Summary
C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.
Abstract
칼슘 지표의 사용은 크게 신경 역학 및 규칙의 우리의 이해를 강화 했다. 완전히 매핑된 신 경계와 투명 한 해부학, 선 충 류 꼬마 선 충, 칼슘 표시기를 사용 하 여 실시간 신경 역학을 이해 하기 위한 이상적인 모델을 제공 합니다. 미세 기술 및 실험 설계와 함께, 자유로운 이동 및 덫을 놓은 동물 칼슘 이미징 연구가이 표시기를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나, Chronis 그 외 여러분에서 설명한 후 각 칩 등의 트랩 장치를 이용 하 여 대부분 이전 연구는 보다 적게 일반적인 남성은 둘 다 형태학 상으로 그리고 구조적으로 더 일반적인 자웅 동체에 사용 하기 위해 설계 된 장치 비슷하지. 적응된 후 각 칩 설계와 젊은 성인 동물을 사용 하 여 남성 신경 이미징에서 증가 효율성에 대 한 조작. 차례는 웜 포트 동물 회전 하 고 2D 영상에서 양측 쌍 개별 뉴런의 분리에 대 한 로드로 통합 되었다. 벌레는 자웅 동체 연구 이전에 설명 된 대로 odorant 미세 소자 내에서 제어 흐름에 노출 됩니다. 칼슘 과도 다음 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 여기에 설명 된 절차는 남성 기반 C. 선 충 의 증가 금액에 대 한 허용 해야 칼슘 이미징 연구, 섹스 관련 신경 신호 전달의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 심화.
Introduction
미세 장치 증가에 액세스할 정확 하 게 제어 환경의 점에서 동물, C. 선 충, 선 충 류 실험적 조작된1수와 같은. 이러한 연구는 행동 분석, 칼슘 이미징 연구, 또는 특정 고기, 실험 결과1,2,3,4,의 더 정확한 측정 결과 대 한도 검 진 5,6. 마이크로 소규모 액체 상태는 상세한 실험 시 약의 최소한의 금액을 이용 하는 동안 실행 될 수 있습니다 제공 합니다. 거기는 새로운 미세 장치 디자인의 지속적인 생산 다르며 각각의 사용, 자연 정현파 모션 C. 선 충 의 행동 분석 및 신경 영상 연구, 신경 이미징에 사용 되는 장치를 함정을 허용 하는 경기장에서 그리고 후 각 연구, 유전자에서 높은 처리량 phenotypic 분석 화면4,5,,67대 한 허용 하는 장치. 마스터 몰드의 제작, 다음 미세 장치는 건설 비용이-마스터의 재사용성을 제공-사용 하기 쉬운, 높은 처리량 연구를 통해 빠른 데이터 생성에 대 한 허용. 등입니다 (PDMS) 폴리머를 사용 하 여 장치의 제조 시간 이내 신제품의 창조에 대 한 수 있습니다.
칼슘 이미징 연구 대상 세포에 표현 된 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 실시간으로8,9,,1011에 그 세포의 신경 역학 측정. C. 선 충 의 투명 한 자연 동물에이 단백질의 형광 레벨의 기록에 대 한 수 있습니다. GECIs 녹색 형광 단백질 (GFP)을 의존 하는 전통적으로,-하지만 더 최근의 연구 더 나은 신호 대 잡음 비율 및 레드 이동 여기 프로필 있도록 이러한 센서 적응 센서 GFP Calmodulin M13 펩 티 드 (GCaMP)를 기반으로. GCaMP3의 개발에 따라 단백질이 규격 다양, GCaMP6s 및 GCaMP6f 같은 센서를 포함 하 여 (느린 빠르고 형광 오프 비율, 각각), RFP Calmodulin M13 펩 티 드 (RCaMP), 뿐만 아니라 빨간색 이동 있다 활성화 프로필입니다. C. 선 충 세포 관련 유전자 발기인 시퀀스와 이러한 GECIs 조합의 관심사, 특히 감각 신경12,13,,1415 의 세포를 타겟팅 할 수 있습니다. , 16.
