Summary
Brugen af en tilpasset "olfaktoriske chip" for effektiv calcium billeddannelse af C. elegans mænd er beskrevet her. Undersøgelser af mandlige eksponering til glycerol og en pheromone er også vist.
Abstract
Brugen af calcium indikatorer har styrket vores forståelse af neurale dynamics og regulering. Nematode Caenorhabditis elegans, med sin helt kortlagt nervesystemet og gennemsigtig anatomi, præsenterer en ideel model for forståelse real-time neurale dynamics ved hjælp af calcium indikatorer. I kombination med mikrofluid teknologier og eksperimentelle design, er calcium-imaging studier ved hjælp af disse indikatorer udført i både fri bevægelse og fangne dyr. Men de fleste tidligere undersøgelser udnytte fældefangst enheder, såsom den olfaktoriske chip beskrevet i Chronis et al., har enheder, beregnet til brug i den mere almindelige hermafrodit, som den mindre fælles mand er både morfologisk og strukturelt ulige. En tilpasset olfaktoriske chip var designet og fremstillet til øget effektivitet i mandlige neuronal imaging med hjælp af unge voksne dyr. En tur blev indarbejdet i ormen lastning port til at rotere dyrene og give mulighed for adskillelse af de enkelte neuroner i en bilateral par i 2D billedbehandling. Orme er udsat for en kontrolleret strøm af lugtstof inden for mikrofluid enheden, som beskrevet i tidligere hermafrodit undersøgelser. Calcium transienter er derefter analyseret ved hjælp af open source-software ImageJ. Proceduren beskrevet heri bør give mulighed for en øget mængde af mand-baserede C. elegans calcium billeddiagnostiske undersøgelser, uddybe vores forståelse af mekanismerne i sex-specifikke neuronal signalering.
Introduction
Mikrofluid enheder give øget adgang til netop kontrollerede miljøer, hvori dyr, såsom nematode C. elegans, kan være eksperimentelt manipulerede1. Disse undersøgelser omfatter adfærdsmæssige assays, calcium billeddiagnostiske undersøgelser eller endda screeninger for specifikke fænotyper, hvilket resulterer i mere nøjagtige målinger af eksperimentelle resultater1,2,3,4, 5,6. Mikrofluidik giver mindre flydende betingelser hvorigennem detaljerede eksperimenter kan køres, mens du udnytter minimale mængder af reagenser. Der er en konstant produktion af nye mikrofluid enhed designs, og brugen af hver varierer fra arenaer, der giver mulighed for den naturlige sinusformet bevægelse af C. elegans i adfærdsmæssige assays og neurale imaging studier, at fælde enheder, der bruges i neurale billedbehandling og olfaktoriske undersøgelser, at enheder, som giver mulighed for høj overførselshastighed fænotypiske analyser i genetiske skærme4,5,6,7. Efter fabrikation af en master skimmel, mikrofluid enheder er billige at konstruere — givet genbrugelighed af master- og nem at bruge, giver mulighed for hurtige data generation via høj overførselshastighed undersøgelser. Fabrikation af enheder ved hjælp af polymerer såsom Polydimethylsiloxan (PDMS) giver mulighed for oprettelsen af nye enheder inden for timer.
Calcium imaging studier bruge genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) udtrykt i target-cellerne til at måle den neurale dynamikken i disse celler i realtid8,9,10,11. Den gennemsigtige karakter af C. elegans giver mulighed for optagelse af de fluorescerende forvaltningsniveauer disse proteiner i levende dyr. Traditionelt, GECIs stole på de grønne fluorescerende proteiner (NGL)-baseret sensor normal god landbrugspraksis-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), men nyere undersøgelser har tilpasset disse sensorer til at give mulighed for bedre signal-støj-forhold og rød-forskudt excitation profiler. Efter udviklingen af GCaMP3 proteiner med disse specifikationer har varieret, herunder sensorer som GCaMP6s og GCaMP6f (langsom og hurtig fluorescens off-priser, henholdsvis), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (ColbyBruce), som har en rød-forskudt aktivering profil. Kombinationen af disse GECIs med C. elegans celle-specifikke promotor gensekvenser kan målrette celler af interesse, især sensoriske neuroner12,13,14,15 , 16.
