Summary
Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.
Abstract
Con el creciente interés en el microambiente tumoral, nos propusimos desarrollar un método para determinar específicamente los componentes del microambiente dentro de muestras de pacientes de glioblastoma, el cáncer de cerebro más mortífero y más invasivo. No sólo son métodos cuantitativos beneficiosos para describir con precisión los tejidos enfermos, sino que también pueden contribuir a un pronóstico más preciso, el diagnóstico y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos y reemplazos. En el glioblastoma, las células gliales, tales como microglia y astrocitos, se han correlacionado independientemente con un mal pronóstico basado en la clasificación de patólogos. Sin embargo, el estado de estas células y otros componentes de las células gliales no ha sido bien descrito cuantitativamente. Esto puede ser difícil debido a los grandes procesos que marcan estas células gliales. Además, la mayoría de los análisis histológicos se centran en la muestra de tejido total o sólo dentro de la mayor parte del tumor, en lugar de delinear cuantificaciones basadas en regiones conHin el tejido altamente heterogéneo. Aquí, describimos un método para identificar y analizar cuantitativamente las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma. Se utilizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar las poblaciones de células gliales en resecciones tumorales de pacientes y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción para cada población glial. Con estas técnicas podemos describir mejor las células gliales a través de las regiones del microambiente tumoral glioma.
Introduction
El glioblastoma (GBM), el cáncer de cerebro más común y maligno, se caracteriza por una invasión altamente difusa desde el tumor primario al parénquima cerebral sano circundante 1 , 2 . Esta invasión difusa hace que el tumor sea particularmente difícil de resecar completamente, y las células cancerosas invasoras que permanecen después de la terapia es la razón más común para la recurrencia inevitable 2 , 3 , 4 . Anteriormente, se encontró inhibir la invasión difusa de células de glioma de ser terapéuticamente beneficioso [ 5] , sin embargo poco se sabe sobre los complejos mecanismos que contribuyen a GBM invasión. El microambiente tumoral, o tejido que rodea el cáncer, ha sido implicado en la progresión de tumores en múltiples cánceres [ 6 , 7] . El microambiente tumoral del glioblastoma, en pArticular, está relativamente sub-caracterizada y es singularmente compleja, compuesta de múltiples células gliales, tales como astrocitos, microglia y oligodendrocitos, así como matriz extracelular, factores solubles y factores biofísicos. Experimentalmente, se ha demostrado que los astrocitos y microglia aumentan la progresión e invasión de glioma 8 , 9 , 10 , pero se desconoce la composición de todas las células gliales en el microambiente humano nativo del cerebro.
Anteriormente hemos demostrado que los componentes microambientales pueden predecir la supervivencia de los pacientes mediante el análisis cuantitativo de los componentes celulares del glioblastoma microambiente e incorporar nuestros análisis en un modelo de riesgos proporcionales [ 11] . En este sentido, describimos el método de análisis cuantitativo para identificar las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastomaS Se utilizó inmunohistoquímica cromógena para identificar las poblaciones de células gliales y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción de cada población glial. La evaluación del porcentaje de cobertura crea una medición simple para determinar las diferencias morfológicas de las células, particularmente las afectadas por las interacciones con las células cancerosas. Los estudios previos para cuantificar la tinción histopatológica usan tinción estándar como la hematoxilina y la eosina 12 o el tricromo 13 de Masson, que no aprovechan la especificidad de la tinción inmunohistoquímica basada en anticuerpos. Nuestro método fue desarrollado para cuantificar directamente las poblaciones gliales dentro de las resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma, que se pretende utilizar para elucidar el complejo microambiente glioblastoma.
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Protocol
Este protocolo identifica los componentes celulares en las muestras fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE), como es típico para las muestras clínicas bancadas. La inclusión de parafina permite el mejor mantenimiento de la morfología celular y de los tejidos, así como una mejor longevidad de las secciones. Las muestras utilizadas para este análisis se accedieron a través de la Universidad de Virginia Biorepository y Tissue Research Facility. Las muestras de pacientes fueron seleccionadas por un neuropatólogo basado en un diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grado IV de la OMS) que había completado resecciones tumorales en la Universidad de Virginia entre 2010 y 2013, y fueron de-identificados antes de este análisis [ 11] .
1. Desparafinación y Rehidratación de Muestras de FFPE
NOTA: Esta parte del protocolo es específica para las muestras de FFPE. Mientras que las muestras embebidas en parafina pueden ser más útiles para este análisis debido a la preservación de células y tMorfología de la cuestión, este análisis también se puede hacer con secciones congeladas. Si se utilizan secciones congeladas, esta porción puede omitirse y proceder directamente a la inmunohistoquímica cromogénica.