미세 연구에 선 충 C. 사용의 용이성 명백한 동안, 거의 모든 연구는 광고에 나온 것에 집중 했다. 남성만 0.01-0.02에 대 한 회계에 불구 하 고 야생 형식 인구의 %, 귀중 한 발견 그들의 특성에서 발생할 수 있습니다. 자웅 동체 신경 시스템의 물리적 텀 수십 년17완벽 하 게 매핑 되었습니다, 반면 남성 텀 동물18의 머리 지역에서 특히 불완전, 남아 있습니다. 칼슘 이미징 남성에서의 사용은 남성 신 경계와 두 남녀 사이 발생 하는 차이 대 한 이해를 생성 하는 데 도움이 됩니다. 선 충 C. 성인 남성의 더 작은 크기는 큰 광고에 나온 것을 위한 전통적인 후 각 장치의 로드 포트에 효과적이 고 신뢰할 수 있는 트래핑 방지할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 Chronis 후 각 칩19 의 수정된 된 버전 좁은 로드 포트, 낮은 채널 높이, 개발 되었다 고 웜 로드 포트 (이 동물 회전), 양자 왼쪽/오른쪽의 시각화에 대 한 허용에 신경 쌍입니다. 이 디자인 허용: 젊은 성인 남성 (1) 효과적인 트랩핑, 양자 쌍된 뉴런의 두 멤버와 남성 뉴런에서 신경 활동의 정확한 영상 (3)의 시각화에 대 한 동물의 보다 안정적인 방향 (2).
점점, 연구 선 충 C. 남성 ascarosides (ascr), 또는 선 충 류 페로몬20,,2122,23의 다양 한 광고에 나온 것 보다 다르게 응답 표시 ,24. 따라서, 신경 역학과 남성 텀 내 표현에 대 한 이해를 개발 훨씬 더 관련 되고있다. 남성 선 충 C. 포함 자웅 동체25,26에 없음 87 섹스 관련 신경으로에 텀을 변경-아직 불확 실한 방법. 이러한 독특한 신경 역학 이미지를 수 있는 더 나은 섹스 관련 응답 및 신경 표현 이해 하 고 우리 수 있습니다.
이 프로토콜은 남성 C. 선 충 의 신경 영상에 대 한 남성 적응 후 각 칩의 사용을 설명 합니다 chemosensation. 재 1 M 글리세롤 남성, 이전 일치에 자웅 동체에 안정적으로 응답 nociceptive 신경 연구27. Ascarosides에 노출은 변수 동물 동물에서 시험 될 동물의 많은 수를 요구 하는 응답을 유도 수 있습니다. 남성 전용 CEM 뉴런의 응답 이전 표시 되었습니다, 전기 생리학 및 칼슘 이미징 연구를 통해 변함없이 ascaroside #323응답.
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Protocol
1. 장치 제조
참고: 참조 참조 1.
참고: 실리콘 마스터 금형 실리콘 마스터 1 , 7 수 8 포토 레지스트 패터 닝에 대 한 표준 photolithographic 기법을 사용 하 여 날조 했다. 웨이퍼 패턴에 대 한 포토 25000 dpi에서 인쇄 되었다. 남성 적응 장치 기능 Chronis 후 각 칩 디자인 변화는 웜 포트 로드, M. 짐머 (개인 통신, 2016)에서 얻은 디자인을 적응에 19. 차례 동물의 회전을 제어 하는 포함 되어 있습니다. 포트 채널을 로드 하는 벌레의 폭은 50 μ m로 좁혀 졌다. 모든 채널은 32 μ m 높이 이다. 실리콘 마스터 몰드는 사용자에 게 제공 되 면 사용자는 후속 따를 수 프로토콜, 앞에서 설명한 1.
- 무게에 의해 10:1 비율로 믹스 PDMS 기본 및 경화 에이전트.
- 전송 펫으로 철저 하 게 혼합.
- 모든 보이는 거품 제거 될 때까지 1 시간에 대 한 진공 desiccator에 섞어 드.
- 두께 5 mm (100 g) 때까지 150 m m 직경 접시에 실리콘 몰드 마스터에 혼합물을 부 어. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 모든 거품 또는 혼합물에 도입 된 먼지 제거.
- 적어도 3 h, 또는 하룻밤 65 ° C에서 구워.
- 메스를 사용 하 여 금형에서 PDMS를 잘라내어 별도 장치를 떨어져 면도날을 사용 하 여 잘라.
- 1mm 피부 펀치와 인 레트와 출구 구멍을 펀치.
- 플러시 dH 구멍 2 O, 에탄올, 그리고 다시 dH 2 O는 펀치에서 입자를 제거 하. 에 어 스트림 펄스에서 장치 건조.
- 채널 측 및 어떤 먼지 또는 성공적인 접합 수 있도록 장치에 남아 있는 파편 제거 접착 테이프로 장치의 위쪽 청소.
- 플라즈마-본드 장치, 제 1 덮개 유리, 채널 사이드.
- 노출 커버 유리 및 장치 (채널-쪽) 공기 플라즈마 100 W 30 같은 적절 한 결합을 허용 하는 조건을 사용 하 여 s 또는 24 W 60에 대 한 s.