Mens C. elegans brugervenlighed i mikrofluid undersøgelser fremgår, har næsten alle undersøgelser fokuseret på hermafroditter. Trods mænd kun tegner sig for 0,01-0,02% af befolkningens vildtype, uvurderlig resultater kan opstå fra deres karakterisering. Mens den fysiske connectome af hermafrodit nervesystemet er blevet fuldt kortlagt for årtier17, stadig den mandlige connectome ufuldstændige, især i regionen hoved i den animalske18. Brugen af calcium imaging i hanner vil bidrage til at skabe en forståelse af det mandlige nervesystemet og de forskelle, der opstår mellem de to køn. Den mindre størrelse af C. elegans voksne hanner forhindrer effektiv og pålidelig diffusering i traditionelle olfaktoriske enheder beregnet til større hermafroditter lastning havne. For at løse dette, en modificeret version af Chronis olfaktoriske Chip19 blev udviklet med en smallere lastning port, en lavere kanal højde, og vender i den orm lastning port (som rotere dyret), giver mulighed for visualisering af bilaterale venstre/højre neuronal par. Dette design tillader: (1) effektive diffusering af unge voksne mænd, (2) en mere pålidelig orientering af dyr for visualisering af begge medlemmer af bilaterale parrede neuroner, og (3) den præcise billeddannelse af neurale aktivitet i mandlige neuroner.
I stigende grad viser undersøgelser, at C. elegans mænd reagere anderledes end hermafroditter til en række ascarosides (tilskrive) eller nematode feromoner20,21,22,23 ,24. Derfor er udvikle en forståelse af neurale dynamik og erklæringer inden for den mandlige connectome blevet endnu mere relevant. Mandlige C. elegans indeholder 87 sex-specifikke neuroner findes ikke i hermafrodit25,26, at ændre connectome i som-endnu ubestemt måder. At være i stand til at afbilde disse unikke neurale dynamik vil give os mulighed for bedre at forstå sex-specifikke svar og neurale repræsentationer.
Denne protokol beskriver brugen af en mand-tilpasset olfaktoriske chip til den neurale billeddannelse af mandlige C. elegans chemosensation. Nociceptive neuron aske reagerer pålideligt på 1 M glycerol hos mænd, i overensstemmelse med tidligere tvekønnede undersøgelser27. Eksponering for ascarosides kan fremkalde reaktioner, der er variabel fra dyr til dyr, der kræver et større antal dyr, der skal testes. Svar af mand-specifikke CEM neuroner har tidligere vist, gennem både Elektrofysiologi og calcium billeddiagnostiske undersøgelser, at reagere trinløst ascaroside #323.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. enhed fabrikation
NOTE: Se reference 1.
Bemærk: silicium master forme var opdigtet benytter standard photolithographic teknikker til mønster SU-8 photoresist på en silicium master 1 , 7. Komponeneter for wafer mønstre blev trykt på 25.000 dpi. De mandlige-tilpasset enhedsfunktioner en Chronis olfaktoriske Chip design 19 med en ændring i ormen lastning port, tilpasse et design fremstillet af M. Zimmer (personlig korrespondance, 2016). En tur er medtaget for at kontrollere rotation af dyrene. Bredden af ormen lastning port kanal er indsnævret til 50 μm. Alle kanaler er 32 μm tall. Når en silicium master mold er tilgængelig for brugeren, kan brugeren følge den efterfølgende protokol, som tidligere beskrevet 1.
- Mix PDMS base og hærdning agent i forholdet 10:1 vaegtprocent.
- Blandes grundigt med overførsel pipetter.
- Degas blandingen i et vakuum ekssikkator for 1 time, indtil alle synlige bobler er fjernet.
- Hæld blandingen på en silicium skimmel master i en 150 mm diameter parabol, indtil det er 5 mm tyk (100 g). Bruge Pasteur pipette til at fjerne eventuelle bobler eller støv, der er blevet introduceret til blandingen.
- Bages ved 65 ° C i mindst 3 timer eller natten over.
- Skære PDMS fra formen ved hjælp af en skalpel og skære de separate enheder fra hinanden ved hjælp af et barberblad.
- Punch indsugnings- og udstødningsporte huller med en 1 mm dermal punch.
- Flush huller med dH 2 O, ethanol, og igen med dH 2 O at fjerne partikler fra slag. Tør enheden i en luft stream pulse.
- Rense både kanal sider og oversiden af enheden med selvklæbende tape, fjernelse af støv eller snavs på enheden for at give mulighed for vellykket limning.
- Plasma-bond enhed, kanal-side ned, til en no. 1 dækslet glas.
- Eksponere cover glas og enhed (kanal-side op) til luft plasma ved hjælp af betingelser, der muliggør korrekt limning, såsom 100 W for 30 s eller 24 W for 60 s.
