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Neuroscience

पुरुष C. एलिगेंस सिर ंयूरॉंस में Pheromones के जवाब में ंयूरॉन गतिविधि के इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित Microfluidic घ्राण चिप का प्रयोग

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/56026
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

एक अनुकूलित "घ्राण चिप" के कुशल कैल्शियम इमेजिंग के लिए का उपयोग करें C. एलिगेंस नर यहां वर्णित है । ग्लिसरॉल और एक फेरोमोन के पुरुष एक्सपोजर का अध्ययन भी दिखाया गया है ।

Abstract

कैल्शियम संकेतकों का उपयोग बहुत तंत्रिका गतिशीलता और विनियमन की हमारी समझ को बढ़ाया है । निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस, अपनी पूरी तरह से मैप तंत्रिका तंत्र और पारदर्शी शरीर रचना के साथ, कैल्शियम संकेतक का उपयोग कर वास्तविक समय तंत्रिका गतिशीलता को समझने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रस्तुत करता है । microfluidic प्रौद्योगिकियों और प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ संयोजन में, इन संकेतकों का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन दोनों मुक्त चलती है और फंस जानवरों में प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि, सबसे पिछले अध्ययनों से इस तरह के घ्राण चिप के रूप में फँसाने उपकरणों का उपयोग, Chronis एट अलमें वर्णित., अधिक आम द्विलिंग में उपयोग के लिए डिजाइन उपकरणों है, के रूप में कम आम पुरुष दोनों आकृति और संरचनात्मक है भिंन. एक अनुकूलित घ्राण चिप डिजाइन और युवा वयस्क जानवरों का उपयोग कर के साथ पुरुष ंयूरॉन इमेजिंग में वृद्धि की क्षमता के लिए गढ़े गया था । एक बारी कीड़ा लदान बंदरगाह में शामिल करने के लिए जानवरों को घुमाएगी और 2d इमेजिंग में एक द्विपक्षीय जोड़ी के भीतर व्यक्तिगत ंयूरॉंस की जुदाई के लिए अनुमति दी गई । कीड़े microfluidic डिवाइस के भीतर एक नियंत्रित प्रवाह के लिए संपर्क कर रहे हैं, के रूप में पिछले द्विलिंग अध्ययन में वर्णित है । कैल्शियम यात्रियों तो खुले स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया पुरुष की एक बढ़ी हुई राशि के लिए अनुमति चाहिए-आधारित C. एलिगेंस कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन, सेक्स के तंत्र की हमारी समझ को मजबूत बनाने-विशिष्ट ंयूरॉंस संकेतन ।

Introduction

Microfluidic उपकरणों के लिए ठीक नियंत्रित वातावरण, जिसमें पशुओं, जैसे निमेटोड C. एलिगेंस, प्रयोग किया जा सकता है1हेरफेर करने के लिए वृद्धि की पहुंच प्रदान करते हैं । ये अध्ययन व्यवहार परख, कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन, या भी विशिष्ट phenotypes के लिए प्रदर्शन, प्रयोगात्मक परिणाम1के अधिक सटीक माप में जिसके परिणामस्वरूप शामिल है,2,3,4, 5,6. Microfluidics छोटे पैमाने पर तरल शर्तों के माध्यम से जो विस्तृत प्रयोगों चला जा सकता है प्रदान करते हुए रिएजेंट की ंयूनतम मात्रा का उपयोग । वहां नए microfluidic डिवाइस डिजाइन के एक निरंतर उत्पादन है, और प्रत्येक के उपयोग के क्षेत्र से भिंन होता है, जो व्यवहार परख और तंत्रिका इमेजिंग अध्ययन में सी. एलिगेंस के प्राकृतिक sinusoidal गति के लिए अनुमति देते हैं, जाल में प्रयुक्त उपकरणों के लिए तंत्रिका इमेजिंग और घ्राण अध्ययन, आनुवंशिक स्क्रीन4,5,6,7में उच्च प्रवाह phenotypic विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं कि उपकरणों के लिए । एक मास्टर मोल्ड के निर्माण के बाद, microfluidic उपकरणों का निर्माण करने के लिए सस्ती कर रहे है-मास्टर के प्रयोज्य दिया-और प्रयोग करने में आसान, उच्च प्रवाह अध्ययन के माध्यम से तेजी से डेटा पीढ़ी के लिए अनुमति दी । ऐसे polydimethylsiloxane (PDMS) के रूप में पॉलिमर का उपयोग उपकरणों का निर्माण घंटे के भीतर नए उपकरणों के निर्माण के लिए अनुमति देता है ।

कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) वास्तविक समय8,9,10,11में उन कोशिकाओं के तंत्रिका गतिशीलता को मापने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं में व्यक्त का उपयोग करें । सी. एलिगेंस की पारदर्शी प्रकृति रहते जानवरों में इन प्रोटीन के फ्लोरोसेंट स्तर की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है । परंपरागत रूप से, GECIs ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर भरोसा (GFP) आधारित सेंसर GFP-Calmodulin-M13 पेप्टाइड (GCaMP), हालांकि अधिक हाल के अध्ययनों से इन सेंसरों अनुकूलित किया है के लिए बेहतर संकेत करने के लिए शोर अनुपात और लाल-स्थानांतरित उत्तेजना प्रोफाइल के लिए अनुमति देते हैं. GCaMP3 के विकास के बाद, इन विनिर्देशों के साथ प्रोटीन GCaMP6s और GCaMP6f के रूप में सेंसर सहित विविध है, (धीमी और तेजी से प्रतिदीप्ति बंद दरों, क्रमशः), साथ ही साथ आरएफपी-Calmodulin-M13 पेप्टाइड (RCaMP), जो एक लाल है स्थानांतरित सक्रियण प्रोफ़ाइल । C. एलिगेंस सेल के साथ इन GECIs का संयोजन विशिष्ट जीन प्रमोटर अनुक्रम ब्याज की कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं, विशेष रूप से संवेदी ंयूरॉंस12,13,14,15 , 16.