참고: 설정은 결합 효율을 향상 시키기 위해 조정할 수 있습니다. 플라즈마-결합 조건이 결합 효율을 개선 하려고 할 때 적절 한 청소 만큼 중요있지 않습니다. 이상적인 플라즈마 조건 에서도 충분 청소 장치 채권 하지 것입니다. - 5 손가락으로 아래로 장치 및 보도 채널 쪽으로 커버 유리를 반전 미
- 노출 커버 유리 및 장치 (채널-쪽) 공기 플라즈마 100 W 30 같은 적절 한 결합을 허용 하는 조건을 사용 하 여 s 또는 24 W 60에 대 한 s.
2. 준비를 버퍼
- Dilute 1 살 균 10 배 재고에서 S 기초 (100 m m NaCl 및 0.05 M KPO 4, pH 6.0) x.
- 모든 버퍼 솔루션에 대 한 1 M 1 m m S 기초 x 1에서의 최종 농도 tetramisole 재고 희석.
- Fluorescein 둘 다 추가 " 흐름 제어 "와 " 버퍼 " 저수지.
- S 기초 x 1에 100 mg/mL 재고 fluorescein 만들기.
- 흐름 제어에 1 µ g/mL 및 버퍼에서 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 재고 희석.
- 자극을 만듭니다.
- 1 M S 기초 X 1에서의 최종 농도에 희석 글리세롤.
- S 기초 X 1으로 1 µ M의 최종 농도를 희석 ascaroside #3 (ascr #3).
3. 장치 설치
참고: 1 참조.
그림 1. 미세 장치 설치. (A) 저수지 및 튜브 30 mL 주사기 플런저 역할 수 없이 " 저수지. "이 세 가지 흐름 옵션 Luer 밸브에 연결. 다른 미세 장치에 연결 하는 튜브에 삽입 된 바늘 (오렌지)에 연결 하는 동안 1 개의 출구 3 mL 주사기 플런저와 연결 된다. (B) 전체 이미징 실험 미세의 설정. 소자 대물 렌즈 위에 거꾸로 epifluorescence 현미경의 단계에 배치 됩니다. " 흐름 제어 " 버퍼 설정 위의 선반에 장치에 의해 제어 되는 3 방향 밸브를 통해 여행. 라인 버퍼를 포함 하는 다음 적절 한 장치 포트에 삽입 됩니다. (C) 미세 소자의 포트. " 흐름 제어 " 포트 측면 다른 입구 포트:는 " 자극 " 및 " 버퍼 " 포트. " 콘센트 "는 가장 오른쪽 포트. 웜 로드 경기장의 위치는 " 웜 로드 " 포트는 장치에서 중앙 대부분 포트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 준비 3 3 mL 주사기 및 바늘 ( 그림 1A)에서 뿐만 아니라 루어 밸브에 연결 된 3 방향 Luer 밸브, 30 또는 60 mL 주사기를 연결 하 여 유체 저수지. 미세 장치 확장 튜브에 바늘을 연결 ( 그림 1A에서 -B).
- 저수지와 배관에서 공기 방울을 제거.
- S 기초 x 1과 연결 된 튜빙 3 mL 주사기를 콘센트에 삽입 포트
- 버퍼 입구 구멍의 상단에 표시 될 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.
- 적절 한 입구 구멍에 흐름 제어, 버퍼 및 자극 튜브를 연결 ( 그림 1B에서 -C), 액체 방울 로드 포트에 있는 지를 확인 구멍과 첨부 버퍼 튜브.
- 방울 벌레 로드 포트 입구에에서 나타날 때까지 출구 포트에 연결 된 주사기를 다시 부드럽게 압력을 적용.
- 포트 로드 벌레에 단단한 차단 핀을 삽입
- 출구 포트에서 주사기를 제거 하 고 집 진공 (-670 Torr)에 연결 하는 콘센트 라인 연결.
- 검사 흐름에 어떤 거품에 대 한 장치 채널, 시각 및 카메라와 호환 하는 소프트웨어를 통해 비디오 확인을 통해 사용, 오픈-소스 소프트웨어 마이크로 유 등. 마이크로-Manager를 사용 하 여에 대 한 도움말 6 단계를 참조 하십시오.
- 어떤 거품이 있으면 기다리는 그들을 꺼내 려 하는 PDMS에 흡수 될 어떤 동물을 로드 하기 전에 벽, 거품의 존재는 장치를 통해 체액의 적절 한 흐름을 방해 합니다.
- 장치 내에서 적절 한 흐름 역학 확인 GFP 필터를 사용 하 여 웜 3-방향 밸브를 움직이는 버퍼의 관찰을 로드 하기 전에.