Bemærk: Indstillingerne kan justeres for at effektivisere limning. Plasma-bonding betingelserne er ikke så kritisk som ordentlig rengøring, når du forsøger at effektivisere limning. En utilstrækkeligt rengjort enhed vil ikke obligation, endda under ideelle plasma betingelser. - Invertere cover glas på kanal side af enheden, og tryk ned med tommelfingeren for 5 s.
- Eksponere cover glas og enhed (kanal-side op) til luft plasma ved hjælp af betingelser, der muliggør korrekt limning, såsom 100 W for 30 s eller 24 W for 60 s.
2. Buffer forberedelse
- Dilute 1 x S Basal (100 mM NaCl og 0,05 M KPO 4, pH 6.0) fra en steril 10 x bestand.
- Fortyndes 1 M tetramisole materiel til en endelig koncentration på 1 mM i 1 x S Basal for alle buffer løsninger.
- Tilføje fluorescein til begge de " flow control " og " buffer " reservoirer.
- Opret en 100 mg/mL bestand af fluorescein i 1 x S Basal.
- Fortyndes materiel til endelige koncentrationer af 1 µg/mL i flow-styringen og 0,1 µg/mL i bufferen.
- Opretter stimuli.
- Fortyndet glycerol til en endelig koncentration på 1 M i 1 X S Basal.
- Fortyndet ascaroside #3 (tilskrive #3) til en endelig koncentration på 1 µM i 1 X S Basal.
3. Enhedsopsætning
NOTE: Se 1.
fig. 1. Mikrofluid enhedsinstallation. (A) reservoirer og slanger. En 30 mL sprøjten uden en stemplet fungerer som den " reservoir. " dette er knyttet til en Luer ventil med tre indstillinger for flow. En stikkontakt er forbundet til en 3 mL sprøjte med en stemplet, mens den anden er forbundet med en nål (orange), der er indsat i slangen, der forbinder til mikrofluid enhed. (B) overordnet opsætning af mikrofluid imaging eksperiment. Enheden er placeret på en scene af en inverteret epifluorescensmikroskop over målet linser. Den " flow control " buffer rejser gennem en 3-vejs ventil, der kontrolleres af en enhed på hylden over setup. Linjer, der indeholder buffere er derefter indsættes i de relevante enhed porte. (C) mikrofluid-enhedens porte. Den " flow control " porte flankere de andre indgangsporte: den " stimulus " og " buffer " porte. Den " outlet " port er den port, højre-mest. På grund af placeringen af ormen lastning arena, den " orm lastning " port er central-meste port på enheden. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Forbered tre væske reservoirer ved at knytte en 30 eller 60 mL sprøjte til 3-vejs Luer ventil, med en 3 mL sprøjte og kanyle tilknyttes Luer ventilen så godt (som i figur 1A). Tilslut nålen til slanger, der strækker sig til mikrofluid enheden (som i figur 1A -B).
- Fjerne luftbobler fra reservoir og slangen.
- Fyld i 3 mL sprøjten med vedlagte slange med 1 x S Basal og indsætte det i en stikkontakt port.
- Forsigtigt lægge pres på sprøjten, indtil bufferen vises øverst i inlet huller.
- Tilslut flowkontrol, buffer og stimulus slanger til passende inlet huller (som i figur 1B -C), at sikre, at flydende dråber er til stede på begge lastning port hul og buffer slange skal knyttes.
- Igen, forsigtigt anvende pres på sprøjten, der er forbundet til udgangsporten indtil dråber vises i ormen lastning port inlet.
- Indsæt en solid blokerende pin i ormen lastning port.
- Fjern sprøjten fra udgangsporten og lægger linjen outlet tilsluttet hus vakuum (-670 Torr).
- Inspicere enheden for nogen bobler i strømmen kanaler, visuelt og gennem video bekræftelse via en software kompatibel med kameraet bruges som open source-software mikro-Manger. Se trin 6 tips om brug af Micro-Manager.
- Hvis nogen bobler er til stede, skal du vente dem at løsne eller blive absorberet i PDMS væg forud for lastning nogen dyr, tilstedeværelsen af bobler vil forstyrre den korrekte flow af væske gennem enheden.
- Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis filter, bekræfte korrekte flow dynamics inden for enheden før orm lastning ved aktivering 3-vejs ventil og observere skift af buffere.
- Afgøre den korrekte flow dynamics: observere fluorescein stede i flow kontrol og buffer løsninger ( figur 2D -2E) ændre når flow kontrol værdi er ændret ved at trykke på kontrol knappen svarende til 3-vejs ventil på linket ventil ( figur 1B).