जबकि microfluidic अध्ययन में सी. एलिगेंस उपयोग की सुगमता स्पष्ट है, लगभग सभी अध्ययनों ने hermaphrodites पर ध्यान केंद्रित किया है. पुरुषों के बावजूद केवल 0.01 के लिए लेखांकन-जंगली प्रकार की आबादी का 0.02%, अमूल्य निष्कर्ष उनके लक्षण वर्णन से पैदा कर सकते हैं । जबकि द्विलिंग तंत्रिका तंत्र के भौतिक connectome पूरी तरह से17दशकों के लिए मैप किया गया है, पुरुष connectome अधूरा रहता है, विशेष रूप से पशु18के प्रमुख क्षेत्र में । पुरुषों में कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करने के लिए पुरुष तंत्रिका तंत्र और मतभेद है कि दो लिंगों के बीच पैदा की समझ पैदा करने में मदद मिलेगी । C. एलिगेंस वयस्क पुरुषों के छोटे आकार बड़े hermaphrodites के लिए डिज़ाइन किया गया पारंपरिक घ्राण उपकरणों की लोडिंग बंदरगाहों में प्रभावी और विश्वसनीय फँसाने रोकता है । इस पते के लिए, Chronis घ्राण चिप के एक संशोधित संस्करण19 एक संकरा लोडिंग बंदरगाह, एक कम चैनल ऊंचाई के साथ विकसित किया गया था, और कीड़ा लोड हो रहा है बंदरगाह में बदल जाता है (जो जानवर घुमाते हैं), द्विपक्षीय के दृश्य के लिए अनुमति छोड़/ न्यूरॉन्स जोड़े. इस डिजाइन परमिट: (1) युवा वयस्क पुरुषों के प्रभावी फँसाना, (2) द्विपक्षीय युग्मित न्यूरॉन्स के दोनों सदस्यों के दृश्य के लिए पशु का एक अधिक विश्वसनीय अभिविन्यास, और (3) पुरुष न्यूरॉन्स में तंत्रिका गतिविधि की सटीक इमेजिंग.

तेजी से, अध्ययनों से पता चलता है कि C. एलिगेंस नर ascarosides (ascr), या निमेटोड pheromones20,21,22,23 की एक किस्म को hermaphrodites से अलग ढंग से प्रतिक्रिया ,24. इसलिए, पुरुष connectome के भीतर तंत्रिका गतिशीलता और अभ्यावेदन की समझ विकसित करना और भी प्रासंगिक हो गया है. पुरुष सी. एलिगेंस शामिल ८७ सेक्स विशिष्ट ंयूरॉंस में मौजूद नहीं द्विलिंग25,26, में फेरबदल connectome के रूप में अभी तक अनिर्धारित तरीके । छवि के लिए सक्षम होने के नाते इन अद्वितीय तंत्रिका गतिशीलता हमें बेहतर सेक्स को समझने के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और तंत्रिका अभ्यावेदन की अनुमति देगा ।

इस प्रोटोकॉल पुरुष सी एलिगेंस chemosensation के तंत्रिका इमेजिंग के लिए एक पुरुष अनुकूलित घ्राण चिप के उपयोग का वर्णन करता है । nociceptive ंयूरॉन राख पुरुषों में 1 मीटर ग्लिसरॉल को मज़बूती से जवाब, पिछले उभयलिंगी अध्ययन के साथ संगत27। ascarosides के संपर्क में पशु से पशु के लिए चर रहे हैं कि प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया जा करने के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । पुरुष विशिष्ट CEM ंयूरॉंस की प्रतिक्रिया पहले, दोनों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन के माध्यम से दिखाया गया है, को ascaroside #323के लिए निश्चित रूप से जवाब ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. डिवाइस निर्माण

< p class = "jove_content" > नोट: संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > 1 .

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: सिलिकॉन मास्टर मोल्ड पैटर्न के लिए मानक photolithographic तकनीकों का उपयोग कर गढ़े गए एसयू-8 एक सिलिकॉन मास्टर पर photoresist < सुप वर्ग = "xref" > 1 , < सुप क्लास = "xref" > 7 . वेफर पैटर्निंग के लिए Photomasks २५,००० डीपीआई पर मुद्रित किया गया । पुरुष-अनुकूलित डिवाइस एक Chronis घ्राण चिप डिजाइन सुविधाएं < सुप वर्ग = "xref" > 19 वर्म लोड हो रहा है बंदरगाह में एक परिवर्तन के साथ, एक डिजाइन के अनुकूल एम Zimmer (व्यक्तिगत पत्राचार, २०१६) से प्राप्त की । एक बारी जानवरों के रोटेशन को नियंत्रित करने के लिए शामिल किया गया है । वर्म लोड करने वाले पोर्ट चैनल की चौड़ाई ५० & #956; m तक सीमित है । सभी चैनलों ३२ & #956; मीटर लंबा है । एक बार एक सिलिकॉन मास्टर मोल्ड उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध है, उपयोगकर्ता अनुवर्ती प्रोटोकॉल का पालन कर सकते हैं, जैसा कि पहले वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > 1 .

  1. मिश्रण PDMS आधार और इलाज एजेंट एक 10:1 अनुपात में वजन से ।
  2. मिश्रण अच्छी तरह से स्थानांतरण पिपेट.
    3. के साथ
  3. Degas 1 ज के लिए एक निर्वात desiccator में मिश्रण है, जब तक सभी दिखाई बुलबुले हटा रहे हैं ।
  4. एक १५० मिमी व्यास डिश में एक सिलिकॉन मोल्ड मास्टर पर मिश्रण डालना जब तक यह 5 मिमी मोटी (१०० ग्राम) है । किसी भी बुलबुले या धूल है कि मिश्रण करने के लिए शुरू की गई है हटाने के लिए एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें ।
  5. सेंकना पर ६५ & #176; ग के लिए कम से 3 ज, या रात भर ।
  6. एक स्केलपेल का उपयोग कर मोल्ड से दूर PDMS कटौती और अलग उपकरणों के अलावा एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग काट ।
  7. पंच प्रवेश और एक 1 मिमी चमड़े का पंच के साथ आउटलेट छेद.
  8. डीएच 2 ओ, इथेनॉल के साथ छेद फ्लश, और फिर डीएच 2 ओ के साथ घूंसे से कणों को दूर करने के लिए । डिवाइस को एयर स्ट्रीम पल्स में सुखाएं.
  9. दोनों चैनल पक्षों और चिपकने वाला टेप के साथ डिवाइस के शीर्ष पक्ष को साफ, किसी भी धूल या डिवाइस पर शेष मलबे को हटाने के लिए सफल संबंध के लिए अनुमति देते हैं ।
  10. प्लाज्मा-बॉण्ड डिवाइस, चैनल साइड नीचे, एक नंबर 1 कवर ग्लास के लिए ।
    1. कवर ग्लास और डिवाइस (चैनल साइड) का पर्दाफाश करने के लिए एयर प्लाज्मा शर्तों का उपयोग कर कि उचित संबंध के लिए अनुमति देते हैं, ऐसे १०० w के लिए 30 s या 24 w के लिए ६० s.
      के लिए नोट: सेटिंग्स बंधुआ दक्षता में सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । प्लाज्मा संबंध शर्तों उचित सफाई के रूप में के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है जब बांडिंग दक्षता में सुधार करने का प्रयास । एक अपर्याप्त साफ डिवाइस बांड नहीं होगा, यहां तक कि आदर्श प्लाज्मा शर्तों के तहत ।
    2. डिवाइस के चैनल पक्ष पर कवर ग्लास पलटना और 5 एस के लिए अंगूठे के साथ नीचे प्रेस.
< p class = "jove_title" > 2. बफर वडा

