Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.
Abstract
Mit dem wachsenden Interesse an der Tumor-Mikroumgebung haben wir uns bemüht, eine Methode zur spezifischen Bestimmung der Mikroumgebungskomponenten innerhalb von Patientenproben von Glioblastom, dem tödlichsten und am meisten invasiven Hirntumor, zu entwickeln. Es sind nicht nur quantitative Methoden, die für die genaue Beschreibung von erkrankten Geweben von Vorteil sind, sondern auch potenziell zu einer genaueren Prognose, Diagnose und Entwicklung von gewebetechnischen Systemen und Ersetzungen beitragen. Im Glioblastom wurden Gliazellen, wie Mikroglia und Astrozyten, unabhängig mit einer schlechten Prognose auf der Grundlage der Pathologieabstufung korreliert. Der Zustand dieser Zellen und anderer Gliazellenkomponenten ist jedoch nicht quantitativ gut beschrieben worden. Dies kann aufgrund der großen Prozesse, die diese Gliazellen markieren, schwierig sein. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten histologischen Analysen auf die gesamte Gewebeprobe oder nur innerhalb der Masse des Tumors, im Gegensatz zu der Abgrenzung von Quantifizierungen, die auf Regionen basierenHin das sehr heterogene Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumormasse und angrenzenden Regionen der Tumorresektionen von Glioblastompatienten. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen bei Patienten-Tumor-Resektionen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Glia-Population zu analysieren. Mit diesen Techniken sind wir in der Lage, die Gliazellen in allen Regionen der Gliom-Tumor-Mikroumgebung besser zu beschreiben.
Introduction
Glioblastom (GBM), der häufigste und bösartige Hirntumor, zeichnet sich durch eine stark diffuse Invasion aus der primären Tumormasse in das umgebende gesunde Gehirnparenchym 1 , 2 aus . Diese diffuse Invasion macht den Tumor besonders schwierig, vollständig zu resezieren, und die eindringenden Krebszellen, die nach der Therapie bleiben, ist der häufigste Grund für unvermeidliches Rezidiv 2 , 3 , 4 . Bisher fanden wir die diffuse Gliom Zellinvasion Hemmung therapeutisch vorteilhaft 5, wird jedoch wenig über die komplexen Mechanismen bekannt ist GBM Invasion beitragen. Die Tumor-Mikroumgebung oder das Gewebe, das den Krebs umgibt, wurde in die Progression von Tumoren in mehreren Krebsarten 6 , 7 verwickelt. Die Glioblastom-Tumor-Mikroumgebung, in pArtikulär, ist relativ unter- charakterisiert und ist eindeutig komplex und komponiert mehrere Gliazellen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten sowie extrazelluläre Matrix, lösliche Faktoren und biophysikalische Faktoren. Experimentell wurde gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia die Gliomprogression und Invasion 8 , 9 , 10 erhöhen, aber die Zusammensetzung aller Gliazellen in der nativen menschlichen Gehirnmikroumgebung ist unbekannt.
Wir haben zuvor gezeigt, dass mikroumweltliche Komponenten das Überleben des Patienten durch quantitative Analyse der zellulären Komponenten der Glioblastom-Mikroumgebung vorhersagen und unsere Analysen in ein proportionales Gefahrenmodell 11 einbinden können. Hier beschreiben wir die quantitative Analyse Methode zur Identifizierung der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumor-Masse und angrenzenden Regionen der Tumor-Resektionen von Glioblastom-PatientenS. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Gliapopulation zu analysieren. Die Beurteilung der prozentualen Abdeckung schafft eine einfache Messung zur Bestimmung der morphologischen Unterschiede der Zellen, insbesondere derjenigen, die durch Wechselwirkungen mit Krebszellen betroffen sind. Frühere Studien zur Quantifizierung der histopathologischen Färbung verwenden Standardfärbung wie Hämatoxylin und Eosin 12 oder Masson's Trichrom 13 , die nicht die Spezifität der Antikörper-basierten Immunhistochemie-Färbung nutzen. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Gliapopulationen innerhalb der Glioblastom-Patienten-Tumor-Resektionen direkt zu quantifizieren, die wir zur Aufklärung der komplexen Glioblastom-Mikroumgebung anstreben.