- Efter åbning Micro-Manager, klik på " Live " at observere et levende billede af enheden. Tænd den fluorescerende lys kilde at iagttage strømmen af buffere i enheden ( figur 2D -2E).
Figur 2: En mand-tilpasset mikrofluid olfaktoriske chip. (A) flowet mønstre af enheden når ormen er udsat til buffer. Buffer (B) er vist i brun, og flowkontrol (FC) er vist i gul med stimulus (S) i hvid. Ormen lastning port er blevet tilpasset til at omfatte en kurve, som giver mulighed for bedre kontrol af ormen orientering. (B) flowet mønstre af enheden når ormen er udsat for stimulus. Buffer (B) er vist i brun, og flowkontrol (FC) er vist i gul med stimulus (S) i hvid. (C) målinger af tilpasset enhed som opdigtede. Ormen lastning port ender i en 42 µm åbning, med en 50 µm kanal designet til den mandlige bredde. Den målte højde af kanalerne er 32 µm, trods et mål på 25 µm i design. (D-E) A fanget mandlige udtrykker p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 promotor er ikke ASH-specifikke, og nogle udtryk kan observeres i ASI neuron, selv om ingen calcium transienter blev observeret i ASI. Billedet er (D) en kombination af lyse-felt og fluorescerende belysning, mens (E) er fluorescerende kun. Skala barer betegne 42 µm. (F) The ASH neuron reagerer på 1 M glycerol stimulation med robust neurale aktivitet. Det blå område angiver tidspunktet for 1 M glycerol stimulus. Det skraverede område angiver standardafvigelsen, med n = 20 impulser fra syv orme. De røde spor betegne depolariserende svar. Y-axes vise ΔF/F 0. Skalalinjen angiver 5 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. dyr forberedelse
NOTE: Se reference 23.
- Imaging aske svar til 1 M glycerol.
- Sted ca 20 C. elegans mænd, der er positive for p sra-6:: GCaMP3 array udtryk på en ødelægge vækst medium (NGM) agar plade seedede med en græsplæne af OP50 E. coli. Bruge udtryk for fluorescerende GECI og/eller en co injektion markør til identifikation af array-positive dyr.
Bemærk: Array positive dyr vil fluorescerer ifølge GECI brugt (dvs. dyr at udtrykke GCaMP vil fluorescerer grønt under blåt-lys stimulation, mens ColbyBruce dyr vil fluorescerer rødt under grønt lys stimulation). Co injektion markører kan variere fra andre fluorescerende proteiner, som normal god landbrugspraksis og RFP, til fænotypisk markører, såsom rol-6, eller kan redde en dominerende fænotype, såsom pha-1 mutation 28.- Hvis picking umiddelbart inden analysen, pick unge voksne hanner. Hvis picking dagen før analysen, vælge L4 larver mænd.
- Sted ca 20 C. elegans mænd, der er positive for p sra-6:: GCaMP3 array udtryk på en ødelægge vækst medium (NGM) agar plade seedede med en græsplæne af OP50 E. coli. Bruge udtryk for fluorescerende GECI og/eller en co injektion markør til identifikation af array-positive dyr.
- Imaging CEM svar på 1 µM tilskrive #3.
- Pluk ca 20 L4 C. elegans mænd (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); ham-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) der er positive for dsRed Co injektion markør udtryk.
Bemærk: dsRed udtryk inden for ray neuroner for mandlige eventyret er lettere at observere og bekræfte end GCaMP udtryk inden for de fire CEM neuroner. - Isolere disse mænd fra hermafroditter på en NGM agar plade seedede med en græsplæne af OP50 E. coli i 5-14 timer før du udfører den billeddiagnostiske eksperiment.
Bemærk: Hanner ikke isoleret til et minimum af 5 h reagerer ikke behaviorally at tilskrive #3 og derfor kan udvise endnu færre calcium transienter til ascaroside end observeret her.
- Pluk ca 20 L4 C. elegans mænd (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); ham-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) der er positive for dsRed Co injektion markør udtryk.
5. Animalske lastning
NOTE: Se refefence 1.
- Plukke en orm på en unseeded NGM agar plade ved hjælp af standard orm vedligeholdelse teknikker.
- Pick orme ved flambering pluk (gjort fladtrykte platin ledning), picking bakterier på pick, og " duppe " en orm at samle den op. Anbring forsigtigt ormen på den nye plade, så den kan kravle ud på sin egen.
- Tilføje ca. 5 mL 1 x S Basal til unseeded pladen, således at pladen er oversvømmet.
