Summary
Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.
Abstract
Het gebruik van calcium indicatoren heeft ons begrip van neurale dynamiek en verordening aanzienlijk verbeterd. De nematode Caenorhabditis elegans, met zijn volledig toegewezen zenuwstelsel en transparante anatomie, presenteert een ideaal model voor inzicht in real-time neurale dynamiek calcium indicatoren. Calcium-imaging studies met behulp van deze indicatoren worden in combinatie met microfluidic technologieën en experimentele designs uitgevoerd in zowel gratis voortbewegende en gevangen dieren. Echter hebben de meeste eerdere studies met behulp van vangst apparaten, zoals de olfactorische chip beschreven in Chronis et al., inrichtingen die zijn ontworpen voor gebruik in de meest voorkomende hermafrodiet, zoals het minder vaak mannetje zowel morfologisch en structureel is ongelijke. Een aangepast olfactorische chip is ontworpen en gefabriceerd voor meer efficiëntie bij de mannelijke neuronale imaging met het gebruik van jonge volwassen dieren. Een beurt werd opgenomen in de worm laadhaven haven te draaien van de dieren en voor de scheiding van de individuele neuronen binnen een bilaterale paar in 2D beeldvorming. Wormen zijn blootgesteld aan een gecontroleerde stroom van odorant binnen het microfluidic-apparaat, zoals beschreven in eerdere hermafrodiete studies. Calcium transiënten worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de open-sourcesoftware ImageJ. De hierin beschreven procedure ruimte laten voor een verhoogde hoeveelheid mannelijke gebaseerde C. elegans calcium imaging studies, verdiepen ons begrip van de mechanismen van het geslacht wordt bepaald neuronale signalering.
Introduction
Microfluidic apparaten toegenomen toegang bieden tot precies gecontroleerde omgevingen, waarin dieren, zoals de nematode C. elegans, experimenteel gemanipuleerde1kan worden. Deze studies omvatten gedrags testen, calcium beeldvorming studies, of zelfs zeefresten voor specifieke fenotypen, wat resulteert in meer exacte metingen van experimentele resultaten1,2,3,4, 5,6. Microfluidics bieden kleinschalige vloeibare omstandigheden, waardoor gedetailleerde experimenten kunnen worden uitgevoerd tijdens het gebruik te maken van de minimale hoeveelheden van reagentia. Er is een constante productie van nieuwe microfluidic apparaat ontwerpen, en het gebruik van elk varieert, van arenas waarmee voor de natuurlijke sinusvormige motie van C. elegans in behavioral testen en neurale beeldvorming studies, val van apparaten die worden gebruikt in de neurale beeldvorming en olfactorische studies, naar apparaten waarmee voor high-throughput fenotypische analyse in genetische4,5,6,7 schermen. Na de fabricage van een master mold, microfluidic apparaten zijn goedkoop te construeren-gegeven de herbruikbaarheid van de meester — en makkelijk te gebruiken, waardoor snelle gegevens generatie via high-throughput onderzoek. De fabricage van apparaten met behulp van polymeren zoals Polydimethylsiloxaan (PDMS) voorziet in de oprichting van nieuwe apparaten binnen uur.
Calcium imaging studies gebruik genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) uitgedrukt in de doelcellen te meten van de neurale dynamiek van deze cellen in real-time8,9,10,11. Het transparante karakter van C. elegans zorgt voor de opname van de fluorescerende niveaus van deze eiwitten in levende dieren. Traditioneel GECIs is afhankelijk van de groen fluorescente proteïne (GFP)-op basis van sensor GFP-Calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), hoewel het meer recente studies hebben deze sensoren voor betere signal-to-noise ratio's en rood-verschoven excitatie profielen aangepast. Na de ontwikkeling van GCaMP3, eiwitten met deze specificaties zijn gevarieerd, met inbegrip van sensoren zoals GCaMP6s en GCaMP6f (langzame en snelle fluorescentie af-tarieven, respectievelijk), evenals RFP-Calmoduline-M13 Peptide (RCaMP), die heeft een rode-verschoven activering profiel. De combinatie van deze GECIs met C. elegans cel-specifieke gensequenties promotor kan target cellen van belang, met name de sensorische neuronen12,13,14,15 , 16.
Terwijl het gebruiksgemak C. elegans in microfluidic studies blijkt, hebben bijna alle studies gericht op hermafrodieten. Ondanks de mannetjes slechts accounting voor 0.01-0,02% van de bevolking van wild type, onschatbaar bevindingen kunnen voortvloeien uit hun karakterisering. Terwijl de fysieke connectome van de hermafrodiete zenuwstelsel volledig in kaart voor decennia17 gebracht is, nog de mannelijke connectome onvolledig, vooral in de hoofd regio van de dierlijke18. Het gebruik van calcium beeldvorming bij mannen zal bijdragen tot het genereren van een goed begrip van de mannelijke zenuwstelsel en de verschillen die zich tussen de twee geslachten voordoen. De kleinere omvang van C. elegans volwassen mannetjes voorkomt dat effectieve en betrouwbare vangst in de havens van de laden van traditionele olfactorische inrichtingen die zijn ontworpen voor grotere hermafrodieten. Om aan te pakken dit, een gewijzigde versie van de Chronis olfactorische Chip19 werd ontwikkeld met een smaller laden poort, een lagere hoogte van het kanaal, en draait in de worm laden poort (die draaien het dier), waardoor voor de visualisatie van bilaterale links/rechts neuronale paren. Dit ontwerp toelaat: (1) de effectieve overlapping van jonge volwassen mannetjes, (2) een betrouwbaarder oriëntatie van het dier voor de visualisatie van beide leden van bilaterale gepaarde neuronen, en (3) de precieze beeldvorming van neurale activiteit in mannelijke neuronen.