  1. पतला 1x एस बेसल (१०० mM NaCl और ०.०५ M केपीओ 4 , pH ६.०) से एक बाँझ 10x स्टॉक.
  2. सभी बफर समाधान के लिए 1x एस बेसल में 1 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मीटर tetramisole शेयर पतला ।
  3. जोड़ fluorescein दोनों को & #34; प्रवाह नियंत्रण & #34; व & #34; बफर & #34; जलाशयों.
    1. 1x S बेसल में fluorescein के 100-मिलीग्राम/एमएल स्टॉक बनाएं
    2. 1 के अंतिम सांद्रता को शेयर पतला & #181; g/ml फ्लो कंट्रोल में और ०.१ & #181; g/ml बफ़र में.
  4. उत्तेजनाएं पैदा करते हैं ।
    1. 1x एस बेसल में 1 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लिसरॉल पतला
    2. पतला ascaroside #3 (ascr # 3) 1 के अंतिम एकाग्रता के लिए & #181; M में 1x S बेसल.
< p class = "jove_title" > 3. डिवाइस सेटअप

< p class = "jove_content" > नोट: < सुप वर्ग = "xref" > 1 .

< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg"/>
चित्रा 1. Microfluidic डिवाइस setup. ( A ) जलाशयों और टयूबिंग । एक सवार बिना एक 30 मिलीलीटर सिरिंज & #34; जलाशय के रूप में कार्य करता है । & #34; यह तीन प्रवाह विकल्पों के साथ एक Luer वाल्व से जुड़ा हुआ है । एक आउटलेट एक सवार के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा है, जबकि अंय एक सुई (नारंगी) है कि टयूबिंग कि microfluidic डिवाइस को जोड़ता में डाला जाता है से जुड़ा हुआ है । ( B ) microfluidic इमेजिंग प्रयोग के समग्र सेटअप । डिवाइस एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप के एक मंच पर रखा गया है, उद्देश्य लेंस के ऊपर. द & #34; प्रवाह नियंत्रण & #34; बफ़र सेटअप के ऊपर शेल्फ पर एक इकाई द्वारा नियंत्रित किया जाता है एक 3-तरफा वाल्व के माध्यम से यात्रा करता है । बफ़र्स वाली पंक्तियाँ तब उपयुक्त डिवाइस पोर्ट में सम्मिलित किए जाते हैं । ( ग ) के पत् microfluidic सिय ह । द & #34; प्रवाह नियंत्रण & #34; बंदरगाहों पार्श्व अंय प्रवेश बंदरगाहों: the & #34; उत्तेजना & #34; र & #34; बफर & #34; बंदरगाहों । द & #34; आउटलेट & #34; पोर्ट सही-सबसे पोर्ट है । वर्म लोडिंग अखाड़ा का स्थान होने के कारण, & #34; वर्म लोडिंग & #34; पोर्ट डिवाइस पर मध्य-अधिकांश पोर्ट है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. 3-way Luer वाल्व को 30 या ६० मिलीलीटर सिरिंज संलग्न करके तीन द्रव जलाशय तैयार करता है, साथ ही Luer वाल्व से जुड़ी 3 एमएल सिरिंज और सुई के साथ-साथ (< मज़बूत वर्ग में = "xfig" > फिगर 1a ) । microfluidic डिवाइस के लिए फैली है कि टयूबिंग के लिए सुई कनेक्ट (के रूप में < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a -बी ).
  2. जलाशय और टयूबिंग से हवा के बुलबुले को हटा दें ।
  3. 1x एस बेसल के साथ संलग्न टयूबिंग के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें और आउटलेट बंदरगाह में डालें ।
  4. धीरे से सिरिंज के लिए दबाव लागू जब तक बफर प्रवेश छेद के शीर्ष पर प्रकट होता है ।
  5. उपयुक्त प्रवेश छेद करने के लिए प्रवाह नियंत्रण, बफर, और उत्तेजना टयूबिंग कनेक्ट (के रूप में < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b -C ), सुनिश्चित करना है कि तरल बूंदों दोनों लोडिंग बंदरगाह छेद और बफर टयूबिंग पर मौजूद है संलग्न किया जा करने के लिए ।
  6. फिर से, धीरे सिरिंज है कि आउटलेट बंदरगाह से जुड़ा है जब तक बूंदों कीड़ा लदान बंदरगाह प्रवेश में दिखाई देने के लिए दबाव लागू होते हैं ।
  7. एक ठोस अवरुद्ध पिन वर्म लोड कर रहा है पोर्ट में डालें ।
  8. आउटलेट बंदरगाह से सिरिंज को हटा दें और घर निर्वात (-६७० Torr) से जुड़े आउटलेट लाइन देते हैं.
  9. प्रवाह चैनलों में किसी भी बुलबुले के लिए उपकरण का निरीक्षण, नेत्रहीन और वीडियो की पुष्टि के माध्यम से एक सॉफ्टवेयर के माध्यम से संगत इस तरह के खुले स्रोत सॉफ्टवेयर माइक्रो-प्रबंधक के रूप में इस्तेमाल किया कैमरा । माइक्रो-प्रबंधक का उपयोग करने पर युक्तियों के लिए चरण 6 देखें.
    1. किसी भी बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें उखाड़ देना या किसी भी जानवरों लदान करने से पहले PDMS दीवार में अवशोषित करने के लिए इंतजार; बुलबुले की उपस्थिति डिवाइस के माध्यम से तरल पदार्थ के उचित प्रवाह को परेशान करेगा ।
  10. एक GFP फ़िल्टर का उपयोग कर, डिवाइस के भीतर उचित प्रवाह गतिशीलता की पुष्टि करने से पहले 3-way वाल्व actuating द्वारा कीड़ा लदान और बफ़र्स के स्विचन देख ।
    1. उचित प्रवाह गतिशीलता का निर्धारण: प्रवाह नियंत्रण और बफर समाधानों में उपस्थित fluorescein का अवलोकन करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d -2E ) जब नियंत्रण दबाकर प्रवाह नियंत्रण मान परिवर्तित हो जाता है बटन वाल्व लिंक पर 3 तरह वाल्व को इसी (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ).
    2. माइक्रो प्रबंधक खोलने के बाद, पर क्लिक करें & #34; live & #34; डिवाइस की एक लाइव छवि का निरीक्षण करने के लिए । डिवाइस में बफ़र्स के प्रवाह का निरीक्षण करने के लिए फ्लोरोसेंट लाइट स्रोत चालू करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d -2E ).
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "figure 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg"/>
चित्रा 2: एक पुरुष microfluidic घ्राण चिप अनुकूलित । ( A ) डिवाइस के प्रवाह पैटर्न जब कीड़ा बफर के संपर्क में है । बफर (ख) भूरे रंग में दिखाया गया है, और प्रवाह नियंत्रण (एफसी) पीले रंग में दिखाया गया है, उत्तेजना (ओं) के साथ सफेद में । कीड़ा लोड हो रहा है बंदरगाह के लिए एक वक्र है, जो कृमि अभिविंयास के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है शामिल अनुकूलित किया गया है । ( बी ) उपकरण के प्रवाह पैटर्न जब कीड़ा उत्तेजना के संपर्क में है । बफर (ख) भूरे रंग में दिखाया गया है, और प्रवाह नियंत्रण (एफसी) पीले रंग में दिखाया गया है, उत्तेजना (ओं) के साथ सफेद में । ( सी ) गढ़े के रूप में अनुकूलित डिवाइस की माप । वर्म लोडिंग पोर्ट एक ४२ & #181 में समाप्त होता है; m ओपनिंग, विथ a ५० & #181; m चैनल पुरुष चौड़ाई के लिए डिज़ाइन किया गया. चैनलों की नापी ऊँचाई ३२ & #181; मीटर है, इसके बावजूद डिजाइन में 25 & #181; मी का लक्ष्य है । ( D-E ) एक फँसा नर व्यक्त p sra-6 :: GCaMP3. sra-6 प्रमोटर राख-विशिष्ट नहीं है, और कुछ अभिव्यक्ति एएसआई ंयूरॉन में मनाया जा सकता है, हालांकि कोई कैल्शियम यात्रियों एएसआइ में मनाया गया । छवि ( डी ) उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट रोशनी का एक संयोजन है, जबकि ( ई ) फ्लोरोसेंट ही है । स्केल पट्टियां निरूपित ४२ & #181; m. ( च ) ऐश न्यूरॉन को मजबूत तंत्रिका गतिविधि के साथ 1 मीटर ग्लिसरॉल उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करता है । नीले क्षेत्र 1 मीटर ग्लिसरॉल उत्तेजना के समय का अर्थ है । छायांकित क्षेत्र मानक त्रुटि, n = सात कीड़े से 20 दालों के साथ अर्थ है । लाल निशान ध्रुवीकरण प्रतिक्रियाओं निरूपित । Y-अक्षता शो & #916; f/f 0 . स्केल बार अर्थ 5 s. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 4. पशु वडा

