Summary
Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.
Abstract
Avec l'intérêt croissant pour le micro-environnement de la tumeur, nous nous sommes mis à développer une méthode pour déterminer spécifiquement les composants de micro-environnement dans les échantillons de patients de glioblastome, le cancer du cerveau le plus mortel et le plus invasif. Non seulement les méthodes quantitatives sont-elles bénéfiques pour décrire avec précision les tissus malades, mais peuvent également contribuer à un pronostic plus précis, au diagnostic et au développement de systèmes et de remplacements tissulaires. Dans le glioblastome, les cellules gliales, telles que la microglie et les astrocytes, ont été corrélées indépendamment avec un mauvais pronostic basé sur le classement des pathologistes. Cependant, l'état de ces cellules et d'autres composants des cellules gliales n'a pas été bien décrit de manière quantitative. Cela peut être difficile en raison des grands processus qui marquent ces cellules gliales. En outre, la plupart des analyses histologiques se concentrent sur l'échantillon de tissu global ou seulement dans la masse de la tumeur, par opposition à la délimitation de quantifications basées sur des régionsDans le tissu hautement hétérogène. Ici, nous décrivons une méthode pour identifier et analyser quantitativement les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales des patients atteints de glioblastome. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales dans les résections tumorales des patients et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. Avec ces techniques, nous sommes en mesure de mieux décrire les cellules gliales dans toutes les régions du micro-environnement de la tumeur du gliome.
Introduction
Le glioblastome (GBM), le cancer du cerveau le plus fréquent et le malin, se caractérise par une invasion très diffuse de la masse tumorale primaire dans le parenchyme 1 , 2 du cerveau sain environnant. Cette invasion diffuse rend la tumeur particulièrement difficile à résister pleinement, et les cellules cancéreuses envahissantes qui restent post-thérapeutique sont la raison la plus fréquente pour la récurrence inévitable 2 , 3 , 4 . Auparavant, nous avons constaté que l'invasion de cellules de gliome diffus était bénéfique sur le plan thérapeutique 5 , mais on sait peu de choses sur les mécanismes complexes contribuant à l'invasion GBM. Le micro-environnement tumoral, ou le tissu entourant le cancer, a été impliqué dans la progression des tumeurs dans de multiples cancers 6 , 7 . Le micro-environnement de la tumeur du glioblastome, en pArticulaire, est relativement sous-caractéristique et est exclusivement complexe, composée de cellules gliales multiples, telles que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, ainsi que la matrice extracellulaire, les facteurs solubles et les facteurs biophysiques. D'une manière expérimentale, les astrocytes et la microglie ont montré une augmentation de la progression du gliome et de l'invasion 8 , 9 , 10 , mais la composition de toutes les cellules gliales dans le microenvironnement du cerveau humain natif est inconnue.
Nous avons déjà montré que les composants microenvironnaires peuvent prédire la survie du patient en analysant quantitativement les composants cellulaires du micro-environnement du glioblastome et en incorporant nos analyses dans un modèle de risques proportionnels 11 . Ici, nous décrivons la méthode d'analyse quantitative pour identifier les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales du patient au glioblastomeS. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. L'évaluation du pourcentage de couverture crée une mesure simple pour déterminer les différences morphologiques des cellules, en particulier celles affectées par les interactions avec les cellules cancéreuses. Des études antérieures pour quantifier la coloration histopathologique utilisent une coloration standard telle que l'hématoxyline et l'éosine 12 ou le trichrome de Masson 13 , qui ne profitent pas de la spécificité de la coloration par immunohistochimie à base d'anticorps. Notre méthode a été développée pour quantifier directement les populations de gliales dans les résections de tumeur du patient liées au glioblastome, que nous visons à utiliser pour élucider le micro-environnement complexe du glioblastome.
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Protocol
Ce protocole identifie les composants cellulaires dans les échantillons intégrés à la paraffine fixée au formol (FFPE), comme c'est le cas pour les échantillons de patients cliniques bancés. L'encastrement de la paraffine permet le meilleur entretien de la morphologie cellulaire et tissulaire ainsi que la meilleure longévité des sections. Les échantillons utilisés pour cette analyse ont été consultés par l'intermédiaire de l'Université de Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Les échantillons de patients ont été sélectionnés par un neuropathologue sur la base d'un diagnostic définitif de glioblastome (astrocytome, grade IV de l'OMS) qui avaient terminé les résections tumorales à l'Université de Virginie entre 2010 et 2013 et ont été désidentifiés avant cette analyse 11 .
