Summary
Denne protokollen ble utviklet for kvantitativt å identifisere tumor mikromiljø komponenter i glioblastom pasient reseksjonene ved hjelp av kromogen immunhistokjemi og ImageJ.
Abstract
Med den økende interessen for tumormikromiljøet, satte vi oss for å utvikle en metode for spesifikt å bestemme mikromiljøkomponentene i pasientprøver av glioblastom, den dødeligste og mest invasive hjernekreft. Ikke bare er kvantitative metoder som er fordelaktige for nøyaktig å beskrive syke vev, de kan også potensielt bidra til mer nøyaktig prognose, diagnose og utvikling av vev-konstruerte systemer og erstatninger. I glioblastom har glialceller, slik som mikroglia og astrocytter, vært uavhengig korrelert med dårlig prognose basert på patologisk klassifisering. Imidlertid er tilstanden til disse cellene og andre glialcellekomponenter ikke blitt godt beskrevet kvantitativt. Dette kan være vanskelig på grunn av de store prosessene som markerer disse glialcellene. Videre fokuserer de fleste histologiske analyser på den samlede vevsprøven eller bare i størstedelen av svulsten, i motsetning til å avgrense kvantifikasjoner basert på regioner hviteHin det høyt heterogene vevet. Her beskriver vi en metode for å identifisere og kvantitativt analysere populasjonene av glialceller innenfor tumorvolumet og tilstøtende områder av tumorresisteksjoner fra glioblastompatienter. Vi brukte kromogen immunhistokjemi for å identifisere glialcellepopulasjonene i pasienttumorreseksjoner og ImageJ for å analysere prosent dekning av farging for hver glialpopulasjon. Med disse teknikkene er vi i stand til bedre å beskrive glialceller gjennom regioner av gliomaskomikromiljøet.
Introduction
Glioblastom (GBM), den vanligste og ondartede hjernekreft, kjennetegnes av svært diffus invasjon fra den primære tumorvolum i den omkringliggende raske hjernen parenchyma 1 , 2 . Denne diffuse invasjonen gjør svulsten spesielt vanskelig å resektere fullt ut, og de invaderende kreftceller som forblir etterbehandling er den vanligste årsaken til uunngåelig gjentakelse 2 , 3 , 4 . Tidligere fant vi inhibering av den diffuse gliomcellens invasjon for å være terapeutisk gunstig 5 , men lite er kjent om de komplekse mekanismene som bidrar til GBM-invasjonen. Vaskemikrovernet eller vevet som omgir kreften, har blitt involvert i utviklingen av svulster i flere kreftformer 6 , 7 . Glioblastom-tumormikromiljøet, på sArtikulær, er relativt under-karakterisert og er unikt kompleks, komponering av flere glialceller, som astrocytter, microglia og oligodendrocytter, så vel som ekstracellulær matrise, oppløselige faktorer og biofysiske faktorer. Eksperimentelt har astrocytter og microglia vist seg å øke gliomprogresjonen og invasjonen 8 , 9 , 10 , men sammensetningen av alle glialceller i den native menneskelige hjernemiljø er ikke kjent.
Vi tidligere viste at mikromiljøkomponenter kan forutsi pasientoverlevelse ved kvantitativt å analysere cellulære komponenter av glioblastom mikromiljøet og inkorporerer våre analyser i en proporsjonal fare modell 11 . Her beskriver vi den kvantitative analysemetoden for å identifisere populasjonene av glialceller innenfor tumorvolumet og tilstøtende områder av tumorresisteksjoner fra glioblastompasientens. Vi brukte kromogen immunhistokjemi for å identifisere glialcellepopulasjonene og ImageJ for å analysere prosent dekning av farging for hver glialpopulasjon. Vurdering av prosent dekning skaper en enkel måling for å bestemme morfologiske forskjeller i celler, spesielt de som påvirkes av interaksjoner med kreftceller. Tidligere studier for kvantifisering av histopatologisk farging bruker standardfarging som hematoksylin og eosin 12 eller Masson's trichrome 13 , som ikke utnytter spesifisiteten av antistoffbasert immunhistokjemisk farging. Vår metode ble utviklet for direkte kvantifisering av glialpopulasjonene innen glioblastom pasienttumorreseksjoner, som vi tar sikte på å bruke til å belyse det komplekse glioblastom mikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen identifiserer cellulære komponenter i formalin-fikserte paraffin-innebygde (FFPE) prøver, som er typisk for kliniske pasientprøver fra banker. Paraffin-embedding muliggjør det beste vedlikehold av cellulær og vevsmorfologi, så vel som har bedre levetid for seksjoner. Prøvene som ble brukt til denne analysen ble benyttet gjennom University of Virginia Biorepository og Tissue Research Facility. Pasientprøver ble utvalgt av en nevropatolog basert på en endelig diagnose av glioblastom (astrocytom, WHO klasse IV) som hadde fullført tumorreseksjon ved Universitetet i Virginia mellom 2010 og 2013, og ble deidentifisert før denne analysen 11 .
