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Medicine

Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

doi: 10.3791/56025 Published: July 31, 2017

Summary

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.

Abstract

Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all'interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.

Introduction

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Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un'invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima 1 , 2 . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile 2 , 3 , 4 . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l'invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggiosa 5 , tuttavia poco si sa circa i complessi meccanismi che contribuiscono all'invasione GBM. Il microambiente del tumore, o il tessuto che circonda il cancro, è stato implicato nella progressione dei tumori nei tumori multipli 6 , 7 . Il microambiente del tumore di glioblastoma, in pArticolare, è relativamente poco caratterizzato ed è univoco complesso, composto da cellule gliali multipli, come astrociti, microglia e oligodendrociti, così come matrice extracellulare, fattori solubili e fattori biofisici. Sperimentalmente, gli astrociti e la microglia sono stati dimostrati per aumentare la progressione dell'loma e l'invasione 8 , 9 , 10 , ma la composizione di tutte le cellule gliali nel cervello umano nativo microambiente è sconosciuta.

Abbiamo precedentemente mostrato che i componenti microambientali possono prevedere la sopravvivenza del paziente analizzando quantitativamente i componenti cellulari del microambiente glioblastoma e incorporando le nostre analisi in un modello di rischio proporzionale 11 . Qui descriviamo il metodo di analisi quantitativa per identificare le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale del paziente glioblastomaS. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. La valutazione della percentuale di copertura crea una misurazione semplice per determinare le differenze morfologiche delle cellule, in particolare quelle colpite dalle interazioni con le cellule tumorali. Precedenti studi per la quantificazione della colorazione istopatologica usano la colorazione standard come l'ematoxilina e l'eosin 12 o il tricromo 13 di Masson, che non approfittano della specificità della colorazione immunohistochemica a base di anticorpi. Il nostro metodo è stato sviluppato per quantificare direttamente le popolazioni gliali nelle resezioni tumorali del paziente glioblastoma, che intendiamo utilizzare per chiarire il microambiente complesso di glioblastoma.

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Protocol

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Questo protocollo identifica i componenti cellulari in campioni embedded (FFPE) fissati in formalina, come è tipico per i campioni pazienti clinici bancati. L'incorporazione di paraffina consente la migliore manutenzione della morfologia cellulare e del tessuto, nonché la migliore longevità delle sezioni. I campioni utilizzati per questa analisi sono stati raggiunti attraverso l'Università di Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. I campioni pazienti sono stati selezionati da un neuropatologo basato su una diagnosi definitiva di glioblastoma (astrocitoma, grado IV dell'OMS) che aveva completato resezione tumorale presso l'Università di Virginia tra il 2010 e il 2013 e sono stati identificati prima di questa analisi 11 .

1. Depaffinazione e reidratazione del campione FFPE

NOTA: Questa parte del protocollo è specifica per i campioni FFPE. Mentre i campioni embedded con paraffina possono essere più utili per questa analisi a causa della conservazione cellulare e tEmettere morfologia, questa analisi può anche essere fatta con sezioni congelate. Se si usano sezioni congelate, questa parte può essere omessa e procedere direttamente all'immunohistochemistry cromogenico.

  1. Eseguire le lavaggi seguenti per 5 min ciascuno: Xilene, Xilene, 100% etanolo, 100% etanolo, 95% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, acqua deionizzata, acqua deionizzata

2. Recupero di antigeni

NOTA: Questa parte del protocollo è necessaria per rompere ponti di metilene formati durante la fissazione di formalina di campioni FFPE e di esporre siti antigene per gli anticorpi da legare.

  1. Diluire la soluzione di antigene a pH elevato a base di Tris a raccomandazione del produttore in acqua distillata.
  2. Eseguire il recupero di antigeni mediato dal calore utilizzando un forno a microonde. Basta anche altre forme di recupero a temperature termiche (come la pentola a pressione, il vapore vegetale o l'acqua bollente).
    1. Aggiungere la soluzione diluita a messa a punto in un microfono non sigillatonave. Posizionare le diapositive nella vasca. Posizionare le diapositive in forno a microonde.
    2. Bollite per 20 minuti ad alta potenza. Controllare i livelli liquidi per l'evaporazione e ricostituire con acqua distillata come necessario.
  3. Lasciare raffreddare i campioni in soluzione per 1 ora a temperatura ambiente.

