原始OSP1 +染色。B）使用Threshold_Colour插件去除紫色核。 C）转换为8bit。 D）捕获的最大熵阈值和E）应用于最小化背景染色。 F）通过蛋白质Atlas对五个患者样本以及健康的脑组织进行相邻和大块区域的比较，用于OSP1 +百分比的覆盖率。 *** p <0.001，**** p <0.0001通过配对t检验。刻度棒=100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们在这里提出的方法是一种定量的方法来分析使用传统的显色免疫组织化学染色的组织学样品。此类分析的现行方法包括相似的染色方案，随后由独立病理学家进行分级。该方法是可靠的，但是对于许多应用，需要更精确地了解细胞构成，例如更好地理解与肿瘤相关的异质性和用于体外研究的肿瘤的准确重现。
该方案证明了用于定量分析脑肿瘤微环境内胶质细胞群体的直接技术。这种技术是广泛适应性的，并且可以被扩展以识别微环境的许多其它组分，例如血管，趋化因子等，以及肿瘤切除术可以具有的其它癌症，例如乳腺或胰腺较大的实质区域。此外，该技术可以适应于获取其他测量，例如细胞的计数和周长以评估细胞形状，以及更复杂的形态学结果各向同性，聚类，取向等。这些技术也不限于癌症，在这些染色和定量方法可用于任何大脑分析，在我们的健康组织的代表蛋白质图集定量证明，我们与癫痫的脑组织11先前公布的比较。
该方案中的关键步骤包括适当的孵育和显色次生的发展。应注意使显色染料不会过度发展。这将使得难以区分阳性染色和背景。显影时间取决于所使用的底物试剂和一抗的亲和力。我们使用明亮的场显微镜监测发展，以确保最佳染色，同时最小化背景染色。染色后，分析过程中适当的阈值可以帮助区分背景与阳性染色。该方法的主要限制是由于使用显色染色发展，不能在同一组织样品内染色多个组分。免疫荧光分析可以以相似的方式进行，但需要修改该方法中讨论的工具。
特异于胶质母细胞瘤，有许多标记和细胞污渍已被用于分析患者样品。这些包括IDH1 14,15，EGFRvIII的16，17作为预后标志物，以及CD11b和CD45为小胶质细胞和巨噬细胞18,19。我们的方法扩展了这种类型的分析到细胞微环境中，胶质母细胞瘤中肿瘤微环境中经常被忽视的成分。有研究看着小胶质细胞的存在和密度在肿瘤20，21，22以及星形胶质细胞9，23，24的贡献。在这里，我们开发了一种在脑肿瘤微环境中检查所有神经胶质细胞，小神经胶质细胞和少突胶质细胞的方案，并将肿瘤的相邻或侵入区域与肿瘤体积进行区分，这是通常在这些肿瘤中鉴定的标志物。通过这样做，我们相信，我们可以更准确地评估患者情况，因为我们确定了患者内异质性，我们以前的出版物显示，这些位置的分析和统计模型的包含在预测结果方面比任何位置alone或整体样品11 。此外，由于胶质母细胞瘤侵袭是如此漫反射，使得难以完全切除1，2，我们认为在相邻区域中的组织是更具有代表性的切除后留下的侵入性组织，这有助于不可避免复发。因此，与在胶质母细胞瘤患者治疗之前切除的传统研究的散装组织相反，更好地了解相邻区域可能会提供有关疾病复发和患者治疗计划的更多信息。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
作者感谢Drs。 Fahad Bafakih和Jim Mandell收购和鉴定患者样本，Garrett F. Beeghly为免疫组化提供帮助，生物制剂和组织研究设施，心血管研究中心组织学核心和弗吉尼亚大学生物分子分析设备协助样本采集，免疫组织化学和成像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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