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Protocol
Dieses Protokoll identifiziert zelluläre Komponenten in Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben, wie es für klinische Patientenproben typisch ist. Paraffin Einbettung ermöglicht die beste Aufrechterhaltung der Zell-und Gewebe-Morphologie sowie eine bessere Langlebigkeit der Abschnitte. Die Proben für diese Analyse wurden durch die University of Virginia Biorepository und Tissue Research Facility zugegriffen. Patientenproben wurden von einem Neuropathologen ausgewählt, der auf einer endgültigen Diagnose des Glioblastoms (Astrozytom, WHO-Grad IV) basierte, der zwischen 2010 und 2013 an der Universität von Virginia Tumorresektionen abgeschlossen hatte und vor dieser Analyse entdeckt wurde 11 .
1. FFPE-Probenentparaffinierung und Rehydratation
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist spezifisch für FFPE-Proben. Während Paraffin-eingebettete Proben für diese Analyse aufgrund der Konservierung von zellulären und t nützlicher sein könnenIssue Morphologie, diese Analyse kann auch mit eingefrorenen Abschnitten durchgeführt werden. Bei Verwendung von gefrorenen Abschnitten kann dieser Teil weggelassen werden und gehen direkt zur chromogenen Immunhistochemie über.
- Führen Sie die folgenden Waschungen für jeweils 5 min aus: Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, entionisiertes Wasser, entionisiertes Wasser
2. Antigen Retrieval
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist notwendig, um die bei der Formalin-Fixierung von FFPE-Proben gebildeten Methylenbrücken zu brechen und Antigen-Stellen für Antikörper zu binden.
- Verdünnen Sie die Tris-basierte Hoch-pH-Antigen-Entmaskungslösung bei der Herstellerempfehlung in destilliertem Wasser.
- Führen Sie eine wärmevermittelte Antigen-Retrieval mit einer Mikrowelle durch. Andere Formen der wärmevermittelten Retrieval (wie Dampfkochtopf, Gemüsedampfer oder kochendes Wasser) würden ebenfalls ausreichen.
- Die verdünnte Entlüftungslösung in eine nicht versiegelte mikrowellengeeignete gebenSchiff. Legen Sie die Schienen in das Gefäß. Legen Sie Dias in Mikrowelle.
- Kochen für 20 min bei hoher Leistung. Überwachen Sie die Flüssigkeitsspiegel für die Verdunstung und füllen Sie mit destilliertem Wasser nach Bedarf.
- Proben in 1 Stunde bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
3. Chromogene Immunhistochemie
- Umrisse Gewebeprobe mit einem hydrophoben Stift, um das Volumen der Reagenzien zu minimieren, die notwendig sind, um die Probe zu bedecken.
HINWEIS: Seien Sie sicher, dass die Gewebeproben hydratisiert werden und lassen Sie sie nicht austrocknen, da dies die Verfärbungswirkung beeinträchtigen wird. - Pipet genug Permeabilisierungslösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,01% Triton-X) zur Deckung der Gewebeprobe (typischerweise etwa 100 - 200 μl).
- Entfernen und verwerfen Sie die Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.2.
- Inkubieren von Proben bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung (2,5% Pferdeserum + Permeabilisierungslösung).
- Inkubieren Sie Proben über Nacht in 4 ºC mit primären Antikörpern verdünntIn Blockierlösung
HINWEIS: Alle hier verwendeten Primärantikörper werden bei 1: 200 verdünnt, aber optimale Verdünnungen können mit seriellen Verdünnungen beginnend mit Herstellerempfehlung bestimmt werden. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Antikörpern wurden zuvor veröffentlicht 11 . - Detektion von primären Antikörpern unter Verwendung eines Meerrettich-Peroxidase-Polymerreagenzes, das dem primären Antikörper-Wirtstier entspricht, nach dem Herstellerprotokoll.
- Pipet genug Permeabilisierungslösung zur Deckung der Gewebeprobe und inkubieren für 5 min.
- Entfernen und entwerfen Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.7.
- Inkubieren von Objektträgern in 0,3% H 2 O 2 in 1x TBS für 15 min.