1. FFPE Prøve Deparaffinisering og Rehydrering
MERK: Denne delen av protokollen er spesifikk for FFPE-prøver. Mens paraffin-innebygde prøver kan være mer nyttige for denne analysen på grunn av bevaring av cellulære og tUtgjøre morfologi, kan denne analysen også gjøres med frosne seksjoner. Hvis du bruker frosne seksjoner, kan denne delen utelates og fortsette direkte til kromogen immunhistokjemi.
- Utfør følgende vasker i 5 minutter hver: Xylen, Xylen, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, deionisert vann, deionisert vann
2. Antigen gjenfinning
MERK: Denne delen av protokollen er nødvendig for å bryte metylenbroer dannet under formalinfiksering av FFPE-prøver og eksponere antigensteder for antistoffer for binding.
- Fortynn Tris-basert høy pH-antigen-løsningsmiddelløsning ved produsentens anbefaling i destillert vann.
- Utfør varmemediert antigenhenting ved hjelp av mikrobølgeovn. Andre former for varmemediert gjenvinning (som trykkkokeren, vegetabilsk dampkoker eller kokende vann) vil også være tilstrekkelig.
- Tilsett den fortynnede løsningsmiddelløsningen i en ikke-forseglet mikrobølgeovnfartøyet. Plasser lysbildene i karet. Plasser lysbildene i mikrobølgeovn.
- Kok i 20 minutter ved høy effekt. Overvåk væskenivåer for fordampning, og fyll på med destillert vann etter behov.
- La prøvene avkjøles i oppløsning i 1 time ved romtemperatur.
3. Kromogen immunhistokjemi
- Skisse vevsprøve med en hydrofob pen for å minimere volumet av reagenser som er nødvendige for å dekke prøven.
MERK: Pass på at vevsprøver blir hydrert og ikke la dem tørke ut, da dette vil påvirke flekkingseffekten. - Pipett nok permeabiliseringsløsning (Tris-buffret saltvann (TBS) + 0,01% Triton-X) for å dekke vevsprøve (vanligvis ca. 100-200 μL).
- Fjern og kast løsningen og gjenta trinn 3.2.
- Inkuber prøver ved romtemperatur med blokkeringsløsning (2,5% hesteserum + permeabiliseringsløsning).
- Inkuber prøver over natten i 4 ºC med primære antistoffer fortynnetI blokkering løsning.
MERK: Alle primære antistoffer som brukes her, er fortynnet til 1: 200, men optimale fortynninger kan bestemmes ved bruk av serielle fortynninger som starter med produsentens anbefaling. Detaljert informasjon om antistoffer anvendt i denne protokollen ble tidligere publisert 11 . - Registrere primære antistoffer ved å bruke et pepperrotperoxidase-polymerreagens som svarer til det primære antistoffvertsdyret, etter produsentprotokollen.
- Pipet nok permeabiliseringsløsning for å dekke vevsprøve og inkuber i 5 min.
- Fjern og kast løsningen og gjenta trinn 3.7.
- Inkuber objektglass i 0,3% H 2 O 2 i 1 x TBS i 15 minutter.
- Utvikle prøver med et peroksidase diaminobenzidin (DAB) substrat i 2 - 10 min til ønsket flakintensitet oppnås.
- Motstå prøver for å identifisere cellekjerner, for eksempel med hematoksylin, etter produsentprotokoll.
- Dehydrere prøver med 100%Etanol og xylen.
- Monter prøvene permanent med monteringsmedier.
4. Regionsinteressidentifikasjon
- Bildeglass under lysfeltmikroskopi med høyoppløselige bilder.
MERK: Bruk billedkomponenter med minst 20x oppløsning. - Flytt kameraet til bestemte områder av interesse gjennom vevsprøver.
- Lagre bilder som TIFF-filer for kvantifisering.
5. Bildeanalyse
- Åpne bilder i ImageJ for kvantifisering av prosent dekning.
- Bruk terskelfarge-plugin for å fjerne lilla farge fra hematoksylin-farget kjerne.
- Konverter bilde til 8-bit.
- Legg til terskel uten mørk bakgrunn.
- Prosessbilde ved hjelp av ett av de 17 forhåndsdefinerte ImageJ-terskelfiltrene ( dvs. MaxEntropy), så bare DAB-fargete deler er inkludert i terskelen.