- 결정 적절 한 흐름 역학: 흐름 제어 및 버퍼 솔루션에 fluorescein 관찰 ( 그림 2D -2E) 컨트롤을 눌러 흐름 제어 값이 변경 될 때 변경 3-방향 밸브 밸브 링크 ( 그림 1B)에 해당 하는 버튼.
- 마이크로 관리자를 연 후에 클릭 " 라이브 " 소자의 라이브 이미지를 관찰 하는 것. 장치에서 버퍼의 흐름을 관찰 하는 형광 광원 설정 ( 그림 2D -2E).
그림 2: 한 남자 적응 미세 후 각 칩 했다. 장치는 벌레는 노출 될 경우의 (A) 흐름 패턴 버퍼를. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. 포트 로드 웜 웜 오리엔테이션의 더 나은 제어 곡선을 포함 적응 되었습니다. (B) 흐름 벌레 자극에 노출 되 면 소자의 패턴. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. (C) 조작으로 적응된 장치의 측량. 포트 로드 웜 남성 폭을 위한 50 µ m 채널 여 42 µ m에 끝납니다. 채널의 측정된 높이 디자인 25 µ m의 목표에도 불구 하 고 32 µ m입니다. (D-E) A 갇혀 남성 표현 p sra-6:: GCaMP3. Sra 6 발기인 재 관련, 그리고 비록 아무 칼슘 과도 ASI에 관찰 했다 일부 식 ASI 신경에서 관찰 될 수 있습니다. 반면 (E) 형광 이미지 (D) 밝은 분야 및 형광 조명의 조합입니다. 스케일 바는 강력한 신경 활동 42 µ m. (F)는 재 신경 응답을 1 M 글리세롤 자극을 나타냅니다. 파란색 영역 1 M 글리세롤 자극의 시간을 나타냅니다. 음영 처리 된 영역 나타냅니다 표준 오차, n = 7 벌레에서 20 펄스. 붉은 흔적이 depolarizing 응답을 나타냅니다. y 축의 δ/F 0을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. 동물 준비
참고: 참조 참조 23.
- 이미징 재 응답 1 M 글리세롤. P sra-6에 대 한 긍정적인
- 장소 약 20 C. 선 충
- 남성:: 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 접시에 GCaMP3 배열 식 OP50 대장균의 잔디와 시드. 형광 GECI의 표현 및 공동 주입 마커를 사용 하 여 배열-긍정적인 동물의 식별에 대 한.
- 따기 직전 분석 결과, 젊은 성인 남성을 선택 하는 경우
- . 만약 전날 분석 결과, L4 애벌레 남성 선택.
참고: 배열 긍정적인 동물 사용 GECI에 따르면 형광 것입니다 (즉, 동물을 표현 하는 GCaMP 것입니다 형광 블루 빛 자극, 아래 녹색 RCaMP 동물 그린 빛 자극 아래에 빨간색 형광 것입니다 하는 동안). 공동 주입 마커 phenotypic 마커, rol-6, 같은 다른 형광 단백질, GFP와 RFP, 등에서 배열할 수 있다 또는 pha-1 돌연변이 28 같은 지배적인 표현 형을 구출 하실 수 있습니다. - 따기 직전 분석 결과, 젊은 성인 남성을 선택 하는 경우
- 선택 약 20 L4 C. 선 충 수 컷 (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1 (e2123ts); 그-5 (e1490); 라이트-1 (ce314)) 그는 dsRed 공동 주입 식 표식에 대 한 긍정적.
참고: 남자 이야기의 광선 신경 내 dsRed 식을 관찰 하 고 4 개의 CEM 뉴런 내에서 GCaMP 식 보다 확인 쉽습니다. - 이미징 실험을 수행 하기 전에 5-14 h OP50 대장균의 잔디와 시드 NGM agar 접시에 광고에 나온 것에서이 남성 분리.
참고: 남성 5 h의 최소 절연 하지 행동 ascr # 3에 응답 하지 않는 및 따라서 여기 관찰 보다는 ascaroside에도 적은 칼슘 과도 전시 수 있습니다.
5. 동물 로드
참고: refefence 1.
- 표준 웜 유지 관리 기술을 사용 하 여 한 unseeded NGM 천 배지 위에 한 웜 선택.
- 선택
- 벌레는 (병합 된 백 금 철사로 만든), 선택, 선택에 박테리아를 따기 불타는 여 고 " dabbing " 그것을 데리 러 벌레. 부드럽게 장소 자체에서 크롤링할 수 있도록 하는 새로운 접시에 웜.
- 웜 튜브로 서만, 아니라 모든 방법으로 주사기를 빨 아 해야.