3. Immunohistochemistry cromogenico

  1. Estrarre il campione di tessuto con una penna idrofoba per ridurre al minimo il volume di reagenti necessari per coprire il campione.
    NOTA: Assicurarsi di mantenere i campioni di tessuto idratati e non lasciarli asciugare, in quanto ciò influirà sull'efficacia della colorazione.
  2. Pipettare la soluzione di permeabilizzazione sufficiente (soluzione salina a tampone Tris (TBS) + 0.01% Triton-X) per coprire il campione di tessuti (tipicamente circa 100 - 200 μL).
  3. Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.2.
  4. Incubare i campioni a temperatura ambiente con soluzione di blocco (2,5% cavallo di cavallo + soluzione di permeabilizzazione).
  5. Incubare i campioni durante la notte in 4 ° C con anticorpi primari diluitiNella soluzione di blocco.
    NOTA: Tutti gli anticorpi primari utilizzati qui sono diluiti a 1: 200, ma le diluizioni ottimali possono essere determinate usando diluizioni seriali a partire dalla raccomandazione del produttore. Informazioni dettagliate sugli anticorpi utilizzati in questo protocollo sono stati precedentemente pubblicati 11 .
  6. Rilevare gli anticorpi primari utilizzando un reattore di polimero perossidasi a base di rafano corrispondente all'animale primario di anticorpi, seguendo il protocollo del produttore.
  7. Pipetta la soluzione permeabilizzazione sufficiente per coprire il campione di tessuto e incubare per 5 min.
  8. Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.7.
  9. Incubare le diapositive in 0,3% di H 2 O 2 in 1x TBS per 15 minuti.
  10. Sviluppare campioni con un substrato perossidasi diaminobenzidina (DAB) per 2 - 10 minuti fino a raggiungere la desiderata intensità della macchia.
  11. Contrassegnare campioni per identificare nuclei cellulari, come ad esempio l'ematossilina, seguendo il protocollo del produttore.
  12. Campioni di deidrato con 100%Etanolo e xilene.
  13. Montare i campioni in modo permanente con i supporti di montaggio.

4. Identificazione delle regioni d'interesse

  1. Slide di immagini sotto microscopia luminosa in grado di immagini ad alta risoluzione.
    NOTA: utilizzare i componenti cellulari di imaging con una risoluzione minima di 20x.
  2. Spostare la fotocamera a determinate aree di interesse in tutti i campioni di tessuto.
  3. Salvare le immagini come file TIFF per la quantificazione.

5. Analisi delle immagini

  1. Apri le immagini in ImageJ per la quantificazione della copertura percentuale.
  2. Utilizza il plugin di Threshold Color per rimuovere il colore viola dai nuclei colorati da ematossilina.
  3. Convertire l'immagine a 8 bit.
  4. Aggiungere soglia senza sfondo scuro.
  5. Immagine di processo usando uno dei 17 filtri di soglia ImageJ preimpostati ( cioè MaxEntropy), quindi solo le porzioni macchiate DAB sono incluse nella soglia.
    NOTA: Selezionare il filtro soglia ottimale preimpostato che minimizzaInclusione della colorazione di fondo. Ciò può dipendere dalla qualità della colorazione e dalla specificità dell'anticorpo. Utilizzare la stessa soglia per tutte le repliche tecniche all'interno di ciascun campione del paziente.
  6. Applica la soglia.
  7. Misura l'area percentuale di immagine soglia.
  8. Copertura area percentuale media per più regioni all'interno di ciascun campione.

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Representative Results

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Per questa analisi sono state identificate due regioni di interessi all'interno delle nostre rese tumorali - la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composta principalmente da tessuti sani con cellule tumorali invasive diffuse ( Figura 1A , 1B ) - sono stati identificati collaborando neuropatologi con pazienti affetti da ematossilina ed eosina campioni. All'interno di ogni campione di pazienti è stata identificata una colorazione positiva per gli astrociti ( Figura 1C ), microglia ( Figura 1D ) e oligodendrociti ( Figura 1E ) mediante immunohistochemistry cromogeno. Queste popolazioni sono state identificate utilizzando gli anticorpi primari ALDH1L1, Iba1 e Oligodendrocyte-Specific Protein (OSP1) rispettivamente 11 . Si consiglia di ottimizzare le diluizioni degli anticorpi, nonché di consultare i protocolli del produttore per verificare se la colorazione sia accurata e positiva ( Figura 2 ). Ad esempio, abbiamo eseguito la colorazione senza anticorpi primari per un controllo negativo ( Figura 2A ), il produttore ha raccomandato ( Figura 2B ) e ulteriori diluizioni ( Figura 2C , 2D ) prima di risolvere la diluizione 1: 200 ( Figura 2C ) dovuta La colorazione ottimale ottimale del corpo e dei processi cellulari riducendo al minimo lo sfondo dell'anticorpo anti-ALDH1L1.