- Realizar los siguientes lavados durante 5 min cada uno: Xileno, Xileno, Etanol al 100%, Etanol al 100%, Etanol al 95%, Etanol al 95%, Etanol al 70%, Agua desionizada, Agua desionizada
2. Recuperación de antígenos
NOTA: Esta parte del protocolo es necesaria para romper los puentes de metileno formados durante la fijación de formalina de las muestras de FFPE y exponer los sitios de antígeno para detectar anticuerpos.
- Diluya la solución de desenmascaramiento del antígeno de alto pH basada en Tris en la recomendación del fabricante en agua destilada.
- Realizar la recuperación de antígeno mediada por calor utilizando un microondas. Otras formas de recuperación mediada por calor (tales como olla a presión, vapor de verduras, o agua hirviendo) también serían suficientes.
- Añadir la solución de desenmascaramiento diluida en un recipiente no sellable para microondasbuque. Coloque los portaobjetos en el recipiente. Coloque los portaobjetos en el microondas.
- Hervir durante 20 min a alta potencia. Controle los niveles de líquido para la evaporación y rellene con agua destilada según sea necesario.
- Dejar enfriar las muestras en solución durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Inmunohistoquímica cromogénica
- Esboce la muestra de tejido con una pluma hidrófoba para minimizar el volumen de reactivos necesarios para cubrir la muestra.
NOTA: Asegúrese de mantener las muestras de tejido hidratadas y no deje que se sequen, ya que esto afectará la eficacia de la tinción. - Pipetar suficiente solución de permeabilización (solución salina tamponada con Tris (TBS) + Triton-X al 0,01%) para cubrir la muestra de tejido (típicamente alrededor de 100 - 200 μl).
- Retire y deseche la solución y repita el paso 3.2.
- Incubar las muestras a temperatura ambiente con solución de bloqueo (suero de caballo al 2,5% + solución de permeabilización).
- Incubar las muestras durante la noche a 4 ºC con anticuerpos primarios diluidosEn la solución de bloqueo.
NOTA: Todos los anticuerpos primarios usados aquí se diluyen a 1: 200, pero las diluciones óptimas se pueden determinar usando diluciones en serie comenzando con la recomendación del fabricante. Información detallada sobre anticuerpos utilizados en este protocolo se publicó anteriormente [ 11] . - Detectar los anticuerpos primarios utilizando un reactivo de polímero de peroxidasa de rábano picante correspondiente al animal huésped del anticuerpo primario, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Pipet suficiente solución de permeabilización para cubrir la muestra de tejido e incubar durante 5 min.
- Retire y deseche la solución y repita el Paso 3.7.
- Incubar los portaobjetos en H 2 O 2 al 0,3% en 1x TBS durante 15 min.
- Desarrollar muestras con un sustrato de peroxidasa diaminobenzidina (DAB) durante 2 - 10 min hasta que se alcance la intensidad de tinción deseada.
- Contraste las muestras para identificar núcleos celulares, como con hematoxilina, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Deshidrate las muestras con 100%Etanol y xileno.
- Monte las muestras permanentemente con medios de montaje.
4. Identificación de regiones de interés
- La imagen se desliza bajo microscopía de campo claro capaz de imágenes de alta resolución.
NOTA: Utilice componentes celulares de generación de imágenes con una resolución mínima de 20x. - Mueva la cámara a regiones específicas de interés a través de muestras de tejido.
- Guardar imágenes como archivos TIFF para la cuantificación.
5. Análisis de imágenes
- Abra imágenes en ImageJ para la cuantificación del porcentaje de cobertura.
- Utilice el complemento Color Umbral para eliminar el color púrpura de los núcleos teñidos con hematoxilina.
- Convierte la imagen a 8 bits.
- Añadir umbral sin fondo oscuro.
- Procese la imagen usando uno de los 17 filtros de umbral de ImageJ pre-cargado ( es decir, MaxEntropy) para que solo las partes teñidas de DAB se incluyan en el umbral.
NOTA: Seleccione el filtro de umbral pre-cargado óptimo que minimizEs inclusión de tinción de fondo. Esto puede depender de la calidad de la tinción y la especificidad del anticuerpo. Utilice el mismo umbral para todas las réplicas técnicas dentro de cada muestra de paciente. - Aplicar umbral.
- Medir el área de porcentaje de la imagen de umbral.
- Porcentaje promedio de cobertura de área para múltiples regiones dentro de cada muestra.