참고: 경우 벌레 주사기에 여행, 그것은 가까이 튜브에 그것을 다시 얻을 불가능.
참고: 사용 하 여 라이브 비디오 피드는 벌레를 로드 하는 동안 위치와 동물 (단계 5.8-5.13)의 방향을 확인.
6. 자극 및 수집
- 마이크로 매니저 등 10 프레임/s 블루 빛 여기를 사용 하 여 TIFF 스택으로 이미지를 캡처하여 기록 소프트웨어를 오픈-소스 현미경을 사용 하 여, (470 nm) 30 미
- 오픈 100 양 메인 메뉴에서 노출 설정 " 멀티 D Acq. " 소프트웨어의 메인 메뉴에서. 설정는 " 번호 "를 " 300, " 및 " 간격 "을 " 0. " 클릭 " 취득! " 비디오를 얻으려고.
- 적용 수집을 시작한 후 자극 5 s의 10 s 펄스. 원하는 대로 응용 프로그램 자극의 기간 조정.
- 5 인수 후 s 비디오의 변경 제어 흐름 제어 버퍼 테스트 중인 동물을 자극을 적용 하는 3 방향 밸브. 밸브 연결 ( 그림 1B)에 가장 왼쪽 단추를 클릭 하십시오.
- 자극 노출 후 10 s (이 시간을 조정할 수 있습니다 사용자가 원하는대로), 다시 밸브 링크 맨 왼쪽 버튼을 누르면 버퍼의 흐름을 변경.
- 버퍼 30의 창 GECI 형광 기준선으로 돌아갑니다 있도록 완료 될 때까지 아래 기록.
- 원하는 대로 반복합니다. 수집의 끝과 다음 재판의 개시 사이 대기 30 s.
7. 분석 이미지
- ImageJ 창에 파일을 드래그 하 여 TIFF 스택 ImageJ, 오픈 소스 소프트웨어와 함께 엽니다.
- 커서를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 관심 (ROI)의 신경 주변 영역을 설정. ( 그림 3A)와 같이 관심의 신경의 soma를 포함 하도록 영역 설정.
- 열기 클릭 하 여 투자 수익의 형광 강도의 z 스택 스택 전체 플롯-> 이미지-> 스택-> z 축 프로필 플롯.
- 클릭 " 목록 " 열리는 창에서. 편집-> 값을 복사 하려면 복사. 값을 붙여 스프레드시트 프로그램으로.
- 웜 GCaMP 식을 포함 하지 않는 영역에 투자 수익을 드래그 하 여 각 펄스에 대 한 배경 형광 분석.
- 신경 형광 강도 값에서 배경 형광 값을 빼서 각 펄스에 대 한 배경 빼기 수행.
- 계산 각 펄스의 각 프레임에 대 한 δ/F 0.
- 첫 번째 1 대 한 투자 수익의 평균 휘도 값으로 계산 F 0 수집 (예: 프레임 1-10)의 s.
- 계산된 F 0 값으로 관심의 프레임에 대 한 배경 뺀 값을 분할 하 여 δ/F 0를 계산.
- 군데 모든 신경 및 모든 자극 펄스 반복.
- 일관 된 응답 프로필, 화산재, 등 신경 각 뉴런에 대 한 모든 펄스를 평균 하 고 ( 그림 2F)에서 SEM을 계산.
- 각 뉴런에 대 한 시간이 지남에 SEM와 평균 δ/F 0 플롯.
참고:이 경우에, 그것은 뿐만 아니라 각 재판의 개별 신경 응답의 heatmaps를 포함 하 일반적인 관행입니다. 그것은 개별 펄스 트레이스 (로 표시에 더 적용 수 반복된 stimulations 걸쳐 자극에 노출 되 면 칼슘 과도 일관 된 변화를 전시 하지 않는 신경 또는 다른 개인 23 그림 4)입니다. 결정 하는 데이터를 표시 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
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Representative Results
그림 1A-B에서 전체 장치 설치의 예를 볼 수 있습니다. 그림 1A 는 적절 한 저수지 건설 및 설치를 보여 줍니다. 그림 1B 미세 장치에 저수지의 연결을 보여 줍니다. 그림 1C 는 개별 포트 선명도 대 한 분류와 미세 장치를 묘사 한다.
남성 적응 미세 장치 디자인 로드 포트에 곡선을 포함 되어 있지만 흐름 역학은 Chronis에 의해 설계 된 장치에 동일 외.19(-2 C그림 2A). 어떤 흐름 제어 밸브는 열려 변경 하 여 버퍼의 흐름을 제어할 수 있습니다 (그림 2A-2B). 조작으로 장치의 측정 설계 파일에서 다릅니다. 그림 2C 에서 제공 하는 측정은 "로 조작된" 측정 합니다.