1. Déparaffinisation et réhydratation des échantillons FFPE
REMARQUE: cette partie du protocole est spécifique aux échantillons FFPE. Alors que les échantillons intégrés à la paraffine peuvent être plus utiles pour cette analyse en raison de la préservation de la cellule et de la tProblème de morphologie, cette analyse peut également être effectuée avec des sections gelées. Si vous utilisez des sections congelées, cette partie peut être omise et procéder directement à l'immunohistochimie chromogène.
- Effectuez les lavages suivants pendant 5 min chacun: Xylène, Xylène, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Éthanol, 70% Éthanol, Eau désionisée, Eau désionisée
2. Antigen Retrieval
REMARQUE: Cette partie du protocole est nécessaire pour casser les ponts méthylène formés lors de la fixation du formol des échantillons FFPE et exposer les sites antigéniques pour les anticorps qui se lient.
- Diluer la solution de démasquage de l'antigène à pH élevé à base de Tris à la recommandation du fabricant dans l'eau distillée.
- Effectuer une récupération d'antigène à médiation thermique à l'aide d'un micro-ondes. D'autres formes de récupération médiée par la chaleur (comme la cuisinière à pression, le vaporisateur végétal ou l'eau bouillante) suffiraient également.
- Ajouter la solution de démasquage diluée dans un micro-ondes non scellénavire. Placez les glissières dans le récipient. Placez les toboggans dans le micro-ondes.
- Faire bouillir pendant 20 min à haute puissance. Surveiller les niveaux de liquide pour l'évaporation, et reconstituer avec de l'eau distillée si nécessaire.
- Autoriser les échantillons à refroidir en solution pendant 1 h à température ambiante.
3. Immunohistochimie chromogène
- Décrire l'échantillon de tissu avec un stylo hydrophobe pour minimiser le volume de réactifs nécessaires pour couvrir l'échantillon.
REMARQUE: Assurez-vous de garder les échantillons de tissus hydratés et ne les laissez pas sécher car cela affectera l'efficacité de la coloration. - Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation (Tris-buffered saline (TBS) + 0,01% Triton-X) pour couvrir l'échantillon de tissu (typiquement environ 100 à 200 μL).
- Supprimez et jetez la solution et répétez l'étape 3.2.
- Incuber les échantillons à température ambiante avec une solution de blocage (2,5% de sérum de cheval + solution de perméabilisation).
- Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ºC avec des anticorps primaires diluésEn solution de blocage.
NOTE: Tous les anticorps primaires utilisés ici sont dilués à 1: 200, mais des dilutions optimales peuvent être déterminées à l'aide de dilutions en série, en commençant par la recommandation du fabricant. Des informations détaillées sur les anticorps utilisés dans ce protocole ont déjà été publiées 11 . - Détecter les anticorps primaires en utilisant un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l'animal hôte d'anticorps primaire, suivant le protocole du fabricant.
- Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation pour couvrir l'échantillon de tissu et incuber pendant 5 minutes.
- Retirez et jetez la solution et répétez l'étape 3.7.
- Incuber les diapositives dans 0,3% de H 2 O 2 dans 1x TBS pendant 15 min.
- Développer des échantillons avec un substrat de peroxydase diaminobenzidine (DAB) pendant 2 à 10 min jusqu'à ce que l'intensité de tache souhaitée soit atteinte.
- Contrôler les échantillons pour identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec l'hématoxyline, selon le protocole du fabricant.
- Déshydratez des échantillons avec 100%L'éthanol et le xylène.
- Monter des échantillons en permanence avec des supports de montage.
4. Identification des régions d'intérêt
- Diapositives d'images sous microscope à champ lumineux capable d'images haute résolution.
REMARQUE: Utilisez les composants cellulaires d'imagerie à une résolution minimale de 20x. - Déplacez la caméra vers des régions d'intérêt spécifiques tout au long des échantillons de tissus.
- Enregistrez les images en tant que fichiers TIFF pour la quantification.
5. Analyse d'image
- Ouvrez les images dans ImageJ pour la quantification du pourcentage de couverture.
- Utilisez le plug-in Threshold Color pour supprimer la couleur pourpre des noyaux colorés à l'hématoxyline.
- Convertir l'image en 8 bits.
- Ajouter un seuil sans arrière-plan sombre.
- Traitez l'image en utilisant l'un des 17 filtres de seuil ImageJ pré-chargés ( c'est-à-dire MaxEntropy), de sorte que seulement les portions colorées DAB sont incluses dans le seuil.
REMARQUE: sélectionnez le filtre de seuil préchargé optimal qui minimiseEs inclusion de la coloration d'arrière-plan. Cela peut dépendre de la qualité de la coloration et de la spécificité des anticorps. Utilisez le même seuil pour toutes les réplications techniques dans chaque échantillon de patient. - Appliquer le seuil.
- Mesurez la superficie en pourcentage de l'image de seuil.
