Summary
このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。
Abstract
腫瘍の微小環境への関心が高まっているため、致命的で最も侵襲性の脳腫瘍であるグリア芽細胞腫の患者サンプル内の微小環境成分を特異的に決定する方法を開発しました。定量的方法は、病変組織を正確に記述するのに有益であるばかりでなく、より正確な予後、診断、および組織工学システムおよび置換の開発に潜在的に寄与し得る。グリア芽細胞腫では、グリア細胞（例えば、ミクログリアおよび星状細胞）は、病理学者のグレーディングに基づいて予後不良と独立に相関している。しかしながら、これらの細胞および他のグリア細胞成分の状態は、定量的に十分に記載されていない。これは、これらのグリア細胞を標識する大きなプロセスのために困難であり得る。さらに、大部分の組織学的分析は、全体的な組織サンプルに焦点を当てるか、または腫瘍の大部分内のみに焦点を当てるが、領域に基づく定量化を描写するのではなく高度に異種の組織である。ここで、我々は、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定し、定量的に分析するための方法を記載する。本発明者らは、染色体免疫組織化学を用いて、患者の腫瘍切除におけるグリア細胞集団を同定し、ImageJは、各グリア集団についての染色のカバレッジ率を分析した。これらの技術を用いて、神経膠腫腫瘍微小環境の領域全体にわたってグリア細胞をよりよく記述することができる。
Introduction
神経膠芽腫（GBM）、最も一般的な悪性脳腫瘍は、周囲の健康な脳実質1,2に原発腫瘍塊から高度に拡散侵入によって特徴付けられます。この拡散侵入は完全に切除する腫瘍は特に難しくなり、治療後のまま侵入癌細胞は避けられない再発2、3、4のための最も一般的な理由です。以前、我々は、しかし、少しはGBM浸潤に貢献する複雑なメカニズムについて知られている、5治療上有益であることがびまん性神経膠腫細胞の浸潤を阻害することが分かりました。腫瘍微小環境、または癌を取り囲む組織は、複数の癌6,7における腫瘍の進行に関与しています。グリア芽腫腫瘍の微小環境、p星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞などの複数のグリア細胞、ならびに細胞外マトリックス、可溶性因子および生物物理学的因子を構成する、比較的特徴が低く、独特に複雑である。実験的に、アストロサイトおよびミクログリアは10、9、神経膠腫の進行および浸潤8を増加させることが示されているが、天然のヒトの脳の微小環境内のすべてのグリア細胞の組成は不明です。
我々は以前微小環境のコンポーネントが定量的に神経膠芽腫微小環境の細胞成分を分析し、比例ハザードモデル11に、私たちの分析を組み込むことにより、患者の生存を予測することができます示しました。ここでは、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定するための定量分析方法を説明するs。我々は、グリア細胞集団を同定するために発色免疫組織化学を使用し、各グリア集団の染色のカバレッジ率を分析するためにImageJを使用した。カバレッジ率を評価すると、細胞、特にがん細胞との相互作用によって影響を受ける細胞の形態学的相違を決定するための簡単な測定が行われます。組織病理学的染色を定量化するための以前の研究では、抗体ベースの免疫組織化学染色の特異性を利用していないヘマトキシリンおよびエオシン12またはマッソントリクロム13などの標準染色を使用しています。本発明者らの方法は、グリア芽細胞腫患者の腫瘍切除物中のグリア個体群を直接定量化するために開発されたものであり、これは複雑なグリア芽細胞腫の微小環境を解明することを目的とする。
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Protocol
このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル中の細胞成分を同定する。パラフィン包埋により、細胞形態および組織形態の最良の維持が可能になるばかりでなく、切片の長寿命が向上する。この分析に用いたサンプルは、University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facilityを介してアクセスしました。患者サンプルは、2010年から2013年の間にバージニア大学で腫瘍切除術を完了したグリア芽細胞腫（星状細胞腫、WHOグレードIV）の確定診断に基づいて神経病理学者によって選択され、この分析の前に同定解除された11 。