Utilizzando ImageJ, la copertura percentuale di colorazione OSP1 + oligodendrocyte è stata quantificata per confrontare le differenze nelle nostre regioni di interesse ( Figura 3A ). Abbiamo rimosso i nuclei contratti dall'immagine usando il plug-in Threshold Color per valutare solo la colorazione DAB positiva ( Figura 3B ). Dopo aver convertire l'immagine in 8 bit (Ss = "xfig"> Figura 3C), abbiamo quindi applicato la soglia di default MaxEntropy alla rimanente colorazione DAB positiva ( Figura 3D ). Qui abbiamo usato la soglia di default di MaxEntropy perché questa particolare soglia predefinita ha catturato meglio la nostra macchia positiva riducendo al minimo lo sfondo, ma diverse soglie possono essere utilizzate per garantire l'analisi della popolazione di interesse. Una volta che la soglia appropriata è stata applicata all'immagine ( Figura 3E ), la copertura percentuale della soglia può essere misurata ( Figura 3F ) e confrontata per più pazienti. Qui abbiamo quantificato 3 - 5 aree all'interno di ciascuna regione di interesse, a seconda dell'area totale della regione di interesse, e abbiamo confrontato i gruppi usando t-test accoppiati con il software GraphPad Prism. Abbiamo anche confrontato le nostre analisi GBM con la corrispondente colorazione trovata in tessuti cerebrali sani nel database Atlas Proteina ( Figura 3F ). Nel nostro In precedenza, abbiamo utilizzato questa analisi per più componenti microenvrionmentali (astrociti, microglia, oligodendrociti e vasi sanguigni) in 33 pazienti per sviluppare un modello di rischio proporzionale per prevedere la sopravvivenza complessiva del paziente 11 .

Figura 1
Figura 1 : confronto di aree tumorali e tumorali adiacenti di interesse per le cellule gliali.
A) Tutto il campione tumorale del paziente 63 colorato con ematossilina e eosina con massa e regioni adiacenti indicati. B) colorazione ematossilina e eosina, C) astrociti ALDH1L1 +, D) Iba1 + microglia e E) Oligodendrocyte Specific Protein-1 (OSP1) + oligodendrociti. Barra di scala = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : Titolazione dell'esempio di anticorpi anti-ALDH1L1.
A) Controllo negativo, B) 1:70 raccomandazione del produttore diluizione da magazzino, C) Diluizione 1: 200 da magazzino e D) Diluizione 1: 400 da magazzino. La diluizione 1: 200 è stata utilizzata per la colorazione e l'analisi a causa della colorazione ottimale ottimale del corpo cellulare e dei processi con riduzione dello sfondo. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 : Analisi di ImageJ e Quantificazione della copertura dell'area per gli oligodendrociti.
A) La colorazione OSP1 + originale del paziente 52. B) Rimozione di nuclei viola utilizzando il plugin Threshold_Colour. C) Conversione a 8 bit. D) la soglia MaxEntropy catturata e E) applicata per ridurre al minimo la colorazione di fondo. F) Confronto delle regioni adiacenti e massime in cinque campioni di pazienti, nonché del tessuto cerebrale sano attraverso l'Atlas Proteina, per la copertura percentuale di OSP1 +. *** p <0.001, **** p <0.0001 tramite t-test accoppiati. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l'analisi dei campioni istologici macchiati usando l'immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell'eterogeneità associata ai tumori e ricapitolazione precisa dei tumori per studi in vitro.