- Entwickeln Sie Proben mit einem Peroxidase-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat für 2 - 10 min, bis die gewünschte Fleckenintensität erreicht ist.
- Gegenstichproben zur Identifizierung von Zellkernen, wie z. B. mit Hämatoxylin, nach Herstellerprotokoll.
- Proben mit 100%Ethanol und Xylol.
- Befestigen Sie die Proben dauerhaft mit dem Montagemedium.
4. Zinsanweisungen
- Bild-Dias unter Hellfeld-Mikroskopie in der Lage, hochauflösende Bilder.
HINWEIS: Verwenden Sie bildgebende zellulare Komponenten mit einer Auflösung von mindestens 20x. - Bewegen Sie die Kamera zu bestimmten Regionen von Interesse in Gewebeproben.
- Bilder als TIFF-Dateien zur Quantifizierung speichern
5. Bildanalyse
- Öffnen Sie Bilder in ImageJ für die Quantifizierung der prozentualen Abdeckung.
- Verwenden Sie das Threshold Color Plugin, um die lila Farbe von Hämatoxylin-gefärbten Kernen zu entfernen.
- Bild in 8-Bit umwandeln.
- Schwellenwert ohne dunklen Hintergrund hinzufügen.
- Prozessbild unter Verwendung eines der 17 vorgespannten ImageJ-Schwellenfilter ( dh MaxEntropy), so dass nur DAB-gefärbte Teile in der Schwelle enthalten sind.
HINWEIS: Wählen Sie den optimierten vorgespannten Schwellenfilter, der minimiertEs Einbeziehung der Hintergrundfärbung. Dies kann von der Qualität der Färbung und Spezifität des Antikörpers abhängen. Verwenden Sie die gleiche Schwelle für alle technischen Replikate innerhalb jeder Patientenprobe. - Schwellenwert anwenden
- Messen Sie den prozentualen Bereich des Schwellenwertes.
- Durchschnittliche prozentuale Flächendeckung für mehrere Regionen innerhalb jeder Probe.
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Representative Results
Für diese Analyse wurden zwei Interessenbereiche innerhalb unserer Tumorresektionen - die primäre Tumormasse und die angrenzenden Regionen, die in erster Linie aus gesundem Gewebe mit diffus eindringenden Krebszellen zusammengesetzt waren ( Abbildung 1A , 1B ) - durch die Zusammenarbeit von Neuropathologen an Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Patienten identifiziert Proben. Innerhalb jeder Patientenprobe wurde eine positive Färbung für Astrozyten ( Abbildung 1C ), Mikroglia ( Abbildung 1D ) und Oligodendrozyten ( Abbildung 1E ) über chromogene Immunhistochemie identifiziert. Diese Populationen wurden mit primären Antikörpern ALDH1L1, Iba1 und Oligodendrozytenspezifischem Protein (OSP1) bzw. 11 identifiziert. Die Optimierung von Antikörperverdünnungen wird empfohlen, sowie die Konsultation mit den Herstellerprotokollen, um zu bestätigen, ob die Färbung genau und positiv ist ( Fig. 2 ). Zum Beispiel haben wir die Färbung ohne Primärantikörper für eine Negativkontrolle durchgeführt ( Abbildung 2A ), empfiehlt der Hersteller ( Abbildung 2B ) und weitere Verdünnungen ( Abbildung 2C , 2D ) vor dem Absetzen auf der 1: 200-Verdünnung ( Abbildung 2C ) Optimale positive Färbung des Zellkörpers und Prozesse mit Minimierung des Hintergrunds für den Anti-ALDH1L1-Antikörper.