< p class = "jove_content" > नोट: संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > 23 .

  1. इमेजिंग राख के जवाब 1 M ग्लिसरॉल.
    1. जगह लगभग 20 ग. एलिगेंस नर कि पी sra के लिए सकारात्मक है-6 :: एक GCaMP3 विकास मध्यम (निमेटोड) पर NGM सरणी अभिव्यक्ति आगर OP50 ई. कोलाई के एक लॉन के साथ वरीयता प्राप्त । सरणी-सकारात्मक जानवरों की पहचान के लिए फ्लोरोसेंट GECI और/या एक सह इंजेक्शन मार्कर की अभिव्यक्ति का प्रयोग करें ।
      नोट: सरणी सकारात्मक जानवरों GECI इस्तेमाल के अनुसार fluoresce जाएगा ( यानी, पशुओं GCaMP व्यक्त नीले प्रकाश उत्तेजना के तहत हरी fluoresce होगा, जबकि RCaMP जानवरों हरे प्रकाश उत्तेजना के तहत लाल fluoresce होगा) । सह इंजेक्शन मार्करों ऐसे GFP और आरएफपी के रूप में अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन से रेंज कर सकते हैं, phenotypic मार्करों के लिए, जैसे rol-6 , या एक प्रमुख phenotype बचाव कर सकते हैं, जैसे के ्ह् 1 उत्परिवर्तन < सुप वर्ग = "xref" > 28 .
      1. अगर तुरंत उठा परख से पहले, युवा वयस्क पुरुषों उठाओ । अगर दिन से पहले उठा परख, उठाओ L4 लार्वा नर.
  2. इमेजिंग द CEM responses to 1 & #181; मी ascr # 3.
    1. विध लगभग 20 L4 ग. एलिगेंस नर (fkEx98 [p pkd-2 :: GCaMP:: SL2::d sred + pBX-1]; के ्ह्-1 (e2123ts); उसे -5 (e1490); लाइट-1 (ce314)) कि dsRed सह इंजेक्शन मार्कर अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक हैं ।
      नोट: पुरुष कथा के रे न्यूरॉन्स के भीतर dsRed अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए आसान है और चार CEM न्यूरॉन्स के भीतर GCaMP अभिव्यक्ति की तुलना में पुष्टि.
    2. एक NGM आगार प्लेट पर hermaphrodites से इन पुरुषों को अलग करने के लिए इमेजिंग प्रयोग प्रदर्शन करने से पहले 5-14 एच के लिए OP50 ई. कोलाई के एक लॉन के साथ वरीयता प्राप्त ।
      नोट: नर अलग नहीं 5 ज की एक ंयूनतम के लिए व्यवहार नहीं करते ascr # 3 का जवाब है और इसलिए भी कम से ascaroside को कैल्शियम यात्रियों प्रदर्शन कर सकते है यहां मनाया ।
< p class = "jove_title" > 5. पशु लदान

< p class = "jove_content" > नोट: देखें refefence < सुप class = "xref" > 1 .