Steeds meer tonen studies aan dat C. elegans mannetjes anders dan hermafrodieten op een verscheidenheid van ascarosides (ascr), of nematode feromonen20,21,22,23 reageren ,24. Daarom, ontwikkeling van een goed begrip van de neurale dynamiek en voorstellingen binnen de mannelijke connectome geworden zelfs meer relevant. Mannelijke C. elegans bevatten 87 geslacht-specifieke neuronen niet aanwezig in de hermafrodiete25,26, wijzigen van de connectome in als-nog onbepaald manieren. Zijnde kundig voor beeld van deze unieke neurale dynamiek zal ons in staat stellen geslacht-specifieke reacties en neurale vertegenwoordigingen beter te begrijpen.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een man-aangepast olfactorische chip voor de neurale beeldvorming van mannelijke C. elegans chemosensation. De Nociceptieve neuron die Ash op betrouwbare wijze op 1 M van glycerol in mannetjes, consistent met vorige hermafrodiete reageert bestudeert27. Blootstelling aan ascarosides kan uitlokken reacties die variabele van dier op dier, waarvoor een groter aantal dieren worden getest. De reactie van de man-specifieke CEM neuronen eerder gebleken, via zowel elektrofysiologie en calcium imaging studies, inspelen op variabel ascaroside #323.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van apparaat
Opmerking: zie referentie 1.
Opmerking: silicium master mallen waren vervaardigd gebruikend photolithographic standaardtechnieken voor patronen van SU-8 fotoresist op een silicium master 1 , 7. Fotomaskers voor wafer patronen werden gedrukt met 25.000 dpi. De man-aangepast apparaat is voorzien van een Chronis olfactorische Chip ontwerp 19 met een verandering in de worm laadhaven haven, een ontwerp verkregen M. Zimmer (persoonlijke correspondentie, 2016) aan te passen. Een beurt is opgenomen om de controle van de rotatie van de dieren. De breedte van de worm laden poort kanaal wordt teruggebracht naar 50 μm. Alle kanalen zijn 32 μm groot. Zodra een silicium meester mal beschikbaar voor de gebruiker is, de gebruiker de daaropvolgende kunt volgen protocol, zoals eerder beschreven 1.
- Mix PDMS basis en genezen agent op een 10:1-verhouding gewichtsprocent.
- Meng overschrijving pipetten.
- Ontgas het mengsel in een vacuüm exsiccator gedurende 1 uur, totdat alle zichtbare bellen zijn verwijderd.
- Giet het mengsel op een siliconen mal meester in een 150 mm diameter schotel, totdat het is 5 mm dik (100 g). Verwijder alle bubbels of stof die zijn ingevoerd om het mengsel van een pipet van Pasteur kunt.
- Bakken bij 65 ° C gedurende ten minste 3 uur, of 's nachts.
- Knippen van het PDMS uit de buurt van de schimmel met behulp van een scalpel en knip de afzonderlijke apparaten uit elkaar met een scheermesje.
- Inlaat en uitlaat gaten met een 1 mm dermale punch punch.
- Spoelen de gaten met dH 2 O, ethanol, en opnieuw met dH 2 O om deeltjes te verwijderen uit de stempels. Droog het apparaat in een lucht stroom puls.
- Reinigen van beide kanten van de zender en de bovenzijde van het apparaat met plakband, verwijderen van stof en vuil op het apparaat te maken voor succesvolle hechting resterende.
- Plasma-bond het apparaat, kanaal-zijde naar beneden, met een glas van de cover nr.1.
- Bloot cover glas en apparaat (kanaal-kant naar boven) aan plasma van de lucht met behulp van voorwaarden die het mogelijk voor goede hechting, zoals 100 W voor 30 maken s of 24 W voor 60 s.
Opmerking: Instellingen kunnen worden aangepast om de efficiëntie van de hechting te verbeteren. De plasma-bonding voorwaarden zijn niet zo kritisch als goede reiniging bij een poging om de efficiëntie van de hechting te verbeteren. Een onvoldoende gereinigde apparaat zal niet obligatie, zelfs onder ideale plasma voorwaarden. - Omkeren van het glas van de cover op de kant van het kanaal van het apparaat en druk op neer met de duim voor 5 s.