MERK: Velg det optimale forhåndsbelastede terskelfilteret som minimererEs inkludering av bakgrunnsfarger. Dette kan avhenge av kvaliteten på flekker og spesifisitet av antistoff. Bruk samme terskel for alle tekniske kopier i hver pasientprøve. - Bruk terskel.
- Mål prosentområde av terskelt bilde.
- Gjennomsnittlig prosentarealdekning for flere regioner innenfor hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For denne analysen ble to regioner av interesser innenfor våre svulstreseksjoner - primærtørkemasse og tilstøtende regioner, hovedsakelig sammensatt av sunt vev med diffus invaderende kreftceller ( figur 1A , 1B ) - identifisert av samarbeidende nevropatologer på hematoksylin og eosin-farget pasient prøver. Innenfor hver pasientprøve ble positiv farging for astrocytter ( figur 1C ), microglia ( figur 1D ) og oligodendrocytter ( figur 1E ) ved hjelp av kromogen immunhistokjemi identifisert. Disse populasjonene ble identifisert ved anvendelse av primære antistoffer ALDH1L1, Iba1 og Oligodendrocyte-Specific Protein (OSP1) henholdsvis 11 . Optimalisering av antistoff fortynninger anbefales, samt konsultasjon med produsentprotokoller for å bekrefte at farging er nøyaktig og positiv ( Figur 2 ). For eksempel utførte vi farging uten primær antistoff for negativ kontroll ( Figur 2A ), produsentens anbefalte ( Figur 2B ) og ytterligere fortynninger ( Figur 2C , 2D ) før oppgjør på 1: 200 fortynningen ( Figur 2C ) på grunn av Optimal positiv farging av cellelegemet og prosesser med minimalisering av bakgrunnen for anti-ALDH1L1 antistoffet.
Ved hjelp av ImageJ ble prosentandekningen av OSP1 + oligodendrocytfarging kvantifisert for å til slutt sammenligne forskjeller i våre interessegrupper ( figur 3A ). Vi fjernet de motstridte kjernene fra bildet ved hjelp av Terskelfarge-plugin for å bare vurdere den positive DAB-fargingen ( Figur 3B ). Etter konvertering av bildet til 8bit (Ss = "xfig"> Figur 3C), anvendte vi deretter MaxEntropy standard terskelen til den gjenværende positive DAB-fargingen ( Figur 3D ). Her brukte vi MaxEntropy-terskelstandarden fordi denne spesielle standardterskelen best fanget vår positive flekk mens du minimerer bakgrunnen, men forskjellige terskler kan brukes til å sikre analyse av interessepopulasjonen. Når riktig terskel er brukt på bildet ( Figur 3E ), kan prosentverdien dekning fra terskelen måles ( figur 3F ) og sammenlignes for flere pasienter. Her kvantifiserte vi 3 - 5 områder innenfor hver region av interesse, avhengig av det totale arealet av interesseområdet, og sammenlignet grupper ved hjelp av sammenkoblede tester med GraphPad Prism-programvare. Vi sammenlignet også våre GBM-analyser med tilsvarende farging funnet i sunt hjernevev i Protein Atlas-databasen ( Figur 3F ). I vår Forrige publikasjon brukte vi denne analysen for flere mikroenvrionmentale komponenter (astrocytter, mikroglia, oligodendrocytter og blodkar) over 33 pasienter for å utvikle en proporsjonal risikofaktor for å forutsi total overlevelse av pasienten 11 .
Figur 1 : Sammenligning av tumorbulk og tumor tilstøtende områder av interesse for glialceller.
A) Hele svulstprøve fra pasient 63 farget med hematoksylin og eosin med masse og tilstøtende områder indikert. B) Hematoksylin og eosinfarging, C) ALDH1L1 + astrocytter, D) Iba1 + microglia og E) Oligodendrocyt-spesifikt Protein-1 (OSP1) + oligodendrocytter. Skalbjelke = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Eksempel Titrering av Anti-ALDH1L1 Antistoff.
A) Negativ kontroll, B) 1:70 produsent anbefaling fortynning fra lager, C) 1: 200 fortynning fra lager, og D) 1: 400 fortynning fra lager. 1: 200 fortynning ble brukt til farging og analyse på grunn av optimal positiv farging av cellekropp og prosesser med minimalisering av bakgrunn. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Jpg "/>
Figur 3 : ImageJ-analyse og kvantifisering av arealdekning for oligodendrocytter.