  1. मानक कीड़ा रखरखाव तकनीक का उपयोग कर एक बीज NGM आगर प्लेट पर एक कीड़ा उठाओ ।
    1. एक उठाओ ज्वलंत द्वारा कीड़े उठाओ (समतल प्लैटिनम तार से बना), लेने पर बैक्टीरिया उठा, और & #34;d abbing & #34; एक कीड़ा इसे लेने के लिए । धीरे से नई थाली पर कीड़ा जगह है, यह अपने आप को क्रॉल करने की अनुमति ।
  2. 1x S बेसल के लगभग 5 मिलीलीटर को अनसीड प्लेट में डालें, ऐसी उस प्लेट में पानी भर जाता है ।
  3. एक लोडिंग सिरिंज ( यानी, संलग्न ट्यूबिंग के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज) है कि पहले किया गया है 1x एस बेसल के साथ भरा हुआ है में कीड़ा आकर्षित ।
    1. के लिए केवल टयूबिंग में कीड़ा चूसना यकीन है, नहीं सभी तरह सिरिंज में ।
      नोट: अगर कीड़ा सिरिंज में यात्रा, यह असंभव के निकट है यह टयूबिंग में वापस पाने के लिए ।
  4. आउटलेट Luer वाल्व मोड़ द्वारा प्रवाह को रोकने के लिए वैक्यूम बंद करें ।
  5. निकालें ठोस पिन वर्म लोड कर रहा है पोर्ट ब्लॉक कर रहा है ।
  6. आउटलेट बंदरगाह से जुड़े Luer वाल्व बारी (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ) ताकि यह वेंट है ।
    नोट: पशु के स्थान और अभिविन्यास की पुष्टि करने के लिए वर्म लोड करते समय लाइव वीडियो फ़ीड का उपयोग करें (चरण 5.8-5.13).
  7. कीड़ा लदान बंदरगाह में कीड़ा लोड ट्यूब डालें ।
  8. धीरे से सिरिंज के लिए दबाव लागू जब तक कीड़ा लोडिंग चैनल में प्रकट होता है ।
  9. अगर कीड़ा चैनल टेल में प्रवेश करने लगता है-सबसे पहले, कीड़ा चैनल में प्रवेश करने से रोकने के लिए सिरिंज सवार पर खींचो.
  10. लागू करने और दबाव reversing जब तक सिर चैनल पहले में प्रवेश के बीच स्विच ।
  11. 3 तरह Luer वाल्व आउटलेट बंदरगाह से जुड़े मोड़ से वैक्यूम खोलने के लिए इसे खोलने के बजाय वातावरण के निर्वात ।
  12. मैंयुअल रूप से सिरिंज सवार निराशाजनक और कृमि सिर ऐसी है कि यह बफर फ्लो चैनल के संपर्क में है जगह से दबाव लागू होते हैं, लेकिन अब तक नहीं है कि सिर के आसपास आज़ादी से स्थानांतरित कर सकते है (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ D-2E ).
< p class = "jove_title" > 6. उत्तेजना और अधिग्रहण

  1. एक खुले स्रोत माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, जैसे माइक्रो प्रबंधक, रिकॉर्ड के रूप में छवियों पर कब्जा करने से एक झगड़ा ढेर के रूप में 10 फ़्रेम/s का उपयोग कर ब्लू-लाइट उत्तेजना (४७० एनएम) के लिए 30 s.
  2. १०० ms करने के लिए मुख्य मेनू पर एक्सपोजर सेट
    1. Open & #34; मल्टी डी Acq. & #34; सॉफ्टवेयर के मुख्य मेनू से । सेट द & #34; त संया & #34; को & #34; ३००, & #34; र द & #34; अंतराल & #34; को & #34; 0. & #34; Click & #34; मोल! & #34; वीडियो प्राप्त करने के लिए.
  3. लागू एक 10 एस की नब्ज की प्रेरणा 5 एस अधिग्रहण आरंभ करने के बाद । वांछित के रूप में उत्तेजना आवेदन की अवधि को समायोजित करें ।
    1. वीडियो के 5 एस प्राप्त करने के बाद, 3 तरह वाल्व प्रवाह नियंत्रण बफर को नियंत्रित करने के लिए पशु परीक्षण किया जा रहा उत्तेजना लागू बदल जाते हैं । वाल्व लिंक पर लेफ्ट-मोस्ट बटन पर क्लिक करें (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > फिगर 1b ).
    2. बाद उत्तेजना जोखिम के एस 10 (इस समय उपयोगकर्ता द्वारा वांछित के रूप में समायोजित किया जा सकता है), फिर से छोड़ दिया-वाल्व लिंक पर सबसे बटन दबाने से बफर के प्रवाह में परिवर्तन ।
  4. रिकॉर्ड केवल 30-s विंडो तक GECI प्रतिदीप्ति आधार रेखा पर वापस जाने के लिए अनुमति देने के लिए पूर्ण है जब तक बफ़र के अंतर्गत ।
  5. के रूप में वांछित दोहराना । अधिग्रहण की समाप्ति और अगले परीक्षण की दीक्षा के बीच 30 एस रुको ।
< p class = "jove_title" > 7. छवि विश्लेषण

  1. खोलें-स्रोत सॉफ़्टवेयर के साथ TIFF स्टैक खोलें, ImageJ, ImageJ विंडो में फ़ाइल को खींच कर ।
  2. क्लिक करें और कर्सर का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र (रॉय) ब्याज के ंयूरॉन के आसपास स्थापित करने के लिए खींचें । इस क्षेत्र सेट करने के लिए ब्याज के ंयूरॉन के सोमा शामिल (के रूप में < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए ).
  3. प्लाट पर क्लिक कर ओपन-& #62; Image-& #62; पोट-& #62; प्लॉट z-अक्ष प्रोफ़ाइल के प्रतिदीप्ति तीव्रता के z-स्टैक ।
  4. पर क्लिक करें & #34; सूची & #34; खुलने वाली विंडो में । संपादन पर क्लिक करें-& #62; मान की प्रतिलिपि बनाने के लिए प्रतिलिपि बनाएँ. मानों को चिपकाएं एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में.
  5. प्रत्येक पल्स के लिए रॉय GCaMP अभिव्यक्ति शामिल नहीं है जो वर्म के किसी क्षेत्र में खींचकर के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करें ।
  6. ंयूरॉन प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्य घटाकर प्रत्येक पल्स के लिए पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन ।
  7. गणना & #916; च/f 0 प्रत्येक पल्स के प्रत्येक फ्रेम के लिए.
    1. की गणना F 0 अधिग्रहण के पहले 1 s के लिए रॉय की औसत तीव्रता मूल्य के रूप में ( उदा, फ्रेंस 1-10).
    2. गणना & #916; f/f 0 को परिकलित f 0 मान द्वारा ब्याज की फ़्रेम के लिए पृष्ठभूमि-घटाया गया मान विभाजित करके.
  8. दोहराने के लिए हर और imaged ंयूरॉन हर उत्तेजना पल्स ।
  9. के लिए न्यूरॉन्स के साथ लगातार प्रतिक्रिया प्रोफाइल, जैसे ऐश, औसत सभी दालों के लिए प्रत्येक ंयूरॉन और की गणना SEM (के रूप में < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2F ).
  10. प्लाट औसत & #916; च/f 0 SEM के साथ समय के लिए प्रत्येक के लिए ंयूरॉन.
    नोट: इस उदाहरण में, यह आम अभ्यास के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक परीक्षण के व्यक्तिगत ंयूरॉंस प्रतिक्रियाओं के heatmaps शामिल है । न्यूरॉन्स कि दोहराया उत्तेजना भर में उत्तेजनाओं के लिए जोखिम पर कैल्शियम यात्रियों में सुसंगत परिवर्तन प्रदर्शित नहीं करते हैं, या विभिन्न व्यक्तियों में < सुप वर्ग = "xref" > 23 , यह व्यक्तिगत पल्स निशान दिखाने के लिए अधिक लागू हो सकता है (के रूप में < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ ). चर्चा डेटा प्रदर्शित करने के लिए कैसे निर्धारित करने पर विवरण के लिए देखें ।