- Bloot cover glas en apparaat (kanaal-kant naar boven) aan plasma van de lucht met behulp van voorwaarden die het mogelijk voor goede hechting, zoals 100 W voor 30 maken s of 24 W voor 60 s.
2. Voorbereiding van de buffer
- Dilute 1 x S basale (100 mM NaCl en 0,05 M KPO 4, pH 6.0) uit een steriele 10 x voorraad.
- 1 M tetramisole voorraad om een eindconcentratie van 1 mM in 1 x S basale verdund voor alle buffer oplossingen.
- Fluoresceïne toevoegen aan zowel de " datatransportbesturing " en " buffer " stuwmeren.
- Maakt een voorraad van 100 mg/mL van fluoresceïne in 1 x S basale.
- De eindconcentraties van 1 µg/mL in de datatransportbesturing en 0,1 µg/mL in de buffer voorraad verdunnen.
- Maken de stimuli.
- Verdunde glycerol om een eindconcentratie van 1 M in 1 X S basale.
- Verdund ascaroside #3 (ascr #3) om een eindconcentratie van 1 µM in 1 X S basale.
3. App.instlng
Opmerking: Zie 1.
Figuur 1. Microfluidic app.instlng. (A) Reservoirs en buizen. Een 30 mL syringe zonder een plunjer fungeert als de " reservoir. " Dit is gekoppeld aan een Luer-klep met drie opties van de stroom. Een stopcontact is aangesloten op een 3 mL spuit met een zuiger, terwijl de andere op een naald (oranje) dat is ingevoegd in de buizen die verbinding met het microfluidic-apparaat maakt is aangesloten. (B) de algemene opstelling van de microfluidic imaging experiment. Het apparaat is geplaatst op een podium van een omgekeerde epifluorescence Microscoop, boven de objectieven. De " datatransportbesturing " buffer reist door een 3-weg klep die wordt gecontroleerd door een eenheid op de plank boven de setup. Lijnen met buffers zijn vervolgens ingevoegd in de juiste poorten. (C) de poorten van de microfluidic apparaat. De " datatransportbesturing " havens flank de andere inlaat-poorten: de " stimulus " en " buffer " havens. De " outlet " poort is de poort van de meest rechtse. Dankzij de ligging van de worm laden arena, de " worm laden " poort is de poort van de centrale-waarvan de meeste op het apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Voorbereiden drie vloeistof reservoirs door de 3-weg Luer klep, een 30 of 60 mL spuit aansluiten met een 3 mL spuit en naald gekoppeld aan de Luer-klep ook (zoals in figuur 1A). Leidingen die zich tot het microfluidic-apparaat uitstrekt verbinden met de naald (zoals in figuur 1A -B).
- Verwijderen van de luchtbellen uit het reservoir en buis.
- Vullen de 3 mL-spuit met bijgevoegde buizen met 1 x S basale en plaatst u deze in het stopcontact poort.
- Zachtjes druk uitoefenen op de spuit, totdat de buffer wordt weergegeven aan de bovenkant van de inlaat gaten.
- De datatransportbesturing, buffer en stimulans buizen verbinden met gaten van de juiste inlaat (zoals in figuur 1B -C), ervoor te zorgen dat vloeibare druppels aanwezig op zowel de laden port gat en de buffer buis worden gehecht.
- Weer zachtjes druk uitoefenen op de spuit die is aangesloten op de poort van de uitlaat tot druppels verschijnen in de worm laden poort inlaat.
- Plaats een solide blokkerende pin in de worm laden poort.
- Verwijderen van de spuit uit de retourzijde en bevestig de afvoer lijn aangesloten op het huis vacuüm (-670 Torr).
- Inspecteren het apparaat voor bubbels in de stroom kanalen, visueel en via video bevestiging via een software compatibel met de camera gebruikt, zoals de open-sourcesoftware Micro-Manger. Zie stap 6 voor tips over het gebruik van Micro-Manager.
- Als alle bubbels aanwezig zijn, wacht hen te verjagen of worden opgenomen in het PDMS muur vóór het laden van alle dieren; de aanwezigheid van bubbels zal verstoren de goede doorstroming van vloeistoffen door het apparaat.
- Goede stroom dynamiek binnen het apparaat met behulp van een filter GFP bevestigen vóór worm laden door de 3-wegkraan bedieningsmagneet en observeren de omschakeling van buffers.
- Bepalen de juiste flow dynamics: observeren de fluoresceïne aanwezig in de flow control en buffer oplossingen ( figuur 2D -2E) wanneer de waarde van de stroom-besturingselement wordt gewijzigd door te drukken op het besturingselement te wijzigen knop voor de 3-wegkraan op de klep koppeling ( figuur 1B).
- Na het openen van Micro-Manager, klik op " Live " te observeren een live beeld van het apparaat. De fluorescerende lichtbron te observeren van de stroom van buffers in het apparaat inschakelen ( figuur 2D -2E).