- Coefficient de couverture en pourcentage moyen pour plusieurs régions dans chaque échantillon.
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Representative Results
Pour cette analyse, deux régions d'intérêt dans nos résections tumorales - la masse tumorale primaire et les régions adjacentes, principalement composées de tissu sain avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses ( Figure 1A , 1B ) - ont été identifiées par des neuropathologues collaborateurs sur l'hématoxyline et le patient coloré à l'éosine Échantillons. Dans chaque échantillon de patient, on a identifié une coloration positive pour les astrocytes ( Figure 1C ), la microglie ( Figure 1D ) et les oligodendrocytes ( Figure 1E ) par immunohistochimie chromogène. Ces populations ont été identifiées en utilisant des anticorps primaires ALDH1L1, Iba1 et Oligodendrocyte-Specific Protein (OSP1) respectivement 11 . L'optimisation des dilutions d'anticorps est recommandée, ainsi que la consultation des protocoles du fabricant pour confirmer si la coloration est exacte et positive ( Figure 2 ). Par exemple, nous avons effectué une coloration sans anticorps primaire pour un témoin négatif ( Figure 2A ), le fabricant a recommandé ( Figure 2B ) et d'autres dilutions ( Figure 2C , 2D ) avant de s'installer sur la dilution 1: 200 ( Figure 2C ) en raison de Coloration positive optimale du corps cellulaire et processus avec minimisation du fond pour l'anticorps anti-ALDH1L1.
À l'aide de ImageJ, le pourcentage de couverture de la coloration oligodendrocytaire OSP1 + a été quantifié pour éventuellement comparer les différences dans nos régions d'intérêt ( figure 3A ). Nous avons supprimé les noyaux contre-colorés de l'image en utilisant le plug-in Threshold Color afin d'évaluer uniquement la coloration DAB positive ( Figure 3B ). Après avoir converti l'image en 8 bits (Ss = "xfig"> Figure 3C), nous avons ensuite appliqué le seuil par défaut de MaxEntropy à la coloration DAB positive restante ( Figure 3D ). Ici, nous avons utilisé le seuil de seuil MaxEntropy parce que ce seuil par défaut particulier a mieux capté notre tache positive tout en minimisant l'arrière-plan, mais des seuils différents peuvent être utilisés pour assurer l'analyse de la population d'intérêt. Une fois que le seuil approprié a été appliqué à l'image ( Figure 3E ), le pourcentage de couverture du seuil peut être mesuré ( Figure 3F ) et comparé pour plusieurs patients. Ici, nous avons quantifié 3 à 5 zones dans chaque région d'intérêt, en fonction de la zone totale de la région d'intérêt, et des groupes comparés utilisant des tests en t jumelés avec le logiciel GraphPad Prism. Nous avons également comparé nos analyses GBM avec des colorations correspondantes trouvées dans des tissus cérébraux sains dans la base de données Atlas Protein ( figure 3F ). Dans notre Publication précédente, nous avons utilisé cette analyse pour de multiples composants microenvironnementaux (astrocytes, microglie, oligodendrocytes et vaisseaux sanguins) chez 33 patients pour développer un modèle de risques proportionnels pour prédire la survie globale des patients 11 .
Figure 1 : Comparaison des régions d'intérêt adjacentes de la masse tumorale et des tumeurs pour les cellules gliaires.
A) Échantillon de tumeur entière du patient 63 coloré avec de l'hématoxyline et de l'éosine avec des régions en vrac et adjacentes indiquées. B) Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, C) ALDH1L1 + astrocytes, D) Iba1 + microglie, et E) Oligodendrocyte Specific Protein-1 (OSP1) + oligodendrocytes. Barre d'échelle = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemple de titrage de l'anticorps anti-ALDH1L1.
A) Contrôle négatif, B) 1:70 recommandation du fabricant dilution du stock, C) dilution 1: 200 du stock, et D) dilution 1: 400 du stock. La dilution 1: 200 a été utilisée pour la coloration et l'analyse en raison de la coloration positive optimale du corps cellulaire et des processus avec une minimisation de l'arrière-plan. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : ImageJ Analyse et quantification de la couverture de zone pour les oligodendrocytes.
A) Coloration OSP1 + originale du patient 52. B) Elimination des noyaux violets en utilisant le plugin Threshold_Colour. C) Conversion à 8bit. D) Le seuil MaxEntropy capturé et E) appliqué pour minimiser la coloration du fond. F) Comparaison des régions adjacentes et en vrac dans cinq échantillons de patients, ainsi que des tissus cérébraux sains à travers l'Atlas des protéines, pour une couverture par pourcentage OSP1 +. *** p <0,001, **** p <0,0001 via des tests t appariés. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Notre méthode proposée ici est une approche quantitative pour analyser des échantillons histologiques colorés en utilisant une immunohistochimie chromogène traditionnelle. La méthodologie actuelle pour ce type d'analyse comprend des protocoles de coloration similaires suivis d'un classement par des pathologistes indépendants. Cette méthode a été fiable, mais pour un certain nombre d'applications, une compréhension plus précise du maquillage cellulaire est nécessaire, comme une meilleure compréhension de l'hétérogénéité associée aux tumeurs et une récapitulation précise des tumeurs pour les études in vitro.