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Representative Results

समग्र डिवाइस सेटअप का एक उदाहरण चित्रा 1a-Bमें देखा जा सकता है । चित्र 1a उचित जलाशय निर्माण और सेटअप को दर्शाया गया है । चित्रा 1b microfluidic डिवाइस के लिए जलाशयों के कनेक्शन से पता चलता है । चित्रा 1C स्पष्टता के लिए लेबल व्यक्तिगत बंदरगाहों के साथ एक microfluidic डिवाइस को दर्शाया गया है ।

पुरुष-रूपांतरित microfluidic डिवाइस के डिजाइन में लोडिंग पोर्ट में वक्र होता है, लेकिन फ्लो डायनामिक्स Chronis एट अल.19(फिगर 2a-2c) द्वारा डिज़ाइन किए गए डिवाइस के समान होती है । बफ़र्स के प्रवाह में परिवर्तन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है जो प्रवाह नियंत्रण वाल्व खुला है (चित्र 2a-बी) । गढ़े के रूप में डिवाइस की माप डिजाइन फ़ाइल से बदलती हैं । चित्रा 2c में प्रदान की माप "के रूप में गढ़े माप" कर रहे हैं ।

पुरुष-अनुकूलित घ्राण डिवाइस में पुरुष सी. एलिगेंस लोड होने के बाद, उनके स्थान और अभिविन्यास, साथ ही चैनल प्रवाह गतिशीलता, दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्रा 2d-2E) के माध्यम से सत्यापित किया जा सकता है. कीड़े के जोखिम nociceptive ंयूरॉन, राख में GCaMP3 व्यक्त करने के लिए, राख ंयूरॉन के भीतर प्रतिदीप्ति में दिखाई परिवर्तन में 1 मीटर ग्लिसरॉल परिणाम, तंत्रिका गतिविधि का संकेत (चित्रा 2F) । प्रतिदीप्ति में सूक्ष्म परिवर्तन आँख द्वारा दिखाई नहीं हो सकता है, लेकिन सॉफ्टवेयर इन परिवर्तनों को यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । नि: शुल्क ImageJ सॉफ्टवेयर का विश्लेषण करने के लिए और समय पर 1 मीटर ग्लिसरॉल के लिए जोखिम पर राख ंयूरॉंस की फ्लोरोसेंट तीव्रता मात्रा (चित्रा 2F) का इस्तेमाल किया जा सकता है । यह क्या hermaphrodites में मनाया जाता है के समान है27 और, ग्लिसरॉल के लिए राख ंयूरॉन प्रतिक्रिया की मजबूती के कारण, यह सभी परीक्षण जानवरों में मनाया जाता है ।

अक्षीय या रोटेशन आंदोलन की एक छोटी राशि unलकवाग्रस्त पशुओं में की उंमीद है, अक्सर महसूस एक ंयूरॉन ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म वीडियो विश्लेषण के दौरान (चित्र 3ए) । बफ़र्स में एक लकवाग्रस्त के अलावा (उदा, 1 mM tetramisole) लगभग इस प्रभाव को समाप्त, हालांकि कुछ जानवरों (~ 10%) अभी भी परीक्षणों के दौरान चलते हैं । इस से दरकिनार किया जा सकता है: (क) पुराने पुरुषों का उपयोग कर, जो अधिक कुशलता से फंस रहे हैं; (ख) आगे भी वर्म लोडिंग पोर्ट की चौड़ाई या मोटाई घटाना; या (ग) या तो उपयोग लकवाग्रस्त की एकाग्रता में वृद्धि या एक और लकवाग्रस्त का उपयोग कर । यह भी सुनिश्चित करना होगा कि वहां बहुत अधिक नहीं है सिर के अंत पिछले जाल और गंध चैनल से अवगत कराया । कीड़ा आंदोलन के साथ एक परीक्षण होता है, तो विश्लेषण के क्षेत्र में ले जाया जा सकता है और नए ंयूरॉन स्थान से फिर से पढ़ना, फ्रेम जो बाद में आंदोलन होता है (चित्र बी) । उपयोगकर्ता द्वारा तंत्रिका निशान के मैनुअल पुनर्निर्माण इस उदाहरण में आवश्यक है । लिपियों कि न्यूरॉन के भीतर फ्लोरोसेंट परिवर्तन का विश्लेषण और है कि ंयूरॉन के केंद्र का पालन के रूप में यह भी19लिखा जा सकता है चाल ।

पुरुष ग. एलिगेंस भावना आकर्षक biogenic pheromones चार सेक्स विशिष्ट CEM न्यूरॉन्स के माध्यम से ascarosides बुलाया23. जब कैल्शियम यात्रियों पुरुषों में मनाया जाता है, प्रतिक्रियाओं आकार में चर रहे हैं, हस्ताक्षर, और दोनों न्यूरॉन्स और जानवरों के बीच परिमाण (चित्र 4a-बी). हालांकि, pheromones के लिए पुरुष प्रतिक्रिया के रूप में मज़बूती से कई जानवरों (चित्र 4c) में कैल्शियम यात्रियों के रूप में मनाया नहीं है । यह हतोत्साहित नहीं है, के रूप में सबसे ascarosides सनसनी13,14,15पर कैल्शियम यात्रियों को नहीं लाना है ।