Figuur 2: Een man-aangepast microfluidic olfactorische chip. (A) de stroom patronen van het apparaat als de worm wordt blootgesteld aan buffer. Buffer (B) wordt weergegeven in het bruin en datatransportbesturing (FC) wordt weergegeven in het geel, met stimulus (S) in wit. De worm laadhaven haven is aangepast om op te nemen van een curve, die voor betere controle van worm oriëntatie zorgt. (B) de stroom patronen van het apparaat als de worm wordt blootgesteld aan stimulans. Buffer (B) wordt weergegeven in het bruin en datatransportbesturing (FC) wordt weergegeven in het geel, met stimulus (S) in wit. (C) metingen van het aangepast apparaat als verzonnen. De worm laadhaven haven eindigt in een 42 µm openen, met een 50 µm-kanaal dat is ontworpen voor de mannelijke breedte. De gemeten hoogte van de kanalen is 32 µm, ondanks een streefcijfer van 25 µm in het ontwerp. (D-E) A gevangen mannelijke waarin p sra-6:: GCaMP3. De promotor sra-6 is niet ASH-specifieke, en sommige expressie kan worden waargenomen in de ASI neuron, hoewel geen calcium transiënten werden waargenomen in ASI. Het beeld is (D) een combinatie van lichte-veld en TL verlichting, terwijl (E) alleen tl is. De schaal balken duiden 42 µm. (F) de ASH neuron reageert op 1 M van glycerol stimulatie met robuuste neurale activiteit. Het blauwe gebied duidt de tijd van de 1 M glycerol stimulus. Het gearceerde gebied geeft de standaardfout, met n = 20 pulsen van zeven wormen. De rode sporen duiden depolarizing reacties. De Y-axes weergeven ΔF/F 0 De schaal balk duidt 5 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. dier voorbereiding
Opmerking: zie referentie 23.
- Imaging ASH reacties op 1 M van glycerol.
- Plaats ongeveer 20 C. elegans mannetjes die positief voor p sra-6:: GCaMP3 matrix expressie op een nematode middellange (NGM) agar groeischijf bezaaid met een gazon van OP50 E. coli. Gebruik van de uitdrukking van fluorescerende GECI en/of een co injectie marker voor de identificatie van matrix-positieve dieren.
Opmerking: De positieve dieren Array fluoresceren volgens de GECI gebruikt (dat wil zeggen, de dieren GCaMP uiten fluoresceren onder blauw-licht stimulatie, groene terwijl RCaMP dieren rood onder groen-licht stimulatie fluoresceren). Co injectie markeringen kunnen variëren van andere fluorescerende eiwitten, zoals GFP en RFP, tot fenotypische markers, zoals rol-6, of een dominante fenotype, zoals de pha-1 mutatie 28 kunnen redden.- Als plukken onmiddellijk voorafgaand aan de test, pick jonge volwassen mannetjes. Als het oppakken van de dag voorafgaand aan de test, kies L4 larvale mannetjes.
- Plaats ongeveer 20 C. elegans mannetjes die positief voor p sra-6:: GCaMP3 matrix expressie op een nematode middellange (NGM) agar groeischijf bezaaid met een gazon van OP50 E. coli. Gebruik van de uitdrukking van fluorescerende GECI en/of een co injectie marker voor de identificatie van matrix-positieve dieren.
- Imaging de CEM reacties op 1 µM ascr #3.
- Pick ongeveer 20 L4 C. elegans mannetjes (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); hem-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dat zijn positief voor dsRed co injectie marker expressie.
Opmerking: dsRed uitdrukking binnen de ray neuronen van het mannelijke verhaal is gemakkelijker te observeren en te bevestigen dan GCaMP uitdrukking binnen de vier CEM neuronen. - Isoleren deze mannetjes van hermafrodieten op een NGM agarplaat alvorens het imaging experiment uit te voeren met een gazon van OP50, E. coli, voor 5-14 h agarvoedingsbodem.
Opmerking: Mannetjes niet geïsoleerd voor een minimum van 5 h gedragsgestoorde niet reageren op ascr #3 en daarom kan vertonen zelfs minder calcium transiënten aan de ascaroside dan hier waargenomen.
- Pick ongeveer 20 L4 C. elegans mannetjes (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); hem-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dat zijn positief voor dsRed co injectie marker expressie.
5. Dierlijke laden
Opmerking: Zie refefence 1.
- Halen één worm op een unseeded NGM agar bord met behulp van standaard worm onderhoud technieken.
- Pick wormen door een pick (gemaakt van afgevlakte platina-draad), het oppakken van bacteriën naar de pick, flaming en " deppen " een worm oprapen. Zachtjes de worm op de nieuwe plaat, zodat het kruipen uit op zijn eigen plaats.
- Ongeveer 5 mL 1 x S basale toevoegen aan de unseeded plaat, zodat de plaat wordt overspoeld.
- Trekken van de worm in een injectiespuit met laden (dat wil zeggen, 3 mL injectiespuit met bijgevoegde buizen) die al vooraf gevuld met 1 x S basale.
- Zorg ervoor dat de worm alleen in de buis, niet helemaal in de spuit zuigen.
Opmerking: Als de worm reist in de spuit, het is bijna onmogelijk om het terug in de buis.