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Representative Results
Para este análisis, se identificaron dos regiones de intereses dentro de nuestras resecciones tumorales - el tumor primario y las regiones adyacentes, principalmente compuestas de tejido sano con células difusas invasoras de cáncer ( Figura 1A , 1B ) - fueron identificadas por neuropatólogos colaboradores en hematoxilina y eosina Muestras. Dentro de cada muestra de pacientes, se identificó tinción positiva para astrocitos ( Figura 1C ), microglia ( Figura 1D ) y oligodendrocitos ( Figura 1E ) mediante inmunohistoquímica cromogénica. Estas poblaciones se identificaron utilizando los anticuerpos primarios ALDH1L1, Iba1 y Oligodendrocyte-Specific Protein (OSP1), respectivamente 11 . Se recomienda la optimización de las diluciones de anticuerpos, así como la consulta con los protocolos del fabricante para confirmar si la tinción es precisa y positiva ( Figura 2 ). Por ejemplo, se realizó una tinción sin anticuerpo primario para un control negativo ( Figura 2A ), el fabricante recomendó ( Figura 2B ) y otras diluciones ( Figura 2C , 2D ) antes de asentarse en la dilución 1: 200 ( Figura 2C ) debido a Coloración positiva óptima del cuerpo celular y procesos con un fondo mínimo para el anticuerpo anti-ALDH1L1.
Utilizando ImageJ, el porcentaje de cobertura de OSP1 + tinción de oligodendrocitos se cuantificó para eventualmente comparar las diferencias en nuestras regiones de interés ( Figura 3A ]. Hemos eliminado los núcleos counterstained de la imagen mediante el complemento de color umbral con el fin de evaluar únicamente la tinción positiva DAB ( Figura 3B ]. Después de convertir la imagen a 8 bits (Ss = "xfig"> Figura 3C), entonces aplicamos el umbral MaxEntropy por defecto a la tinción DAB positiva restante ( Figura 3D ). Aquí, usamos el umbral de MaxEntropy por defecto porque este umbral predeterminado mejor capturó nuestra mancha positiva mientras minimizaba el fondo, pero se pueden usar diferentes umbrales para asegurar el análisis de la población de interés. Una vez que se ha aplicado el umbral apropiado a la imagen ( Figura 3E ), se puede medir el porcentaje de cobertura desde el umbral ( Figura 3F ) y compararlo para múltiples pacientes. Aquí, cuantificamos 3-5 áreas dentro de cada región de interés, dependiendo del área total de la región de interés, y los grupos comparados utilizando t-tests pareados con el software GraphPad Prism. También comparamos nuestros análisis de GBM con tinción correspondiente encontrado en el tejido cerebral sano en la base de datos Atlas de Proteínas ( Figura 3F ). En nuestro En la publicación anterior, se utilizó este análisis para múltiples componentes microenvironales (astrocitos, microglia, oligodendrocitos y vasos sanguíneos) en 33 pacientes para desarrollar un modelo de riesgo proporcional para predecir la supervivencia global del paciente 11 .
Figura 1 : Comparación de las regiones adyacentes de tumores a granel y tumor de interés para las células gliales.
A) Muestra completa de tumor del Paciente 63 teñida con hematoxilina y eosina con regiones a granel y adyacentes indicadas. B) tinción con hematoxilina y eosina, C) astrocitos ALDH1L1 +, D) Iba1 + microglia, y E) Oligodendrocitos Proteína Específica 1 (OSP1) + oligodendrocitos. Barra de escala = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplo de titulación del anticuerpo anti-ALDH1L1.
A) Control negativo, B) 1:70 dilución recomendación del fabricante de stock, C) dilución 1: 200 de la acción, y D) dilución 1: 400 de la acción. Se usó dilución 1: 200 para la tinción y análisis debido a la tinción positiva óptima del cuerpo celular y los procesos con un fondo de minimización. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3 : ImageJ Análisis y cuantificación de la cobertura de área para Oligodendrocytes.
A) Tinción original de OSP1 + del paciente 52. B) Eliminación de núcleos púrpuras usando el complemento Threshold_Colour. C) Conversión a 8 bits. D) MaxEntropy límite capturado y E) aplicado para minimizar la tinción de fondo. F) Comparación de regiones adyacentes y en masa en cinco muestras de pacientes, así como tejido cerebral sano a través del Atlas de Proteínas, para cobertura de OSP1 + por ciento. *** p <0,001, **** p <0,0001 a través de pruebas t pareadas. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro método propuesto aquí es un enfoque cuantitativo para analizar las muestras histológicas teñidas usando inmunohistoquímica cromogénica tradicional. La metodología actual para este tipo de análisis incluye protocolos de tinción similares seguidos de clasificación por patólogos independientes. Este método ha sido confiable, sin embargo, para una serie de aplicaciones, se requiere una comprensión más precisa del maquillaje celular, tal como una mejor comprensión de la heterogeneidad asociada con tumores y una recapitulación precisa de tumores para estudios in vitro.