Figure 3
चित्रा 3: छवि अधिग्रहण अवधि के दौरान कीड़ा आंदोलन को संबोधित । (A) ΔF/एफ0 (अधिग्रहण के पहले 1 के लिए औसत पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट तीव्रता से विभाजित फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन) एक क्षेत्र है जहां ब्याज की ंयूरॉन मज़बूती से 1 एस के लिए स्थिर था परिभाषित द्वारा ImageJ का उपयोग की गणना की गई थी । उत्तेजना पल्स (नीले क्षेत्र) के दौरान, पशु चले गए, के रूप में कैल्शियम का पता लगाने के ऊपर छवियों में देखा, ंयूरॉन में जिसके परिणामस्वरूप अब विश्लेषण क्षेत्र (पीला बॉक्स) के भीतर समाहित किया जा रहा है । स्केल पट्टियां निरूपित ४२ µm । डैश्ड रेखाएं प्रत्येक छवि में वर्म के स्थान के संगत ट्रेस का क्षेत्र दिखाती हैं । (ख) यदि विश्लेषण के क्षेत्र में परीक्षण के दौरान ंयूरॉन का पालन करने के लिए ले जाया गया है और व्यक्तिगत अंश वास्तविक तंत्रिका गतिशीलता व्यक्त करने के लिए पुनर्निर्माण कर रहे हैं, ट्रेस के रूप में अगर जानवर कदम नहीं था प्रकट होता है । डैश्ड रेखाएँ वर्म आंदोलन के लिए ठीक किया गया था जो ट्रेस का क्षेत्र दिखाएँ । दोनों राख ंयूरॉंस के लिए निशान, बाएं और दाएं (ASHL (लाल) और एषृ (नीला), क्रमशः) दिखाया जाता है । Y-अक्षों को ΔF/ स्केल बार नोट 5 s. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नर C. एलिगेंस CEM प्रतिक्रिया to 1 माइक्रोन ascr # 3 चर है । पुरुष विशिष्ट CEM न्यूरॉन्स biogenic pheromones के लिए प्रतिक्रिया के अद्वितीय पैटर्न प्रदर्शित करते हैं. (क) प्रतिक्रियाओं एक प्रतिक्रियाशील पशु में एक पल्स के लिए प्रत्येक CEM ंयूरॉन में मनाया दिखाया जाता है । वहां चार CEM ंयूरॉंस: पृष्ठीय सही (CEM डॉ), पृष्ठीय बाएं (CEM डीएल), ventral सही (CEM VR), और ventral (CEM वीएल) छोड़ दिया है । चार न्यूरॉन्स के तीन अलग आकार और परिमाण के ध्रुवीकरण के साथ जवाब, ascaroside के लिए जवाब नहीं चौथे के साथ. (ख) लगभग एक तिहाई फंसे जानवरों की (2/7 इस अध्ययन में परीक्षण) परिणाम केवल तीन ंयूरॉंस में सक्षम छवि है । इस अभिविंयास में एक कीड़ा की प्रतिक्रियाएं CEM कैल्शियम यात्रियों कि पहले कीड़ा में मनाया उन से अलग थे के परिणामस्वरूप । इस कृमि के उन्मुखीकरण में परिवर्तन के कारण नहीं था, के रूप में CEM डॉ दोनों झुकाव में दिखाई दे रहा है और जानवरों के बीच चर प्रतिक्रिया दर्शाती है. (ग) कई कीड़े किसी भी detectable कैल्शियम यात्रियों के साथ जवाब नहीं है (इस अध्ययन में परीक्षण 5/7) । दिखाया व्यक्तिगत अंश भूखंडों के ऊपर छवियों में दिखाया गया है एकल जानवरों के प्रतिनिधि हैं. कोस्केल पट्टियां निरूपित ४२ µm. अंश: नीले क्षेत्र 1 माइक्रोन ascr # 3 जोखिम के समय का अर्थ है । लाल निशान ध्रुवीकरण प्रतिक्रिया निरूपित । काले निशान नहीं देखा प्रतिक्रिया निरूपित । Y-अक्षों को ΔF/ स्केल बार नोट 5 s. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पुरुष अनुकूलित घ्राण चिप एक संकरा लोडिंग बंदरगाह है, जो अभिविंयास के अधिक नियंत्रण के लिए और पुरुष सी. एलिगेंसके कुशल फँसाने के लिए अनुमति देता है में एक मोड़ शामिल हैं । यह दोनों के बाईं और सही सदस्यों के दृश्य के लिए अनुमति देता है ंयूरॉन द्विपक्षीय जोड़े, जेड के लिए की आवश्यकता के बिना stacking । इस वक्र एक अभिविंयास की ओर जाता है दूर ऊर्ध्वाधर १००% से कीड़े में समय जहां केवल एक द्विपक्षीय जोड़ी ऐसी राख (चित्रा 2d-E)29,30के रूप में एक फ्लोरोसेंट मार्कर, के साथ लक्षित है । हालांकि, इस तरह के CEM के रूप में चार रेडियल सममित न्यूरॉन्स, के साथ ंयूरॉन वर्गों में, सभी चार न्यूरॉन्स केवल एक-तिहाई समय दिखाई दे रहे हैं. कीड़े का एक और तीसरा परीक्षण चार ंयूरॉंस दिखाई के केवल तीन है, और शेष तीसरे के लिए, केवल अलग अंतर पृष्ठीय और ventral कोशिका निकायों के बीच है, नहीं छोड़ दिया सही विषमता (डेटा नहीं दिखाया) । संकरा पोर्ट z-अक्ष भर में कृमि अस्थिरता को रोकने के लिए एक कम चैनल ऊंचाई के साथ संयुक्त है । इस डिजाइन भविष्य के अध्ययन में पुरुषों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जो, जब पुरुष connectome25,31की लगातार बढ़ती ज्ञान के साथ संयुक्त, सेक्स की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देगा विशिष्ट तंत्रिका समारोह ।