- Zorg ervoor dat de worm alleen in de buis, niet helemaal in de spuit zuigen.
- Uitschakelen van het vacuüm om te stoppen met de stroom door te draaien aan het bedrijfsventiel Luer.
- Verwijderen van de vaste pin blokkeren de worm laden poort.
- Zet de Luer-klep aangesloten op de poort van de uitlaat ( figuur 1B), zodat het is ontluchting.
Opmerking: Gebruik een live video feed tijdens het laden van de worm te bevestigen de locatie en richting van het dier (stappen 5,8-5.13). - Invoegen van de worm laden buis in de worm laden poort.
- Zachtjes druk uitoefenen op de spuit, totdat de worm wordt weergegeven in het kanaal laden.
- Als de worm begint te het kanaal staart-eerste binnenkomen, trek op de zuiger van de spuit om te voorkomen dat de worm de kanaal.
- Schakelen tussen de toepassing en het omkeren van druk totdat het hoofd het kanaal eerst treedt.
- Open het vacuüm door te draaien aan de 3-weg Luer klep op de poort van de uitlaat aangesloten te openen om te zuigen in plaats van sfeer.
- Handmatig toe te passen druk door indrukken van de zuiger van de spuit om te oriënteren en plaats van het hoofd van de worm, zodanig dat de katalysator is blootgesteld aan de buffer stroom kanaal, maar niet zo ver dat het hoofd kan zich bewegen ( Figuur 2 D-2E).
6. Stimulus en overname
- met behulp van een open-source microscopie software, zoals Micro-Manager, opnemen door het vastleggen van beelden als een TIFF-stapel op 10 frames per seconde met behulp van blauw-licht excitatie (470 nm) voor 30 s. Instellen van de belichting op het belangrijkste menu aan 100 ms.
- Open
- " multi D Acq. " van het belangrijkste menu van de software. Stel de " nummer " te " 300, " en de " interval " te " 0. " klikt u op " ophaal! " te verwerven van de video.
- Toepassen een 10 s puls van de stimulus 5 s na de inleiding van de overname. De duur van de prikkel toepassing desgewenst aanpassen.
- Na het verwerven van 5 s-video, wijzigen de 3-wegkraan beheersing van de flow control buffer de prikkel om op te passen het dier wordt getest. Klik op de knop uiterst links op de klep koppeling ( figuur 1B).
- Na 10 s van stimulans blootstelling (ditmaal kan worden aangepast door de gebruiker als gewenst), de stroom van buffers wijzigen door opnieuw op de meest linkse knop op de klep koppeling.
- Record onder buffer alleen totdat het venster 30-s voltooid is om de fluorescentie van de GECI terug te keren naar basislijn.
- Herhaal desgewenst. Wacht 30 s tussen het einde van de overname en de opening van de volgende proef.
7. Analyse van het beeld
- de TIFF-stack met de open-source software, ImageJ, openen door het bestand te slepen in het venster ImageJ.
- Klik met behulp van de cursor en sleep als u wilt instellen van de regio van belang (ROI) rond het neuron van belang. Instellen van de regio op te nemen van het soma van het neuron van belang (zoals in figuur 3A).
- De z-stack van de intensiteit van de fluorescentie van de ROI over stapels uitzetten door op openen te klikken-> beeld - > Stacks - > z-profiel Plot.
- Klik " lijst " in het venster dat wordt geopend. Klik op Edit - > kopiëren om te kopiëren van de waarden. Plak de waarden naar een spreadsheetprogramma.
- Analyseren van de fluorescentie van de achtergrond voor elke pulse door naar een regio van de worm, die geen GCaMP expressie bevat te slepen van de ROI.
- Achtergrond aftrekken voor de elke puls uitvoeren door af te trekken van de waarde van de fluorescentie achtergrond uit de neuron waarde voor de intensiteit van de fluorescentie.
- ΔF/F, 0 voor elk frame voor elke pulse berekenen.
- Berekenen F 0 als de intensiteitswaarde van de gemiddelde van de ROI voor eerste 1 s van overname (bijvoorbeeld frames 1-10).
- ΔF/F 0 berekenen door het verdelen van de achtergrond-afgetrokken waarde voor het frame van belang door de berekende waarde van F 0.
- Herhaal voor elke neuron beeld en elke prikkel puls.
- Voor neuronen met consistente respons profielen, zoals ASH, gemiddeld alle pulsen voor elk neuron en berekenen van de SEM (zoals in figuur 2F).
- De gemiddelde ΔF/F 0 met SEM uitzetten na verloop van tijd voor elk neuron.