- Trække ormen i en ladning sprøjte (dvs. 3 mL sprøjte med vedlagte slange), der har været fyldt med 1 x S Basal.
- Sørg for at sutte ormen kun ind i slangen, ikke hele vejen ind i sprøjten.
Bemærk: Hvis ormen rejser ind i sprøjten, det er næsten umuligt at få det tilbage i slangen.
- Sørg for at sutte ormen kun ind i slangen, ikke hele vejen ind i sprøjten.
- Slukke vakuum til at stoppe strømmen ved at dreje Luer udløbsventilen.
- Fjerne solid pin blokning orm lastning port.
- Drej Luer ventilen forbundet til udgangsporten ( figur 1B), så det er udluftning.
Bemærk: Brug en live video feed under indlæsning af ormen til at bekræfte den placering og orientering af dyret (trin 5.8-5.13). - Indsæt ormen lastning slange i ormen lastning port.
- Forsigtigt lægge pres på sprøjten, indtil orm vises i lastning kanal.
- Hvis ormen begynder at indtaste kanal hale-første, trække i sprøjten stemplet til at forhindre, at ormen at indtaste kanalen.
- Skift mellem ansøger og vende pres indtil hovedet ind kanalen først.
- Åbent tomrum ved at dreje 3-vejs Luer ventil tilsluttet udgangsporten at åbne det til vakuum i stedet for atmosfæren.
- Manuelt lægge pres ved deprimerende sprøjte stemplet til at orientere og placere orm hoved, så det er udsat til buffer flow kanal, men ikke så langt, at hovedet kan bevæge sig frit ( figur 2 D-2E).
6. Stimulus og erhvervelse
- bruger en open source microscopy software, såsom Micro-Manager, optage ved at indfange billeder som en TIFF stak på 10 rammer/s ved hjælp af blå lys excitation (470 nm) for 30 s.
- Indstille eksponering på hovedmenuen til 100 ms.
- åben " multi D Acq. " i hovedmenuen af softwaren. Sæt den " nummer " til " 300, " og den " interval " til " 0. " Klik " erhverve! " at erhverve videoen.
- Anvend en 10 s puls af stimulus 5 s efter indledningen erhvervelse. Justere varigheden af stimulus program som ønskede.
- Efter at erhverve 5 s video, ændre den 3-vejs ventil kontrol flow kontrol buffer for at anvende stimulien på dyret bliver testet. Klik på knappen længst til venstre på linket ventil ( figur 1B).
- Efter 10 s af stimulus eksponering (denne gang kan tilpasses som ønsket af brugeren), ændre strømmen af buffere ved igen at trykke på knappen længst til venstre på linket ventil.
- Post under buffer kun indtil vinduet 30-s er færdig til at tillade GECI fluorescens at vende tilbage til baseline.
- Gentager som ønsket. Vent 30 s mellem slutningen af erhvervelse og indledningen af den næste retssag.
7. Billede analyse
- åbne TIFF stakken med open source-software, ImageJ, ved at trække filen til vinduet ImageJ.
- Klik ved hjælp af markøren og træk for at angive region af interesse (ROI) omkring neuron af interesse. Sat region til at omfatte soma af neuron af interesse (som i figur 3A).
- Plot i z-stakken af fluorescens-intensiteten af ROI på tværs af stakke ved at klikke på Åbn-> Image - > stakke - > Plot z-aksen profil.
- Klik " liste " i det vindue, der åbnes. Klik på Rediger - > kopier for at kopiere værdierne. Indsætte værdier i et regnearksprogram.
- Analyserer baggrunden fluorescens for hver puls ved at trække ROI til en region af ormen, som ikke indeholder GCaMP udtryk.
- Udføre baggrund subtraktion for hver puls ved at fratrække baggrund fluorescens fra neuron fluorescens intensitetsværdien.
- Beregne ΔF/F 0 for hver ramme af hver puls.
- Beregne F 0 som den gennemsnitlige intensitet værdi af ROI for første 1 s af erhvervelse (f.eks. rammer 1-10).
- Beregner ΔF/F 0 ved at dividere værdien baggrund-trækkes for rammen af interesse ved den beregnede F 0 værdi.
- Gentag for hver neuron afbildet og hver stimulus puls.
- For neuroner med konsekvente svar profiler, aske, gennemsnitlig alle impulser for hvert neuron og Beregn SEM (som i figur 2F).
- Plot gennemsnitlige ΔF/F 0 med SEM over tid for hvert neuron.