A) Original OSP1 + farging av pasient 52. B) Fjerning av lilla kjerner ved hjelp av Treshold_Colour-plugin. C) Konvertering til 8bit. D) MaxEntropy terskelfangst og E) påført for å minimere bakgrunnsfarget. F) Sammenligning av tilstøtende og bulkregioner i fem pasientprøver, samt sunt hjernevev gjennom Protein Atlas, for OSP1 + prosent dekning. *** p <0,001, **** p <0,0001 via parede t-tester. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metode foreslått her er en kvantitativ tilnærming til analyse av histologiske prøver farget ved bruk av tradisjonell kromogen immunhistokjemi. Nåværende metode for denne typen analyse inkluderer lignende fargerprotokoller etterfulgt av gradering av uavhengige patologer. Denne metoden har vært pålitelig, men for en rekke applikasjoner er det nødvendig med en mer presis forståelse av cellulær sminke, for eksempel bedre forståelse av heterogeniteten forbundet med svulster og nøyaktig rekapitulering av svulster for in vitro-studier.
Denne protokollen demonstrerer en enkel teknikk for kvantitativt å analysere populasjonene av glialceller i hjerne-svulm-mikromiljøet. Denne teknikken er allment tilpasningsdyktig og kan utvides for å identifisere mange andre komponenter i mikromiljøet, for eksempel blodkar, kjemokiner og mer, samt andre kreftformer, som for eksempel bryst eller bukspyttkjertel, hvor svulstreseksjonene kan haStørre parenkymregioner. Videre kan denne teknikken tilpasses til å skaffe andre målinger, som teller og perimeter av celler for å vurdere celleform, samt mer komplekse morfologiske resultater, isotropi, clustering, orientering og mer. Disse teknikkene er ikke bare begrenset til kreft, fordi disse fargings- og kvantifiseringsmetodologiene kan brukes til noen hjerneanalyser, som vist i vår representative Protein Atlas-kvantifisering av sunt vev, og vår tidligere publiserte sammenligning med epileptisk hjernevev 11 .
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer riktig inkubasjon og utvikling av det kromogene sekundære. Pass på at det kromogene fargestoffet ikke over-utvikles. Dette vil gjøre det vanskelig å skille mellom positiv farging og bakgrunn. Utviklingstiden varierer avhengig av substratreagenset som brukes og affiniteten til det primære antistoffet. Vi bruker lyse feltMikroskopi for å overvåke utvikling for å sikre optimal farging samtidig som bakgrunnsfargen minimeres. Etter farging kan riktig terskel under analysen skille bakgrunnen fra positiv farging. En stor begrensning for denne metoden er manglende evne til å plette flere komponenter i samme vevsprøve på grunn av bruken av kromogen fargestoffutvikling. Immunofluorescensanalyse kan utføres på en lignende måte, men krever modifikasjon av verktøyene som er diskutert i denne metoden.
Spesifikt for glioblastom er det en rekke markører og cellulære flekker som har blitt brukt til å analysere pasientprøver. Disse inkluderer IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 som prognostiske markører, så vel som CD11b og CD45 for microglia og makrofager 18 , 19 . Vår metode utvider denne typen analyseTil den cellulære mikromiljøet, en ofte oversett komponent av tumormikromiljøet i glioblastom. Studier har sett på mikroglia nærvær og tetthet i svulster 20 , 21 , 22 samt bidrag fra astrocyter 9 , 23 , 24 . Her utviklet vi en protokoll som undersøker alle glia-astrocytter, microglia og oligodendrocytter - i hjernens svulmemiljø og å skille mellom tilstøtende eller invasive områder av svulsten fra tumorvolumet, som er hvor markører vanligvis blir identifisert i disse svulstene. Ved å gjøre dette tror vi at vi bedre kan vurdere pasientens situasjon fordi vi fastslår intra-patient heterogenitet, og vår tidligere publikasjon viste at analyse av disse stedene og inkludering i statistiske modeller er sterkere for å forutsi utfall enn hvor som helst aloNe eller samlede prøver 11 . Siden glioblastom invasjonen er så diffus, noe som gjør det vanskelig å resektere fullstendig 1 , 2 , tror vi at vevet i de tilstøtende områdene er mer representativt for det invasive vevet igjen etter reseksjon, noe som bidrar til uunngåelig gjentakelse. Derfor kan bedre forståelse av de tilstøtende områdene gi mer informasjon om sykdomsrekkefølge og pasientbehandlingsplanlegging, i motsetning til det tradisjonelt studerte bulkvevet som resekteres før behandling hos glioblastompatienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Drs. Fahad Bafakih og Jim Mandell for oppkjøp og identifikasjon av pasientprøver, Garrett F. Beeghly for hjelp med immunhistokjemi, og Biorepository and Tissue Research Facility, Histology Core for kardiovaskulær forskningssenter og Biomolekylære Analysefasilitet ved University of Virginia for hjelp med Prøveoppkjøp, immunhistokjemi og bildebehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