Opmerking: In dit geval is het gebruikelijk om te omvatten heatmaps van de individuele neuronale antwoorden voor elk afzonderlijk experiment zo goed. In neuronen die geen consistente verandering in de calcium transiënten bij blootstelling aan prikkels over herhaalde stimulaties vertonen, of in verschillende individuen 23, het mogelijk meer toepassing op afzonderlijke puls sporen (zoals in Figuur 4). Zie de discussie voor meer informatie over het bepalen van hoe de gegevens moeten worden weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van de algehele app.instlng kan worden gezien in figuur 1A-B. Figuur 1A beeldt de juiste reservoir bouw en installatie. Figuur 1B toont de aansluitingen van de stuwmeren aan het microfluidic apparaat. Figuur 1 c toont een microfluidic-apparaat met afzonderlijke poorten gelabeld voor duidelijkheid.
Het ontwerp van het microfluidic male-aangepast apparaat bevat een curve in de haven van laden, maar flow dynamics zijn identiek aan het apparaat ontworpen door Chronis et al.19(figuur 2A-2 C). De stroom van buffers kan worden gecontroleerd door een wijziging van die flow control ventiel is geopend (figuur 2A-2B). De metingen van het apparaat zoals gefabriceerd variëren van het ontworpen bestand. De metingen die in figuur 2C zijn "zo verzonnen" metingen.
Na het laden mannelijke C. elegans in de man-aangepast olfactorische apparaat, hun plaatsing en oriëntatie, evenals kanaal flow dynamics, kan worden geverifieerd via zowel lichte-veld en fluorescerende beeldvorming (figuur 2D-2E). De blootstelling van wormen uiting van GCaMP3 in de Nociceptieve neuron, ASH, tot 1 M glycerol resulteert in zichtbare veranderingen in fluorescentie binnen de ASH neuron, indicatieve van neurale activiteit (figuur 2F). Subtiele veranderingen in fluorescentie mogelijk niet zichtbaar met het blote oog, maar de software kan worden gebruikt om het kwantificeren van deze wijzigingen. De gratis ImageJ-software kan worden gebruikt voor het analyseren en kwantificeren van de fluorescerende intensiteit van ASH neuronen bij blootstelling aan 1 M glycerol na verloop van tijd (figuur 2F). Dit is vergelijkbaar met wat is waargenomen in hermafrodieten27 en, als gevolg van de robuustheid van de ASH neuronale reactie op glycerol, wordt dit waargenomen in alle geteste dieren.
Een kleine hoeveelheid axiale of roterende beweging wordt verwacht in unparalyzed dieren, waardoor vaak een neuron-tracking algoritme tijdens video-analyse (figuur 3A). De toevoeging van een verlamde in de buffers (bijvoorbeeld 1 mM tetramisole) elimineert bijna dit effect, hoewel sommige dieren (~ 10%) nog steeds tijdens de proeven verplaatsen. Dit kan worden omzeild door: (a) met behulp van oudere mannen, die efficiënter zijn gevangen; (b) het minderen van de breedte of de dikte van de worm laadhaven haven nog verder; of (c) verhogen ofwel de concentratie van de verlamde gebruikt of met behulp van een andere verlamde. Dit zal ook zorgen dat er niet teveel van het hoofd voorbij het einde van de val en blootgesteld aan de geur-kanaal. Als een proef met worm verkeer optreedt, kan het gebied van analyse worden verplaatst en herlezen van de neuronale nieuwbouw, beginnend bij de frame waarna de beweging zich (figuur 3B voordoet). Handmatige reconstructie van de neurale sporen door de gebruiker is vereist in dit geval. Scripts die de fluorescerende veranderingen binnen het neuron analyseren en die van het neuron centrum volgen als het beweegt19kan ook geschreven worden.
Mannelijke C. elegans zin aantrekkelijk biogene feromonen ascarosides via de vier geslacht-specifieke CEM neuronen23genoemd. Wanneer calcium transiënten worden waargenomen bij mannen, zijn de reacties variabel in vorm, teken en omvang tussen de neuronen én dieren (figuur 4A-B). Mannelijke reactie op de feromonen is echter niet zo betrouwbaar als calcium transiënten in veel dieren (figuur 4C) waargenomen. Dit is niet ontmoedigen, zoals de meeste ascarosides niet calcium transiënten op sensatie13,14,15 uitlokken doen.