Bemærk: I dette tilfælde, det er almindelig praksis at medtage heatmaps af de individuelle neuronal svar af hvert forsøg. I neuroner, der ikke udviser ensartet ændringer i calcium transienter ved udsættelse for stimuli på tværs af gentagne stimulering, eller i forskellige individer 23, kan det være mere relevant at vise enkelte puls spor (som i figur 4). Se diskussion for detaljer ved fastlæggelse af, hvordan dataene skal vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på den overordnede enhed setup kan ses i figur 1A-B. Figur 1A skildrer ordentlig reservoir konstruktion og installation. Figur 1B viser forbindelser af reservoirer til mikrofluid enhed. Figur 1 c skildrer en mikrofluid enhed med individuelle porte mærket for klarhed.
Udformningen af den mandlige-tilpasset mikrofluid enhed indeholder en kurve i lastning port, men flow dynamics er identisk med enheden designet af Chronis et al.19(figur 2A-2 C). Strømmen af buffere kan kontrolleres ved at ændre, hvilke flow kontrolventil er åben (figur 2A-2B). Målinger af enheden som fabrikeret varierer fra filen designet. Målingerne i figur 2 c er "som opdigtede" målinger.
Efter ilægning mandlige C. elegans i den mandlige-tilpasset olfaktoriske enhed, deres placering og orientering, samt kanal flow dynamics, kan verificeres via både lysfelt og fluorescerende imaging (figur 2D-2E). Eksponering af orme at udtrykke GCaMP3 i nociceptive neuron, aske, til 1 M glycerol resulterer i synlige ændringer i fluorescens i aske neuron, vejledende af neurale aktivitet (figur 2F). Subtile ændringer i fluorescens kan ikke ses med det blotte øje, men software kan bruges til at kvantificere disse ændringer. Den gratis ImageJ software kan bruges til at analysere og kvantificere fluorescerende intensiteten af aske neuroner ved udsættelse for 1 M glycerol over tid (figur 2F). Dette er lig hvad er observeret i hermafroditter27 og på grund af robustheden af aske neuronal svar på glycerol, er dette observeret i alle dyr testet.
En lille mængde af aksial eller roterende bevægelse forventes i unparalyzed dyr, ofte nødvendiggør en neuron-tracking algoritme under video analyse (figur 3A). Tilføjelse af en lamme i buffere (f.eks. 1 mM tetramisole) eliminerer næsten denne virkning, selv om nogle dyr (~ 10%) stadig flytte under forsøgene. Dette kan omgås ved: (a) ved hjælp af ældre mænd, som er mere effektivt fanget; (b) faldende bredde og tykkelse af ormen lastning port endnu længere; eller (c) øge enten koncentrationen af den lamme anvendes eller ved hjælp af en anden lamme. Dette sikrer desuden, at der ikke er for meget af hovedet forbi slutningen af fælden og udsat for lugt kanal. Hvis en retssag med orm bevægelse opstår, kan området i analyse flyttet og genlæse fra den nye neuronal placering, startende fra den ramme, hvorefter bevægelsen opstår (figur 3B). Manuel genopbygning af de neurale spor af brugeren er påkrævet i dette tilfælde. Scripts at analysere de fluorescerende ændringer inden for neuron og at følge de neuron center, som den bevæger sig, kan også være skrevet19.
Mandlige C. elegans fornemme attraktive biogene feromoner kaldet ascarosides via fire sex-specifikke CEM neuroner23. Når calcium transienter observeres hos mænd, er svarene variabel i form, tegn og størrelsesorden mellem neuroner og dyr (figur 4A-B). Imidlertid er mandlige reaktion på feromoner ikke så pålideligt observeret som calcium transienter i mange dyr (figur 4 c). Dette er ikke afskrækkende, som de fleste ascarosides ikke fremkalde calcium transienter på sensation13,14,15.