Questo protocollo dimostra una tecnica diretta per analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno del microambiente del tumore del cervello. Questa tecnica è ampiamente adattabile e può essere ampliata per identificare molti altri componenti del microambiente, come i vasi sanguigni, le chemochine e altri, nonché altri tumori, come il seno o il pancreas, dove le resezioni tumorali possono avereRegioni di parenchima più grandi. Inoltre, questa tecnica può essere adattata per acquisire altre misurazioni, come conteggi e perimetro delle cellule per valutare la forma cellulare, così come risultati più complessi di isotopia, clustering, orientamento e altro ancora. Queste tecniche non sono anche limitate al cancro, in quanto queste metodologie di colorazione e di quantificazione possono essere utilizzate per qualsiasi analisi del cervello, come dimostrato nella nostra quantificazione del tessuto sano della Atlanta proteica rappresentativa e del nostro confronto pubblicato in precedenza con il tessuto cerebrale epilettico 11 .

I punti critici all'interno di questo protocollo comprendono l'adeguata incubazione e lo sviluppo del secondario cromogenico. La cura deve essere presa in modo tale che la tintura cromogena non si sviluppi in maniera eccessiva. Questo renderà difficile differenziare la colorazione e lo sfondo. Il tempo di sviluppo varia a seconda del reagente del substrato utilizzato e dell'affinità dell'anticorpo primario. Usiamo il campo luminosoMicroscopia per monitorare lo sviluppo per assicurare una colorazione ottimale, minimizzando la colorazione della priorità bassa. Dopo la colorazione, una corretta soglia durante l'analisi può contribuire a differenziare il background dalla colorazione positiva. Una limitazione importante per questo metodo è l'incapacità di macchiare più componenti all'interno dello stesso campione di tessuto a causa dell'uso dello sviluppo di colorazione cromogena. L'analisi dell'immunofluorescenza potrebbe essere condotta in modo simile, ma richiede la modifica degli strumenti descritti in questo metodo.

Specifiche al glioblastoma, ci sono un certo numero di marcatori e macchie cellulari che sono state utilizzate per analizzare i campioni dei pazienti. Questi includono IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 come marcatori prognostici, così come CD11b e CD45 per microglia e macrofagi 18 , 19 . Il nostro metodo espande questo tipo di analisiAl microambiente cellulare, una componente spesso trascurata del microambiente tumorale in glioblastoma. Gli studi hanno esaminato la presenza e la densità di microglia nei tumori 20 , 21 e 22 , così come i contributi degli astrociti 9 , 23 , 24 . Qui abbiamo sviluppato un protocollo che esamina tutti gli astrociti, microglia e oligodendrociti - nel microambiente del tumore del cervello e per differenziare le regioni adiacenti o invasive del tumore dalla massa tumorale, dove sono identificati marcatori in questi tumori. Facendo questo, crediamo di poter valutare con maggiore precisione la situazione del paziente perché abbiamo determinato l'eterogeneità intra-paziente e la nostra precedente pubblicazione ha mostrato che l'analisi di queste posizioni e l'inclusione in modelli statistici è più forte a prevedere i risultati di una posizione altraNe o campioni complessivi 11 . Inoltre, dal momento che l'invasione di glioblastoma è così diffusa, rendendo difficile la resezione completamente 1 , 2 , crediamo che il tessuto nelle regioni adiacenti sia più rappresentativo del tessuto invasivo lasciato dopo la resezione, che contribuisce a una recidiva inevitabile. Pertanto, una migliore comprensione delle regioni adiacenti può dare maggiori informazioni sulla ricorrenza delle malattie e la pianificazione del trattamento dei pazienti, a differenza del tessuto bulk tradizionalmente studiato che è resecato prima della terapia nei pazienti con glioblastoma.

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Disclosures

Nessuna.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano i dottori. Fahad Bafakih e Jim Mandell per l'acquisizione e l'identificazione di campioni di pazienti, Garrett F. Beeghly per l'assistenza con immunohistochemistry e il Biorepository and Tissue Research Facility, il Centro di Histologia del Centro Cardiovascolare e l'Analisi Biomolecolare presso l'Università di Virginia per assistenza L'acquisizione di campioni, l'immunohistochemistry e l'imaging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution Vector Labs H-3301
TBS
Triton-X Amresco 9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1  abcam  ab56777
Anti-Iba1  abcam  ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1  abcam  ab53041
ImmPRESS anti-goat Vector Labs MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) Vector Labs MP-7500
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich 216763
ImmPACT DAB substrate Vector Labs SK-4105
Hematoxylin counterstain ThermoScientific 72404
Histochoice Mounting Media Amresco H157-475
Aperio Scanscope Leica Biosystems
Image Scanscope Leica Biosystems
Super HT PAP Pen Research Products International 195506

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References

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Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente
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Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).More

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).

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