FFPEサンプル脱パラフィンおよび再水和
注：プロトコルのこの部分は、FFPEサンプルに固有です。パラフィン包埋されたサンプルは、細胞およびtの保存のために、この分析のためにより有用であり得るが形態解析を行う場合、この解析はフリーズしたセクションでも行うことができます。凍結切片を使用する場合は、この部分を省略して、発色免疫組織化学に直接進むことができる。
- キシレン、キシレン、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、脱イオン水、脱イオン水
抗原検索
注：プロトコールのこの部分は、FFPEサンプルのホルマリン固定中に形成されたメチレン架橋を破壊し、抗体が結合する抗原部位を露出させるために必要である。
- トリスをベースとする高pH抗原非マスキング溶液を蒸留水中の製造業者推奨で希釈する。
- マイクロウェーブを用いて熱媒介抗原回収を行う。他の形態の熱媒介回収（圧力鍋、野菜蒸し器、または沸騰水など）でも十分である。
- 希釈されたマスク除去溶液を密封されていない電子レンジに加える容器。スライドを容器に入れる。スライドを電子レンジに置きます。
- 高出力で20分間沸騰させる。蒸発のための液体レベルをモニターし、必要に応じて蒸留水を補充します。
- 試料を室温で1時間溶液中で冷却させる。
3.発色免疫組織化学
- サンプルをカバーするために必要な試薬の量を最小限にするために、疎水性ペンで組織サンプルを輪郭を描きます。
注：組織サンプルを水和させた状態に保ち、染色効果に影響するため乾燥させないでください。 - 組織サンプル（典型的には約100〜200μL）を覆うのに十分な透過性溶液（トリス緩衝化生理食塩水（TBS）+ 0.01％Triton-X）をピペットで加える。
- 溶液を除去して廃棄し、ステップ3.2を繰り返す。
- ブロッキング溶液（2.5％ウマ血清+透過液）で室温でサンプルをインキュベートする。
- サンプルを4℃で一晩インキュベートし、一次抗体を希釈ブロッキング溶液中でインキュベートする。
注：ここで使用したすべての一次抗体は1：200で希釈しますが、製造業者の推奨事項から始めて連続希釈を使用して最適希釈を決定することができます。このプロトコールで使用される抗体の詳細な情報は、以前に公開された11 。 - 最初の抗体宿主動物に対応する西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー試薬を使用して、製造元のプロトコルに従って、一次抗体を検出する。
- 組織試料を覆い、5分間インキュベートするのに十分な透過性溶液をピペットで加える。
- 溶液を除去して廃棄し、ステップ3.7を繰り返す。
- スライドを1x TBS中の0.3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。
- 所望の染色強度が得られるまで、ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて2〜10分間サンプルを展開する。
- サンプルを対比染色し、ヘマトキシリンなどの細胞核を、製造業者のプロトコルに従って同定する。
- サンプルを100％脱水し、エタノールおよびキシレン。
- サンプルをマウントメディアで恒久的にマウントします。
4.関心領域
- 高解像度画像が可能な明視野顕微鏡下の画像スライド。
注：イメージングセルラーコンポーネントは、最低20倍の解像度で使用してください。 - 組織サンプル全体の関心領域にカメラを移動します。
- 定量化のために画像をTIFFファイルとして保存します。
5.画像解析
- カバレッジ率の定量化のためImageJで画像を開きます。
- ヘマトキシリン染色された核から紫色を除去するには、Threshold Colorプラグインを使用します。
- 画像を8ビットに変換します。
- 暗い背景なしでしきい値を追加します。
- 17個の予めロードされたImageJ閾値フィルタ（ すなわち MaxEntropy）の1つを使用して画像を処理し、DAB染色部分のみが閾値に含まれるようにする。
注：minimizの最適な事前ロードされたしきい値フィルタを選択してくださいバックグラウンド染色の包含。これは、抗体の染色性および特異性に依存し得る。各患者サンプル内のすべての技術的複製に同じ閾値を使用する。 - しきい値を適用します。
- 閾値処理された画像の面積％を測定する。