Figur 3: fat orm bevægelse under erhvervelse billedperiode. (A) ΔF/F0 (ændre i fluorescerende intensitet divideret med den gennemsnitlige baggrundskoncentrationer fluorescerende intensitet for første 1 s af erhvervelse) blev beregnet ved hjælp af ImageJ ved at definere et område, hvor neuron interesse var pålideligt statisk for 1 s. Under stimulus pulsen (blåt område), dyret flyttet, som set i billederne ovenfor sporingen af calcium, resulterer i neuron ikke længere at være indeholdt i det analyserede område (gul boks). Skala barer betegne 42 µm. den stiplede linjer viser regionen i det spor, der svarer til placeringen af orm i hvert billede. (B) Hvis området for analyse er flyttet til følge neuron under retssagen og de enkelte spor er genopbygget for at formidle den faktiske neurale dynamics, sporingen vises som hvis dyret ikke rørte sig. De stiplede linjer Vis regionen i det spor, der blev rettet til orm bevægelse. Spor for både aske neuroner, venstre og højre (ASHL (rød) og ASHR (blå), henholdsvis) er vist. Y-axes vise ΔF/F0. Skalalinjen angiver 5 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mandlige C. elegans CEM svar på 1 μM tilskrive #3 er variabel. Male-specifikke CEM neuroner vise unikke mønstre af svar til biogene feromoner. (A) svar observeret i hver CEM neuron til en puls i en lydhør dyr er vist. Der er fire CEM neuroner: dorsale ret (CEM DR), dorsale venstre (CEM DL), ventrale højre (CEM VR), og ventrale venstre (CEM VL). Tre af de fire neuroner reagerer med depolarizations af varierende form og størrelse, med den fjerde svarer ikke til ascaroside. (B) ca. en tredjedel af de fangne dyr (2/7 testet i denne undersøgelse) resultere i kun tre neuroner at blive afbildet. Svar af en orm i denne orientering resulterede i CEM calcium transienter, der var anderledes end de observeret i den første orm. Dette var ikke på grund af ændringen i retning af ormen, som CEM DR er synlige i begge retninger og udstiller variable svar mellem dyr. (C) mange orme ikke reagere med nogen påviselig calcium transienter (5/7 testet i denne undersøgelse). Enkelte spor vist er repræsentative for de enkelt dyr vist i billeder over parceller. Denskala barer betegne 42 µm. spor: det blå område angiver tidspunktet for 1 μM tilskrive #3 eksponering. De røde spor betegne den depolariserende svar. De sorte spor betegne nogen observerede svar. Y-axes vise ΔF/F0. Skalalinjen angiver 5 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mandlige-tilpasset olfaktoriske chip indarbejder en tur i en smallere lastning port, som giver mulighed for mere kontrol af orientering og for den effektive diffusering af mandlige C. elegans. Dette giver mulighed for visualisering af både venstre og højre medlemmerne af neuronal bilaterale par, uden behov for z-stabling. Denne kurve fører til en orientering fra lodrette 100% af tiden i worms, hvor kun én bilaterale par henvender sig med et fluorescerende markør, såsom aske (figur 2D-E)29,30. Men i neuronal klasser med fire radialt symmetrisk neuroner, som CEM, alle fire neuroner er synlige kun en tredjedel af tiden. En anden tredjedel af orme testet har kun tre af de fire neuroner synlige, og de resterende tredje, kun at skelne forskellen mellem de dorsal og ventral celle organer, ikke højre-asymmetri (data ikke vist). Den snævre port er kombineret med en lavere kanal højde at forhindre orm udsving på tværs af z-aksen. Dette design giver mulighed for billeddannelse af hanner i fremtidige undersøgelser, som, når det kombineres med den stadigt voksende viden om den mandlige connectome25,31, vil give mulighed for en bedre forståelse af sex-specifikke neurale funktion.
Analysen udføres i denne protokol bruger den gratis software ImageJ til at måle ændringer i fluorescens i neuron af interesse. Med den nuværende udformning, 1 mM tetramisole i bufferen effektivt lammer orme og forhindrer bevægelse af neuroner at blive afbildet. Hvis bevægelse ikke er forebygges, eller hvis brugeren ønsker at undgå brugen af en lamme, være mere komplekse tracking scripts skrevet at spore neuroner som de flytte7. Men i denne protokol, mandlige orme kun flytte når de var for lille til begrænses effektivt ved pålæsning havnen, og når præsenteret med en yderst afskrækningsmiddel stimulus, såsom glycerol. Selv i disse tilfælde, bevægelsen er kort og kræver ikke store mængder af tracking justeringer — angive en ROI omkring den nye neuron placering lindrer de forkerte fluorescerende udlæsninger (figur 2).
En begrænsning af single-orm, trap-baseret tænkelig er dette kun en orm kan være afbildet på et tidspunkt1. En anden begrænsning af disse fælder er, at orme kan sidde fast i enheden, forårsager enheder til at blive tilstoppet og "brugt op" efter imaging kun et par orme. Men hurtig ekspeditionstid til fremstilling af nye enheder fra en master mold letter denne ulempe. Udvidet blue-lys belysning har også vist sig at fremkalde solskader i C. elegans32,33. Den relativt korte eksperimentelle tidsramme for denne protokol (30 s) giver mulighed for tænkelig uden målbare photobleaching. Men for at undgå photobleaching og solskader i længere eksperimenter, lyskilden kan være pulserende7. For eksempel, under hver 100-ms eksponering, kan lys være pulserende for 10 ms. dette har vist sig at fjerne øget krop autofluorescence over tid7.