Ce protocole démontre une technique simple pour analyser quantitativement les populations de cellules gliales dans le micro-environnement de la tumeur cérébrale. Cette technique est largement adaptable et peut être développée pour identifier de nombreux autres composants du microenvironnement, tels que les vaisseaux sanguins, les chimiokines et plus, ainsi que d'autres cancers, comme le sein ou le pancréas, où les résections tumorales peuvent avoirPlus grandes régions parenchymateuses. En outre, cette technique peut être adaptée pour acquérir d'autres mesures, telles que le compte et le périmètre des cellules pour évaluer la forme de la cellule, ainsi que des résultats morphologiques plus complexes, l'isotropie, le regroupement, l'orientation et plus encore. Ces techniques ne se limitent pas non seulement au cancer, car ces méthodes de coloration et de quantification peuvent être utilisées pour toute analyse du cerveau, comme l'ont démontré notre quantification représentative des tissus sains protéiniques et notre comparaison antérieure avec le tissu cérébral épileptique 11 .
Les étapes critiques de ce protocole incluent une incubation et un développement appropriés du secondaire chromogène. Des précautions doivent être prises pour que le colorant chromogène ne se développe pas trop. Cela rendra difficile de différencier la coloration positive et l'arrière-plan. Le temps de développement varie en fonction du réactif de substrat utilisé et de l'affinité de l'anticorps primaire. Nous utilisons un champ lumineuxMicroscopie pour surveiller le développement afin d'assurer une coloration optimale tout en minimisant la coloration de fond. Après la coloration, un seuil approprié lors de l'analyse peut aider à différencier l'arrière-plan de la coloration positive. Une limitation majeure de cette méthode est l'incapacité de colorer plusieurs composants dans le même échantillon de tissu en raison de l'utilisation du développement de coloration chromogène. L'analyse de l'immunofluorescence peut être effectuée d'une manière similaire, mais nécessite une modification des outils discutés dans cette méthode.
Spécifique au glioblastome, il existe un certain nombre de marqueurs et de taches cellulaires qui ont été utilisés pour analyser les échantillons de patients. Ceux-ci comprennent IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 comme marqueurs pronostiques, ainsi que CD11b et CD45 pour la microglie et les macrophages 18 , 19 . Notre méthode élargit ce type d'analyseAu microenvironnement cellulaire, un composant souvent négligé du micro-environnement de la tumeur dans le glioblastome. Des études ont porté sur la présence et la densité de microglie dans les tumeurs 20 , 21 , 22 ainsi que sur les contributions des astrocytes 9 , 23 , 24 . Ici, nous avons développé un protocole examinant tous les glia - astrocytes, microglies et oligodendrocytes - dans le microenvironnement de la tumeur cérébrale et pour différencier les régions adjacentes ou invasives de la tumeur de la masse tumorale, où les marqueurs sont habituellement identifiés dans ces tumeurs. En faisant cela, nous croyons pouvoir évaluer plus précisément la situation du patient car nous avons déterminé l'hétérogénéité intra-patient et notre publication précédente a montré que l'analyse de ces emplacements et l'inclusion dans les modèles statistiques est plus forte pour prédire les résultats que l'un ou l'autre emplacementÉchantillons globaux 11 . En outre, étant donné que l'invasion du glioblastome est si diffuse, ce qui rend difficile la réapparition complète 1 , 2 , nous croyons que le tissu dans les régions adjacentes est plus représentatif du tissu invasif laissé après la résection, ce qui contribue à une récurrence inévitable. Par conséquent, une meilleure compréhension des régions adjacentes peut donner plus d'informations sur la récidive de la maladie et la planification du traitement du patient, par opposition au tissu en vrac traditionnellement étudié qui est réséqué avant le traitement chez les patients atteints de glioblastome.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les Drs. Fahad Bafakih et Jim Mandell pour l'acquisition et l'identification des échantillons de patients, Garrett F. Beeghly pour l'assistance à l'immunohistochimie, et le Centre de recherche sur les biorestations et les tissus, le Centre de recherche cardiovasculaire et le Centre d'analyse biomoléculaire de l'Université de Virginie pour obtenir de l'aide avec L'acquisition d'échantillons, l'immunohistochimie et l'imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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