- 各サンプル内の複数の領域の平均カバレッジ面積。
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Representative Results
この分析のために、原発腫瘍バルクおよび拡散した浸潤性癌細胞を有する健康な組織（ 図1A 、 1B ）を主に含む隣接領域の2つの関心領域を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色患者の神経病理学者と共同して同定したサンプル。各患者サンプル内で、発色免疫組織化学によるアストロサイト（ 図1C ）、ミクログリア（ 図1D ）、および希突起膠細胞（ 図1E ）の陽性染色が同定された。これらの集団は、それぞれ一次抗体ALDH1L1、Iba1、および乏突起膠細胞特異的タンパク質（OSP1）を用いて同定された11 。抗体希釈液の最適化と、染色が正確で陽性であるかどうかを確認するための製造業者のプロトコールとの協議が推奨される （ 図2 ）。例えば、陰性対照（ 図2A ）、製造業者推奨（ 図2B ）、およびさらなる希釈（ 図2C 、 2D ）のために一次抗体を用いずに染色を行った（ 図2C ）。抗ALDH1L1抗体のバックグラウンドを最小限に抑えた、細胞体およびプロセスの最適な陽性染色。
ImageJを用いて、OSP1 +希突起膠細胞染色の被覆率を定量化し、最終的に関心領域の差異を比較した（ 図3A ）。陽性DAB染色のみを評価するために、Threshold Colorプラグインを使用して画像から対比染色された核を除去した（ 図3B ）。画像を8ビットに変換した後（ss = "xfig">図3C）、我々は残りの陽性DAB染色（ 図3D ）にMaxEntropyデフォルト閾値を適用した。ここでは、MaxEntropyしきい値のデフォルト値を使用しました。これは、この特定のデフォルトしきい値がバックグラウンドを最小限に抑えながらポジティブなシングを捕捉したためですが、異なるしきい値を使用して関心のある集団の分析を確実に行うことができます。適切な閾値が画像に適用されると（ 図3E ）、閾値からのカバレッジ率を測定することができ（ 図3F ）、複数の患者について比較することができる。ここでは、関心領域の総面積に応じて、各関心領域内の3〜5領域を定量し、GraphPad Prismソフトウェアとのペアt検定を使用して比較したグループを比較した。我々はまた、我々のGBM分析を、プロテインアトラスデータベース（ 図3F ）の健康な脳組織に見られる対応する染色と比較した。私たちの中で前回の発表では、この分析を33人の患者の複数の微小血管成分（星状細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞および血管）に使用して、患者全体の生存率を予測するための比例ハザードモデルを開発した11 。
図1 ：グリア細胞に対する腫瘍バルクおよび腫瘍隣接領域の比較。
A）ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された患者63の全腫瘍サンプルは、バルクおよび隣接領域が示されている。 B）ヘマトキシリンおよびエオシン染色、 C） ALDH1L1 +星状細胞、 D） Iba1 +ミクログリアおよびE）乏突起膠細胞特異的タンパク質-1（OSP1）+乏突起膠細胞。スケールバー=100μm。 25fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：抗ALDH1L1抗体の滴定の例。
A）陰性対照、 B）ストックから1:70の製造業者推奨希釈、 C）ストックからの1：200希釈、およびD）ストックからの1：400希釈。 1：200希釈を、細胞体の最適な陽性染色およびバックグラウンドを最小にするプロセスのために、染色および分析に使用した。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3 ：乏突起膠細胞のAreaJの画像解析と定量化。
A）オリジナルのOSP1 +患者52の染色。B） Threshold_Colourプラグインを使用して紫色の核を除去する。 C） 8ビットへの変換。 D） MaxEntropy閾値を捕捉し、 E）バックグラウンド染色を最小限に抑えるために適用した。 F） OSP1 +カバレッジ率について、プロテインアトラスを介した健康な脳組織と同様に、5人の患者サンプルにおける隣接領域およびバルク領域の比較。 *** p <0.001、**** p <0.0001。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提案された我々の方法は、伝統的な発色免疫組織化学を用いて染色された組織学的試料を分析する定量的アプローチである。このタイプの分析のための現在の方法論には、同様の染色プロトコール、続いて独立した病理学者による採点が含まれる。この方法は信頼性がありましたが、多くのアプリケーションでは、腫瘍に関連する異種性のより良い理解やin vitro研究のための腫瘍の正確な再現など、細胞構成のより正確な理解が必要です。