Bei der Verwendung von ImageJ wurde die prozentuale Abdeckung der OSP1 + Oligodendrozytenfärbung quantifiziert, um schließlich die Unterschiede in unseren interessierenden Regionen zu vergleichen ( Abbildung 3A ). Wir haben die Gegengefärbten aus dem Bild mit dem Threshold Color Plugin entfernt, um nur die positive DAB-Färbung zu beurteilen ( Abbildung 3B ). Nach dem Umwandeln des Bildes in 8bit (Ss = "xfig"> Abbildung 3C) haben wir dann die MaxEntropy-Standardschwelle auf die verbleibende positive DAB-Färbung angewendet ( Abbildung 3D ). Hier haben wir den MaxEntropy-Schwellenwert verwendet, da diese Standard-Default-Schwelle am besten unseren positiven Fleck bei gleichzeitiger Minimierung des Hintergrundes erfasst hat, aber verschiedene Schwellenwerte können verwendet werden, um die Analyse der interessierenden Bevölkerung sicherzustellen. Sobald die entsprechende Schwelle auf das Bild angewendet wurde ( Abbildung 3E ), kann die prozentuale Abdeckung von der Schwelle gemessen werden ( Abbildung 3F ) und verglichen für mehrere Patienten. Hier haben wir in Abhängigkeit von der Gesamtfläche des interessierenden Bereichs 3 - 5 Bereiche in jedem interessierenden Bereich quantifiziert und Gruppen mit gepaarten t - Tests mit GraphPad Prism Software verglichen. Wir haben auch unsere GBM-Analysen mit entsprechender Färbung im gesunden Gehirngewebe in der Protein-Atlas-Datenbank verglichen ( Abbildung 3F ). In unserer Vorherige Publikation nutzten wir diese Analyse für mehrere mikroverstärkende Komponenten (Astrozyten, Mikroglia, Oligodendrozyten und Blutgefäße) über 33 Patienten, um ein proportionales Gefahrenmodell für die Vorhersage des Gesamtüberlebens des Patienten zu entwickeln 11 .
Abbildung 1 : Vergleich der Tumor-Bulk- und Tumor-benachbarten Regionen von Interesse für Gliazellen.
A) Ganze Tumorprobe aus Patient 63, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin mit Bulk- und angrenzenden Regionen. B) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, C) ALDH1L1 + Astrozyten, D) Iba1 + Mikroglia und E) Oligodendrozyten-spezifische Protein-1 (OSP1) + Oligodendrozyten. Maßstab = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Beispieltitration von Anti-ALDH1L1-Antikörper.
A) Negative Kontrolle, B) 1:70 Herstellerempfehlung Verdünnung ab Lager, C) 1: 200 Verdünnung ab Lager und D) 1: 400 Verdünnung ab Lager. 1: 200 Verdünnung wurde zur Färbung und Analyse durch optimale positive Färbung des Zellkörpers und Prozesse mit Minimierung des Hintergrundes verwendet. Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3 : ImageJ-Analyse und Quantifizierung der Flächendeckung für Oligodendrozyten.
A) Original OSP1 + Färbung des Patienten 52. B) Entfernung von lila Kerne mit Threshold_Colour Plugin. C) Umwandlung in 8bit D) MaxEntropy-Schwellenwert erfasst und E) angewendet, um die Hintergrundfärbung zu minimieren. F) Vergleich von angrenzenden und Massenregionen in fünf Patientenproben sowie gesundem Hirngewebe durch den Proteinatlas, für OSP1 + Prozentabdeckung. *** p <0,001, **** p <0,0001 über gepaarte t-Tests. Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Unsere hier vorgeschlagene Methode ist ein quantitativer Ansatz zur Analyse von histologischen Proben, die mit der traditionellen chromogenen Immunhistochemie gefärbt wurden. Die aktuelle Methodik für diese Art von Analyse umfasst ähnliche Färbeprotokolle, gefolgt von der Einstufung durch unabhängige Pathologen. Diese Methode ist zuverlässig, aber für eine Reihe von Anwendungen ist ein präziseres Verständnis der zellulären Make-up erforderlich, wie ein besseres Verständnis der Heterogenität im Zusammenhang mit Tumoren und genaue Rekapitulation von Tumoren für in-vitro-Studien.
Dieses Protokoll zeigt eine einfache Technik zur quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Hirntumor-Mikroumgebung. Diese Technik ist weithin anpassungsfähig und kann erweitert werden, um viele andere Komponenten der Mikroumgebung zu identifizieren, wie Blutgefäße, Chemokine und mehr, sowie andere Krebsarten wie Brust oder Bauchspeicheldrüsen, wo die Tumor-Resektionen haben könnenGrößere parenchymale Regionen. Darüber hinaus kann diese Technik angepasst werden, um andere Messungen, wie z. B. Zählungen und Umfang der Zellen, um die Zellform zu beurteilen, sowie komplexere Morphologie Ergebnisse Isotropie, Clustering, Orientierung und vieles mehr. Diese Techniken sind auch nicht auf Krebs beschränkt, da diese Färbe- und Quantifizierungsmethoden für alle Hirnanalysen verwendet werden können, wie in unserer repräsentativen Proteinatlas-Quantifizierung von gesundem Gewebe und unserem bisher veröffentlichten Vergleich mit epileptischem Hirngewebe 11 gezeigt wurde .
Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls sind die korrekte Inkubation und Entwicklung der chromogenen Sekundärwicklung. Es ist darauf zu achten, dass sich der chromogene Farbstoff nicht überentwickelt. Dies macht es schwierig, zwischen positiver Färbung und Hintergrund zu unterscheiden. Die Entwicklungszeit variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Substratreagens und der Affinität des primären Antikörpers. Wir verwenden helles FeldMikroskopie zur Überwachung der Entwicklung, um eine optimale Färbung zu gewährleisten und gleichzeitig die Hintergrundfärbung zu minimieren. Nach der Färbung kann die richtige Schwellwertbildung während der Analyse helfen, den Hintergrund von positiver Färbung zu unterscheiden. Eine Hauptbeschränkung für dieses Verfahren ist die Unfähigkeit, mehrere Komponenten innerhalb der gleichen Gewebeprobe aufgrund der Verwendung der chromogenen Färbeentwicklung zu färben. Die Immunfluoreszenzanalyse konnte in ähnlicher Weise durchgeführt werden, erfordert jedoch eine Modifikation der in diesem Verfahren diskutierten Werkzeuge.
Speziell für Glioblastom, gibt es eine Reihe von Markern und Zellflecken, die verwendet wurden, um Patienten Proben zu analysieren. Dazu gehören IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 als prognostische Marker sowie CD11b und CD45 für Mikroglia und Makrophagen 18 , 19 . Unsere Methode erweitert diese Art der AnalyseAuf die zelluläre Mikroumgebung, eine oft übersehene Komponente der Tumor-Mikroumgebung im Glioblastom. Die Studien haben die Mikroglia-Präsenz und die Dichte in den Tumoren 20 , 21 , 22 sowie die Beiträge der Astrozyten 9 , 23 , 24 untersucht . Hier haben wir ein Protokoll entwickelt, in dem alle Gliaastrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten untersucht werden - in der Hirntumor-Mikroumgebung und zur Unterscheidung der angrenzenden oder invasiven Regionen des Tumors aus der Tumormasse, bei denen Marker in diesen Tumoren meist identifiziert werden. Auf diese Weise glauben wir, dass wir die Patientensituation genauer beurteilen können, weil wir eine intra-patient Heterogenität festgestellt haben und unsere frühere Publikation zeigte, dass die Analyse dieser Standorte und die Einbeziehung in statistische Modelle bei der Vorhersage von Ergebnissen stärker ist als an Ort und StelleNe oder Gesamtproben 11 . Da die Glioblastom-Invasion so diffus ist, dass es schwierig ist, vollständig 1 , 2 zu resezieren, glauben wir, dass das Gewebe in den angrenzenden Regionen repräsentativ für das nach der Resektion zurückgelassene invasive Gewebe ist, was zu einem unvermeidlichen Rezidiv beiträgt. Daher kann ein besseres Verständnis der angrenzenden Regionen mehr Informationen über Krankheitsrezidiv und Patientenbehandlungsplanung geben, im Gegensatz zu dem traditionell untersuchten Bulk-Gewebe, das vor der Therapie bei Glioblastom-Patienten reseziert wird.
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Disclosures
Keiner.
Acknowledgments
Die Autoren danken Drs. Fahad Bafakih und Jim Mandell für die Erfassung und Identifizierung von Patientenproben, Garrett F. Beeghly für die Unterstützung der Immunhistochemie sowie die Biorepository und Tissue Research Facility, das Herz-Kreislauf-Forschungszentrum Histology Core und die Biomolekulare Analyse-Fazilität an der University of Virginia für die Unterstützung mit Probenerfassung, Immunhistochemie und Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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