남성 적응 후 각 장치, 그들의 배치 및 방향으로 채널 흐름 역학에 남성 C. 선 충 을 로드 한 후 밝은 필드와 형광 이미징 통해 확인할 수 있습니다 (그림 2D-2E). 1 M 글리세롤을 nociceptive 신경 재에 GCaMP3을 표현 하는 벌레의 노출 형광 재 신경, 신경 활동 (그림 2F)을 나타내는 내 보이는 변화에서 결과. 형광의 미묘한 변화, 눈으로 보이지 않을 수 있습니다 하지만 소프트웨어는 이러한 변화 척도를 사용할 수 있습니다. 분석 하 고 (그림 2F) 동안 1 M 글리세롤에 노출 시 재 신경의 형광 강도 계량 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 이것은 광고에 나온 것27 로 하 고, 글리세롤에 재 신경 응답의 견고성 때문 관찰 무엇, 이것은 테스트 하는 모든 동물에서 관찰 됩니다.
작은 양의 축 또는 회전 운동 자주 비디오 분석 (그림 3A) 중 신경 추적 알고리즘을 필요로 하는 unparalyzed 동물에 전망 이다. 버퍼 (예를 들어, 1 m m tetramisole)에 마비의 추가 거의 비록 일부 동물 (~ 10%)는 여전히 재판 중 이동이 효과 제거 합니다. 이것에 의해 피할 수 있습니다: (a) 더 오래 된 남성, 더 효율적으로 갇혀 있다;를 사용 하 여 (b) 감소 폭 또는 선적 항구 더욱; 벌레의 두께 또는 (c) 중 사용 하는 마비 또는 다른 마비를 사용 하 여 농도 증가. 이렇게 하면 하지 않습니다 너무 많은 함정의 끝 머리 냄새로 노출의. 발생 하는 웜 운동 재판 분석의 영역을 이동 하 고 후 운동 발생 (그림 3B) 프레임에서 시작 하는 새로운 신경 위치에서 다시 수 있습니다. 사용자가 신경 추적의 수동 재건축이에서 필요 합니다. 스크립트는 신경 내 형광 변화를 분석 하 고 또한19를 작성할 수 있습니다 이동할 때 신경의 센터에 따라.
남성 C. 선 충 4 섹스 전용 CEM 신경23통해 ascarosides 라는 매력적인 생물 기원 페로몬을 감지 한다. 칼슘 과도 남성에서 관찰 된다, 반응 변수 모양, 부호, 및 신경 및 동물 (그림 4A-B) 사이의 크기에 있습니다. 그러나, 남성 응답 페로몬을은으로 안정적으로 많은 동물 (그림 4C)에서 칼슘 과도로 관찰 하지. 이 아니다 깎아, 대부분 ascarosides 센 세이 션13,,1415시 칼슘 과도 유도 하지 않습니다.
그림 3: 이미지 수집 기간 동안 주소 웜 운동. (A) δ/F0 (첫 번째 1에 대 한 평균 배경 형광 강도 나눈 형광 강도 변경 취득의 s) ImageJ의 신경은 안정적으로 1에 대 한 정적 영역을 정의 하 여 사용 하 여 계산 된 s. 자극 펄스 (파란색 영역), 동안 동물 이동, 칼슘 추적 위의 이미지에서 보듯이 결과 신경 이상 (노란색 상자) 분석된 영역 내에 포함 된 되 고. 스케일 바 나타냅니다 42 µ m. 점선 표시 각 이미지에 벌레의 위치에 해당 하는 추적의 지역 (B) 분석의 영역 재판 동안 신경에 따라 이동 하 고 개별 추적 실제 신경 역학을 전달 하기 위해 다시 작성 하는 경우, 추적 처럼 동물을 이동 하지 않았다 나타납니다. 점선된 라인 웜 운동에 대 한 수정 된 추적의 영역을 보여줍니다. 모두 재 신경, 왼쪽과 오른쪽에 대 한 추적 (ASHL (레드)와 ASHR (블루), 각각) 표시 됩니다. y 축의 δ/F0을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 남성 선 충 C. CEM 1 μ M ascr #3 응답 변수입니다. 남성 전용 CEM 신경 생물 기원 페로몬에 대 한 응답의 독특한 패턴을 표시합니다. (A) 한 응답 동물에서 1 펄스에 대 한 각 CEM 뉴런에 관찰 응답 표시 됩니다. 있다 4 개의 CEM 뉴런: 등 쪽 오른쪽 (CEM 박사), 등 (CEM DL), 복 부 오른쪽 (CEM VR), 및 복 부 왼쪽 (CEM VL). 