Figuur 3: adressering worm beweging tijdens de periode van de verwerving afbeelding. (A) ΔF/F0 (verandering in fluorescerende intensiteit gedeeld door de gemiddelde achtergrond fluorescerende intensiteit voor eerste 1 s van overname) werd berekend aan de hand van ImageJ door de afbakening van het gebied waar het neuron van belang voor 1 betrouwbaar statische was s. Tijdens de stimulans pols (blauw gebied), het dier verplaatst, zoals te zien in de foto's boven de calcium-trace, wat resulteert in het neuron niet langer wordt opgenomen in de geanalyseerde gebied (gele box). De schaal balken duiden 42 µm. de stippellijnen Toon de regio van het spoor dat overeenkomt met de locatie van de worm in elke afbeelding. (B) indien het gebied van analyse wordt verplaatst naar het neuron volgen tijdens het proces en de afzonderlijke sporen zijn herbouwd om te brengen van de werkelijke neurale dynamiek, de trace verschijnt alsof het dier niet bewoog. De onderbroken lijnen tonen de regio van het spoor die gecorrigeerd voor worm beweging. Sporen voor zowel ASH neuronen, links en rechts (ASHL (rood) en ASHR (blauw), respectievelijk) worden weergegeven. De Y-axes weergeven ΔF/F0 De schaal balk duidt 5 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Mannelijke C. elegans CEM reactie op 1 μM ascr #3 is variabel. De man-specifieke CEM neuronen weer unieke patronen van reactie op biogene feromonen. (A) de waargenomen in elke CEM neuron voor één puls in één responsieve dier reacties worden weergegeven. Er zijn vier CEM neuronen: dorsale recht (CEM DR), dorsal links (CEM DL), ventrale recht (CEM VR) en ventrale links (CEM VL). Drie van de vier neuronen reageren met depolarizations van uiteenlopende vorm en omvang, met de vierde niet reageren op de ascaroside. (B) ongeveer eenderde van de gevangen dieren (2/7 getest in deze studie) resultaat in slechts drie neuronen kunnen worden beeld. De reacties van een worm in deze richting resulteerde in CEM calcium transiënten die anders dan die in de eerste worm waren. Dit was niet als gevolg van de verandering in de oriëntatie van de worm, als CEM DR zichtbaar in beide richtingen is en variabele reactie tussen dieren vertoont. (C) veel wormen niet reageren met eventuele detecteerbare calcium transiënten (5/7 getest in deze studie). Afzonderlijke sporen die weergegeven zijn representatief voor de enkele dieren getoond in de beelden boven de percelen. Deschaal balken duiden 42 µm. sporen: het blauwe gebied duidt de tijd van blootstelling van de ascr #3 1 μM. De rode sporen duiden de depolarizing reactie. De zwarte sporen geven geen reactie waargenomen. De Y-axes weergeven ΔF/F0 De schaal balk duidt 5 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De man-aangepast olfactorische chip integreert een bocht in een smaller laden-poort, waarmee voor meer controle van de oriëntatie en de efficiënte overlapping van mannelijke C. elegans. Dit zorgt voor de visualisatie van zowel de linker- en leden van neuronale bilaterale paren, zonder de behoefte van de z-stapelen. Deze curve leidt tot een oriëntatie uit de buurt van verticale 100% van de tijd in wormen waar slechts een paar van de bilaterale is gericht met een fluorescerende marker, zoals ASH (figuur 2D-E)29,30. Echter in neuronale klassen met vier radiaal symmetrisch neuronen, zoals CEM, alle vier neuronen zijn zichtbaar slechts eenderde van de tijd. Een ander derde van wormen getest hebben slechts drie van de vier neuronen zichtbaar, en voor het resterende derde, het alleen te onderscheiden verschil is tussen de dorsale en ventrale cel organen, niet de asymmetrie van de links-rechts (gegevens niet worden weergegeven). De smallere poort wordt gecombineerd met een lagere hoogte van het kanaal om te voorkomen dat schommelingen van de worm in de z-as. Dit ontwerp zorgt voor de beeldvorming van mannen in de toekomst studies, die, wanneer gecombineerd met de steeds toenemende kennis van de mannelijke connectome25,31, zal zorgen voor een beter begrip van geslacht-specifieke neurale functie.
De analyse uitgevoerd in dit protocol maakt gebruik van de gratis software ImageJ voor het meten van veranderingen in de fluorescentie in het neuron van belang. Met het huidige ontwerp, 1 mM tetramisole in de buffer effectief verlamt de wormen en voorkomt dat verkeer van de neuronen image wordt gemaakt. Als verkeer is niet te voorkomen, of als de gebruiker wenst te vermijden van het gebruik van een verlamde, moeten meer complexe tracking scripts worden geschreven dat de neuronen bijhouden terwijl ze7 bewegen. Echter, in dit protocol, mannelijke wormen alleen verplaatsen wanneer ze te klein waren om effectief worden beperkt door de poort van het laden, en wanneer voorgesteld met een uiterst aversieve stimulus, zoals glycerol. Zelfs in deze gevallen, het verkeer is kort en vereist geen grote hoeveelheden tracking aanpassingen — instellen een ROI rond de nieuwe locatie van het neuron vermindert de onjuiste fluorescerende uitlezingen (Figuur 2).
Een beperking van één-worm, val gebaseerde imaging is dat slechts één worm kan worden beeld op een tijd1. Een andere beperking van deze traps is dat wormen vast komen te in het apparaat zitten kunnen, waardoor apparaten kunnen worden verstopt en "gebruikt om" na slechts een paar wormen imaging. Echter, de snelle doorlooptijd voor de fabricage van nieuwe apparaten van een meester mal verlicht dit nadeel. Uitgebreide blauw-licht verlichting is ook aangetoond voor het opwekken van photodamage in C. elegans32,33. De relatief korte experimentele tijdsbestek van dit protocol (30 s) zorgt voor imaging zonder meetbare photobleaching. Voorkom photobleaching en photodamage in langere experimenten, kan de lichtbron echter gepulseerde7. Bijvoorbeeld, tijdens de blootstelling van elke 100-ms, kan het licht worden gepulseerde voor 10 ms. Dit is aangetoond dat het elimineren van verhoogde lichaam autofluorescence over tijd7.