For at korrekt teste mænd for deres svar på ascarosides, skal larve-fase 4 (L4) hanner først være isoleret fra hermafroditter, for mindst 5 h, for at opnå en nær naiv reaktion på feromoner23. Isolation for mindre end længden af tid kan forårsage dyr til at undlade at svare til ascarosides. Denne isolation er imidlertid ikke nødvendige, når afprøvning ikke-ascaroside stikord, såsom glycerol. For konsekvensens skyld var dyr dog altid isoleret mindst 5 h forud for calcium billeddannelse. I nogle neuroner, som CEM, ikke alle stimulering vil fremkalde en neuronal reaktion, og hver CEM, der reagerer sker for at generere en visse "kode" af neurale repræsentation. Dette fænomen i CEM er blevet observeret via Elektrofysiologi undersøgelser, samt med calcium billeddiagnostiske undersøgelser ligesom dem beskrevet her23. Således er målelige calcium transienter i CEM neuroner i hver ascaroside-eksponerede dyrs ikke garanteret23. I virkeligheden, fremkalde mange af de ascarosides undersøgt til dato ikke målbare calcium transienter13,15,34,35. Den vellykkede udvikling af målbare transienter blev observeret i løbet af kun en af tre pulser af feromon i to af de fem dyr udsættes for ascaroside af interesse (figur 3). Dette svarer satsen for succes tidligere observeret i andre labs23. Denne variation er en begrænsning, når man studerer pheromone svar og er ikke på grund af den mandlige-baserede fokus i denne protokol.
Når undersøger calcium transienter fremkaldt reaktion på ascarosides, bør man ikke afvise en mangel på sammenhængende svar uden yderligere undersøgelse. Det kan testes gennem eksperimenter såsom Elektrofysiologi undersøgelser for at bekræfte den variable svar inden for en neuronal klasse. For neuroner, som aske, der reagerer pålideligt, en mangel på konsekvent reaktion kunne være et tegn på større eksperimentelle problemer, såsom fejl i stimulus kontrol. Peak intensiteten af svarene kan også undersøges, hvis variabilitet forventes i svaret. Sporene kan afbildes med standardafvigelse eller standard fejl (som i figur 2F). Hvis standardafvigelsen er lille, kan sporene afbildet og analyseret som sådan. Hvis der er mærkbar mængde variation fører til moderat standardafvigelser, data kan være afbildet det samme, med tilhørende heatmaps sorteret efter reaktion "type" til at vise den svar af svar variation. Hvis der er betydelig variation (figur 3), hvori toppene ikke kan fordeles på en Gaussisk måde, svar kan kategoriseres i svar "typer" (fx depolariserende, hyperpolarizing eller ikke-polariserende)23. Reaktioner, der falder ind under en bestemt "type" kan være afbildet og analyseret sammen. Ligeledes bør heatmaps ledsage denne analyse.
Bevæger sig fremad, kan denne enhed tilpasses for at tillade til billeddannelse af larve-iscenesatte nematoder ved forsnævring lastning port endnu længere. Yderligere indsnævring af slutningen af lastning port vil give mulighed for begrænsning af dyret til billeddannelse af bare cilia af de sensoriske neuroner, i modsætning til cellen kroppen. Mens andre enheder er designet til de mere almindeligt studerede hermafrodit, tillader denne tilpasset olfaktoriske chip billeddannelse af neurale aktivitet i mandlige neurale kredsløb. Som connectome af mandlige er stadig at blive belyst, er at være i stand til at måle neurale dynamics i sex-specifikke netværk afgørende for fuldt ud at forstå neuronal signalering. Forskelle mellem tvekønnede og mandlige svar kan nu testes og måles ved hjælp af denne enhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Manuel Zimmer for at forsyne os med de oprindelige design-fil, der blev tilpasset til brug med hanner; Frank Schroeder til syntese og levering af tilskrive #3; Ross Lagoy for indsigt og bistand med billedbehandling og analyse; og Laura Aurilio for den master fabrikation og der, sammen med Christopher Chute, bidrog til gennemgangen af dette manuskript. Finansiering af dette arbejde blev fastsat under National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (js), National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) og Burroughs Wellcome karriere Award på den videnskabelige Interface (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