3 4 개의 뉴런의 다양 한 모양 및 크기의 depolarizations 있는 4에 응답 하지 않는 ascaroside와 함께 응답 합니다. 3 신경 몇 군데 수 수에 (B) 약 1 / 3 (2/7이이 연구에서 테스트) 덫을 놓은 동물의 결과. 이 방향에 있는 벌레의 응답 첫번째 벌레에서 관찰 된 것 보다 다른 CEM 칼슘 과도 귀착되는. 이것으로 CEM 박사 두 방향에서 볼 수 있으며 동물 사이의 가변 응답을 전시, 벌레의 방향에서 변경 되지 않았습니다. (C) 많은 벌레 안 (5/7이이 연구에서 테스트) 어떤 감지 칼슘 과도와 응답. 개별 추적 표시는 음모 위에 이미지에 표시 된 단일 동물의 대표입니다. 는스케일 바 42 µ m. 추적 표시: 파란색 영역 1 μ M ascr #3 노출 시간을 나타냅니다. 붉은 흔적이 depolarizing 응답을 나타냅니다. 검은 추적 관찰 된 응답을 나타냅니다. y 축의 δ/F0을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
남성 적응 후 각 칩 좁은 로드 포트 방향 제어 및 남성 C. 선 충의 효율적인 트래핑 수 있는 회전을 채택 하고있다. Z-스태킹에 대 한 필요 없이 신경 양자 쌍의 왼쪽 및 오른쪽 회원의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 곡선 벌레에 시간의 수직 100% 떨어져 방향을 하나의 양자 쌍 재 (그림 2D-E)29,30같은 형광 표시와 함께 대상으로 리드. 그러나, CEM, 같은 4 개의 광선으로 대칭 신경 세포와 신경 클래스에서 모든 4 개의 신경 세포는 볼 수 단지 1 / 3의 시간. 또 다른 3 분 테스트 벌레의 표시, 4 개의 뉴런의 고 나머지 3만 3만 구별할 수 차이 등 쪽과 복 부 셀 시체, 좌우 비대칭 (데이터 표시 되지 않음) 하지 사이. 좁은 포트는 z 축에 걸쳐 웜 동요를 방지 하기 위해 낮은 채널 높이와 결합 된다. 미래에 남성의 이미징에 대 한 수 있습니다이 디자인 연구, 남성 텀25,31의 끊임없이 증가 지식와 결합 하면, 섹스 관련 신경 기능을 더 잘 이해 허용 됩니다.
이 프로토콜에서 수행 하는 분석 ImageJ 자유 소프트웨어를 사용 하 여 형광의 신경에 있는 변화를 측정. 현재 디자인 버퍼에 1 m m tetramisole 효과적으로 벌레를 마비 하 고 몇 군데 되 고 신경의 움직임을 방지 합니다. 움직임은 예방 가능 하다, 또는 사용자는 마비의 사용을 방지 하고자 하는 경우 더 복잡 한 추적 스크립트7이동 하는 신경 세포를 추적 기록 합니다. 그러나,이 프로토콜에 남성 웜 이동할 때 그들은 너무 작아서 로드 포트와 글리세롤 등 매우 혐오 자극으로 선물 될 때 효과적으로 제한 했다. 이러한 경우에도 운동 간단한 이며 추적 조정의 큰 금액을 필요 하지 않습니다-잘못 된 형광 판독 (그림 2) 완화 새로운 신경 위치 주변 ROI를 설정.
단일-벌레의 한계, 트랩 기반 이미징 그 하나만 벌레1시간 몇 군데 수 이다. 이 트랩의 또 다른 한계는 벌레는 장치 내에서 갇혀 얻을 수 있습니다만 몇 가지 웜 이미징 후 막힌 될 수 장치 및 "최대 사용"을 일으키는. 그러나, 마스터 금형에서 새로운 디바이스의 제조에 대 한 빠른 처리 시간이이 단점을 완화 한다. 확장 된 블루 빛 조명 또한 선 충 C.32,33photodamage 유도 표시 되었습니다. 이 프로토콜의 상대적으로 짧은 실험 기간 (30 s) 측정 photobleaching 없이 영상에 대 한 수 있습니다. 그러나, photobleaching 및 더 긴 실험에서 photodamage 피하려고 광원 펄스7수 있습니다. 예를 들어 각 100 ms 노출 동안 빛 10 양이 시간7이상 증가 몸 autofluorescence를 제거 하기 위해 표시 되었습니다에 대 한 펄스 될 수 있습니다.