このプロトコルは、脳腫瘍微小環境内のグリア細胞の集団を定量的に分析するための直接的な技術を実証する。この技術は広く適応可能であり、血管、ケモカインなどの微小環境の他の多くの成分、ならびに乳房または膵臓のような他の癌を同定するために拡大することができ、腫瘍切除術ではより大きい実質領域。さらに、この技術は、細胞の形状、さらにより複雑な形態学的結果等方性、クラスター化、方向付けなどを評価するために、細胞のカウントおよび細胞周囲などの他の測定値を取得するために適合させることができる。これらの技術はまた、癌に限定されるものではない、という点で、これらの染色および定量化の方法論は、任意の脳のために使用することができる健康な組織の私達の代表タンパク質アトラスの定量化、およびてんかん脳組織11との以前に発表された比較で示したように、分析しています。
このプロトコール内の重要なステップには、適切なインキュベーションと発色二次発色が含まれます。発色色素が過度に発達しないように注意しなければならない。これにより、陽性染色とバックグラウンドとを区別することが困難になる。展開時間は、使用される基質試薬および一次抗体の親和性に依存して変化する。明るいフィールドを使用しますバックグラウンド染色を最小限に抑えながら最適な染色を保証するために、顕微鏡を用いて発色をモニターする。染色後、分析中の適切な閾値処理は、バックグラウンドを陽性染色から区別するのに役立ち得る。この方法の主な制限は、発色染色の使用のために同じ組織サンプル内の複数の成分を染色することができないことである。免疫蛍光分析も同様の方法で行うことができるが、この方法で論じたツールの改変が必要である。
グリア芽腫に特異的に、患者サンプルを分析するために使用された多数のマーカーおよび細胞染色が存在する。これらはIDH1 14、15、16のEGFRvIII、予後マーカーとして17、ならびにCD11bおよびCD45ミクログリアおよびマクロファージ18,19を含みます。我々の方法はこのタイプの分析を拡大するグリア芽細胞腫の腫瘍微小環境のしばしば見落とされる成分である細胞微小環境に影響を及ぼす。研究は、腫瘍20、21、22、並びにアストロサイト9、23、24の寄与におけるミクログリアの存在および密度を見てきました。ここで我々は、脳腫瘍の微小環境において、グリア星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞のすべてを調べるプロトコールを開発し、腫瘍の隣接または侵襲領域を腫瘍バルクから区別した。これを行うことで、患者内の異質性を判断したため、患者の状況をより正確に評価できると考えており、以前の発表では、これらの部位の分析と統計モデルへの組み込みは、neまたは全体のサンプル11 。神経膠芽腫の侵略がとてもびまん性であるので、それは難しい完全に1、2を切除すること、我々は隣接する領域内の組織が避けられない再発に寄与し、切除後に残さ侵襲的な組織、より多くの代表であると考えています。したがって、膠芽細胞腫患者の治療に先立って切除された伝統的に研究されたバルク組織とは対照的に、隣接領域のより良い理解は、疾患の再発および患者治療計画についてのより多くの情報を提供し得る。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
著者らはDrs。 Fahad BafakihとJim Mandellによる患者サンプルの取得と同定、Garrett F. Beeghlyの免疫組織化学補助、Biorepository and Tissue Research Facility、心血管研究センターHistology Core、およびバージニア大学のBiomolecular Analysis Facility試料採取、免疫組織化学、および画像化が含まれる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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