Este protocolo demuestra una técnica sencilla para el análisis cuantitativo de las poblaciones de células gliales dentro del microambiente del tumor cerebral. Esta técnica es ampliamente adaptable y puede ampliarse para identificar muchos otros componentes del microambiente, como vasos sanguíneos, quimiocinas y más, así como otros tipos de cáncer, como el de mama o pancreático, donde las resecciones tumorales pueden tenerRegiones parenquimales más grandes. Además, esta técnica puede adaptarse para adquirir otras mediciones, tales como recuentos, y el perímetro de las células para evaluar la forma celular, así como resultados morfológicos más complejos, isotropía, agrupación, orientación y más. Estas técnicas tampoco están limitadas al cáncer, ya que estas metodologías de tinción y cuantificación pueden usarse para cualquier análisis cerebral, como se demuestra en nuestra cuantificación representativa del tejido sano en Proteína Atlas, y nuestra comparación previamente publicada con el tejido cerebral epiléptico 11 .
Los pasos críticos dentro de este protocolo incluyen la incubación y el desarrollo adecuados de la secundaria cromogénica. Debe tenerse cuidado de que el colorante cromogénico no se sobre-desarrolle. Esto hará que sea difícil diferenciar entre tinción positiva y fondo. El tiempo de desarrollo varía dependiendo del reactivo de sustrato utilizado y de la afinidad del anticuerpo primario. Utilizamos campo brillanteMicroscopía para monitorear el desarrollo para asegurar una tinción óptima mientras se minimiza la tinción de fondo. Después de la tinción, el umbral adecuado durante el análisis puede ayudar a diferenciar el fondo de la tinción positiva. Una limitación principal para este método es la incapacidad para teñir múltiples componentes dentro de la misma muestra de tejido debido al uso del desarrollo de tinción cromogénica. El análisis de inmunofluorescencia podría llevarse a cabo de una manera similar, pero requiere la modificación de las herramientas discutidas en este método.
Específicas para el glioblastoma, hay una serie de marcadores y manchas celulares que se han utilizado para analizar las muestras de pacientes. Estos incluyen IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 como marcadores de pronóstico, así como CD11b y CD45 para microglia y macrófagos [ 18 , 19] . Nuestro método amplía este tipo de análisisAl microambiente celular, componente a menudo ignorado del microambiente tumoral en el glioblastoma. Los estudios han analizado la presencia de microglia y la densidad en los tumores 20 , 21 , 22 , así como las contribuciones de los astrocitos 9 , 23 , 24 . Aquí desarrollamos un protocolo que examina todos los glia - astrocitos, microglia y oligodendrocitos - en el microambiente del tumor cerebral y para diferenciar las regiones adyacentes o invasoras del tumor de la masa tumoral, que es donde se identifican marcadores en estos tumores. Al hacer esto, creemos que podemos evaluar con mayor precisión la situación del paciente porque determinamos la heterogeneidad intra-paciente y nuestra publicación anterior mostró que el análisis de estos lugares y la inclusión en los modelos estadísticos es más fuerte en la predicción de los resultados que la ubicación aloNe o muestras globales 11 . Además, puesto que la invasión del glioblastoma es tan difusa, por lo que es difícil resecar completamente 1 , 2 , creemos que el tejido en las regiones adyacentes es más representativo del tejido invasivo que queda tras la resección, lo que contribuye a la recurrencia inevitable. Por lo tanto, una mejor comprensión de las regiones adyacentes puede dar más información sobre la recurrencia de la enfermedad y la planificación del tratamiento del paciente, en contraposición al tejido a granel tradicionalmente estudiado que se reseca antes de la terapia en pacientes con glioblastoma.
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Disclosures
Ninguna.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los Dres. Fahad Bafakih y Jim Mandell para la adquisición e identificación de muestras de pacientes, Garrett F. Beeghly para la ayuda con inmunohistoquímica, y el Biorepository and Tissue Research Facility, el Centro de Investigación Cardiovascular Histology Core y el Biomolecular Analysis Facility de la Universidad de Virginia para asistencia con Adquisición de muestras, inmunohistoquímica e imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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