Ascarosides에 대 한 답변에 대 한 남성을 제대로 테스트 하려면 애벌레 단계 4 (L4) 남성 해야 합니다 먼저 고립 될 광고에 나온 것, 적어도 5 h에서 페로몬23근처 순진한 응답을 달성 하기 위하여. 이 기간 보다 더 적은 위한 절연 동물에 ascarosides에 응답 하지 발생할 수 있습니다. 그러나, 글리세롤 등 비 ascaroside 신호를 테스트 하는 경우에이 격리 필요 하지 않습니다. 그러나 일관성을 위해, 동물 했다 항상 칼슘 이미징 고립 된 적어도 5 h 전에. CEM, 같은 일부 뉴런에서 모든 자극 신경 응답을 이끌어내는 것입니다 하 고 응답은 각 CEM는 특정 "코드" 신경 표현 생성 저러. 이미징 연구 같은 것 들23여기에서 설명 하는 칼슘 뿐만 아니라 전기 생리학 연구를 통해 CEM에이 현상이 관찰 되었습니다. 따라서, 모든 ascaroside에 노출 된 동물에 있는 CEM 뉴런에서 측정 가능한 칼슘 과도23보장 하지. 사실, 날짜를 조사 하는 ascarosides의 많은 측정 칼슘 과도13,15,,3435를 유도 하지 않습니다. 측정 가능한 과도의 성공적인 채집만 한 두 관심 (그림 3)의 ascaroside에 노출 5 동물 페로몬의 3 개의 펄스 동안 관찰 되었다. 이 이전 다른 실험실23에서 관찰 하는 성공의 속도 일치 합니다. 이 변화는 제한 페로몬 응답 공부를 할 때 이며이 프로토콜의 남성 기반 초점 때문만 아니다.
Ascarosides에 대 한 응답에서 elicited 칼슘 과도 조사할 때 하나 하지 추가 조사 없이 일관 된 응답의 부족을 기 각 한다. 이 같은 전기 생리학 연구를 신경 클래스 내 변수 응답 확인 실험을 통해 테스트할 수 있습니다. 신경, 화산재, 등 대를 안정적으로, 일관 된 응답의 부족은 자극 제어에 오류 같은 큰 실험 문제를 나타내는 수 응답. 응답의 피크 강도 변화 응답에 경우에 조사 수 있습니다. 표준 편차 또는 표준 오차 ( 그림 2F)로 자취를 그릴 수 있습니다. 표준 편차는 작은, 자취를 플롯 하 고 같은 분석 수 있습니다. 눈에 띄는 양의 편차 적당 한 표준 편차로 이어지는 경우, 데이터 수 있습니다 heatmaps 응답 응답에 의해 응답 변화를 보여 "유형"으로 분류 되어 동반과 같은 플롯. 중요 한 변화 (그림 3), 어떤 점에서 봉우리 가우스 방식으로 배포할 수 없지만, 만약 응답 응답 "종류" (예를 들어, depolarizing, hyperpolarizing, 또는 비 편광)으로 분류 될 수 있다23. 특정 "유형"에 속하는 응답 꾸몄다 고 함께 분석 될 수 있습니다. 마찬가지로, heatmaps 또한이 분석을 동반 한다.
앞으로 이동,이 장치 로드 포트 더욱 좁혀서 애벌레 무대 선 충의 이미징 수 있도록 적응 될 수 있다. 더 로드 포트의 끝의 축소 감각 뉴런의 세포 체에 반대 그냥 속눈썹의 이미징에 대 한 허용을 동물의 제약 조건에 대 한 허용 됩니다. 다른 장치는 더 일반적으로 공부 자웅 동체에 대 한 설계 되었습니다, 남성 신경 회로에 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 후 각 칩이 있습니다. 남자의 코 넥 텀은 아직도 해명 되 고로 섹스 전용 네트워크에 신경 역학을 측정할 수 있게 되 고 하는 것이 신경 신호를 완벽 하 게 이해 중요 합니다. 자웅 동체와 남성 응답의 차이 이제 테스트할 수 하 고이 장치를 사용 하 여 측정.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 마누엘 짐머 남성;와 사용을 위해 적응 시켰다 초기 디자인 파일 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 합성 및 ascr #3;의 공급에 대 한 프랭크 슈뢰더 로스 Lagoy 통찰력 및 영상 및 분석; 그리고 크리스토퍼 낙하산, 함께 마스터 제작 및,로 라 Aurilio이이 원고 검토에 기여. 이 작품에 대 한 자금 국립 보건원 그랜트 1R01DC016058-01 (제), 국립 과학 재단 부여 CBET 1605679 (D.R.A.), 및 버로우즈 Wellcome 경력 수상 과학 인터페이스 (D.R.A.)에서 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
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