Om goed testen mannetjes voor hun reacties op ascarosides, larvale stadium 4 (L4) mannen moeten het eerst worden geïsoleerd van hermafrodieten, voor ten minste 5 h, met het oog op een in de buurt van-naïeve reactie op de feromonen23. Isolatie voor minder dan zo lang kan dieren niet reageren op de ascarosides veroorzaken. Deze isolatie is echter niet nodig bij het testen van niet-ascaroside signalen, zoals glycerol. Omwille van de consistentie waren dieren echter altijd geïsoleerd ten minste 5 h voorafgaande aan calcium imaging. In sommige neuronen, zoals de CEM, niet elke stimulatie zal ontlokken een neuronale reactie en elke CEM die reageert doet voor het genereren van een bepaalde "code" van neurale vertegenwoordiging. Dit fenomeen in CEM geconstateerd via electrofysiologie studies, alsook met calcium imaging studies zoals degene hier23 beschreven. Dus, meetbare calcium transiënten in CEM neuronen in elk dier van ascaroside-blootgesteld zijn niet gegarandeerd23. In feite doen veel van de ascarosides onderzocht tot nu toe niet meetbaar calcium transiënten13,15,34,35uitlokken. De succesvolle organisatiekennis van meetbare transiënten werd geobserveerd gedurende slechts één van de drie pulsen van feromoon in twee van de vijf dieren blootgesteld aan de ascaroside van belang (Figuur 3). Dit komt overeen met het tarief van succes eerder waargenomen in andere laboratoria23. Deze variabiliteit is een beperking bij de studie van feromoon reactie en is niet te wijten aan de mannelijke gebaseerde focus van dit protocol.
Bij het onderzoeken van calcium transiënten ontlokte in reactie op ascarosides, moet men een gebrek aan consistente respons zonder nader onderzoek niet ontslaan. Dit kan worden getest door middel van experimenten zoals electrofysiologie studies te bevestigen de variabele antwoord binnen een neuronale klasse. Voor neuronen, zoals ASH, reageren die betrouwbaar, een gebrek aan consistente respons kan worden indicatie van grotere experimentele problemen, zoals fouten in stimulans controle. De intensiteit van de piek van de antwoorden kan ook worden onderzocht als variabiliteit in de respons wordt verwacht. De sporen kunnen worden uitgezet met de standaarddeviatie of de standaardfout (zoals in figuur 2F). Als de standaarddeviatie klein is, kunnen de sporen worden uitgezet en als zodanig geanalyseerd. Als er merkbare hoeveelheid variatie leidt tot matige standaardafwijkingen is, de gegevens kunnen worden uitgezet hetzelfde, met bijbehorende heatmaps gesorteerd op reactie "type" te tonen van de variatie van de reactie-door-reactie. Als er aanzienlijke variatie (Figuur 3), waarin de toppen kunnen niet worden gedistribueerd in een Gaussiaanse wijze, reacties kunnen worden onderverdeeld in reactie "typen" (bijvoorbeeld, depolarizing, hyperpolarizing of niet-polariserende)23. Reacties die in een bepaald "type" ingedeeld kunnen worden uitgezet en samen geanalyseerd. Heatmaps moet ook vergezeld gaan van deze analyse ook.
Vooruit, kan dit apparaat als u wilt toestaan voor de beeldvorming van larvale-geënsceneerde nematoden door vernauwing van de laden haven nog verder worden aangepast. Verdere vernauwing van het einde van de laden-poort zal toestaan voor de beperking van het dier te maken voor de beeldvorming van enkel de cilia van de sensorische neuronen, in tegenstelling tot de cel lichaam. Terwijl andere apparaten zijn ontworpen voor de meer algemeen bestudeerde hermafrodiet, wordt deze aangepast olfactorische chip zorgt voor de beeldvorming van neurale activiteit in mannelijke neurale circuits. Zoals de connectome van de man is nog steeds wordt opgehelderd, is zijnde kundig voor meten van neurale dynamiek in geslacht-specifieke netwerken essentieel voor het volledig begrijpen van neuronale signalering. Verschillen tussen hermafrodiete en mannelijke reacties kunnen nu worden getest en gemeten met behulp van dit apparaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij wil Manuel Zimmer bedanken voor het verstrekken van ons met het oorspronkelijke ontwerp-bestand dat werd aangepast voor gebruik met males; Frank Schroeder voor de synthese en de levering van ascr #3; Ross Lagoy voor het inzicht en de hulp bij beeldvorming en analyse; en Laura Aurilio voor de master fabricage en die, naast Christopher Chute, bijgedragen tot de herziening van dit manuscript. Financiering voor dit werk werd verstrekt onder de National Institutes of Health subsidie 1R01DC016058-01 (J.S.), de National Science Foundation subsidie CBET 1605679 (D.R.A.) en de Burroughs-Wellcome Career Award op de wetenschappelijke Interface (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