इस प्रोटोकॉल में किया गया विश्लेषण ब्याज के ंयूरॉन में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को मापने के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग करता है । वर्तमान डिजाइन के साथ, बफर में 1 मिमी tetramisole प्रभावी ढंग से कीड़े पंगु बना दिया और ंयूरॉंस के आंदोलन को रोकता है imaged जा रहा है । यदि आंदोलन रोके नहीं है, या यदि उपयोगकर्ता के लिए एक लकवाग्रस्त के उपयोग से बचना चाहता है, और अधिक जटिल ट्रैकिंग लिपियों लिखा जाना चाहिए कि ट्रैक ंयूरॉंस के रूप में वे7ले जाएं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, पुरुष कीड़े ही कदम है जब वे भी प्रभावी रूप से लोड हो रहा है बंदरगाह से विवश हो छोटे थे और जब एक अत्यंत aversive उत्तेजना, जैसे ग्लिसरॉल के साथ प्रस्तुत किया । यहां तक कि इन उदाहरणों में, आंदोलन संक्षिप्त है और ट्रैकिंग समायोजन की बड़ी मात्रा की आवश्यकता नहीं है-नया ंयूरॉन स्थान के आसपास एक रॉय की स्थापना गलत फ्लोरोसेंट readouts (चित्रा 2) को दूर ।

एकल कीड़ा, जाल आधारित इमेजिंग की एक सीमा है कि केवल एक कीड़ा एक समय में imaged किया जा सकता है1। इन जाल की एक और सीमा है कि कीड़े डिवाइस के भीतर अटक कर सकते हैं, उपकरणों के कारण भरा जा करने के लिए और "प्रयुक्त" इमेजिंग के बाद ही कुछ कीड़े । हालांकि, एक मास्टर मोल्ड से नए उपकरणों के निर्माण के लिए त्वरित बदलाव समय इस नकारात्मक पक्ष को दूर । विस्तारित नीले प्रकाश रोशनी भी सी. एलिगेंस३२,३३में धूप प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । इस प्रोटोकॉल (30 एस) के अपेक्षाकृत कम प्रयोगात्मक समय सीमा मापने योग्य photobleaching के बिना इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । हालांकि, अब प्रयोगों में photobleaching और धूप से बचने के लिए, प्रकाश स्रोत को7स्पंदित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रत्येक १००-ms जोखिम के दौरान, प्रकाश 10 ms के लिए स्पंदित किया जा सकता है । यह समय7पर वृद्धि हुई शरीर autofluorescence को समाप्त करने के लिए दिखाया गया है ।

आदेश में ठीक से ascarosides को अपनी प्रतिक्रियाओं के लिए पुरुषों का परीक्षण करने के लिए, लार्वा-चरण 4 (L4) पुरुषों पहले hermaphrodites से अलग किया जाना चाहिए, कम से 5 घंटे के लिए, के लिए एक पास-भोली प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए pheromones23। इस समय की लंबाई से कम के लिए अलगाव जानवरों ascarosides का जवाब विफल करने के लिए कारण हो सकता है । हालांकि, गैर-ascaroside cues, जैसे ग्लिसरॉल परीक्षण करते समय यह आइसोलेशन आवश्यक नहीं है । निरंतरता के लिए, तथापि, पशुओं को हमेशा कम से अलग कर रहे थे 5 कैल्शियम इमेजिंग से पहले एच । कुछ ंयूरॉंस में, ऐसे CEM के रूप में, नहीं हर उत्तेजना एक न्यूरॉन की प्रतिक्रिया में लाना होगा, और प्रत्येक CEM है कि प्रतिक्रिया करता है तो एक निश्चित तंत्रिका प्रतिनिधित्व के "कोड" उत्पंन करता है । CEM में इस घटना को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के माध्यम से मनाया गया है, साथ ही साथ कैल्शियम इमेजिंग अध्ययनों से यहां वर्णित की तरह23। इस प्रकार, हर ascaroside में CEM न्यूरॉन्स में औसत दर्जे का कैल्शियम यात्रियों-उजागर पशु की गारंटी नहीं कर रहे हैं23. वास्तव में, तिथि करने के लिए जांच की ascarosides के कई मध्यम श्रेणी का कैल्शियम यात्रियों13,15,३४,३५में नहीं लाना । औसत दर्जे का यात्रियों के सफल संचित्रीकरण पांच ascaroside ब्याज की (चित्रा 3) के संपर्क में पशुओं में से दो में फेरोमोन के तीन दालों में से केवल एक के दौरान मनाया गया था । यह सफलता की दर से मेल खाता है पहले अंय लैब्स23में मनाया । यह परिवर्तनशीलता एक सीमा है जब फेरोमोन प्रतिक्रिया का अध्ययन है और इस प्रोटोकॉल के पुरुष आधारित ध्यान के कारण नहीं है ।

जब ascarosides के जवाब में लिया कैल्शियम यात्रियों की जांच, एक आगे की जांच के बिना सुसंगत प्रतिक्रिया की कमी को खारिज नहीं करना चाहिए । यह एक ंयूरॉंस वर्ग के भीतर चर प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन जैसे प्रयोगों के माध्यम से परीक्षण किया जा सकता है । न्यूरॉन्स के लिए, ऐसे ऐश के रूप में, कि मज़बूती से जवाब, सुसंगत प्रतिक्रिया की कमी ऐसी उत्तेजना नियंत्रण में त्रुटियों के रूप में बड़ा प्रयोगात्मक समस्याओं का संकेत हो सकता है । प्रतिक्रियाओं की पीक तीव्रता की भी जांच की जा सकती है यदि परिवर्तनशीलता की प्रतिक्रिया में अपेक्षित है. अंश को मानक विचलन या मानक त्रुटि के साथ प्लॉट किया जा सकता है ( चित्र 2Fके रूप में) । यदि मानक विचलन छोटा है, तो इस रूप में अंश प्लॉट किए जा सकते है और उनका विश्लेषण किया जा सकता है । यदि उदारवादी मानक विचलन के लिए अग्रणी भिंनता की ध्यान देने योग्य राशि है, तो डेटा उसी के साथ, प्रतिक्रिया द्वारा क्रमबद्ध heatmaps के साथ "प्रकार" प्रतिक्रिया द्वारा प्रतिक्रिया भिन्नता दिखाने के लिए प्लॉट किया जा सकता है । अगर वहां महत्वपूर्ण भिंनता है (चित्रा 3), जिसमें चोटियों एक गाऊसी तरीके से वितरित नहीं किया जा सकता है, प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया में वर्गीकृत किया जा सकता है "प्रकार" (जैसे, ध्रुवीकरण, hyperpolarizing, या गैर ध्रुवीकरण)23। जवाब है कि एक निश्चित प्रकार "में गिर" और साजिश रची जा सकता है एक साथ विश्लेषण किया । इसी तरह heatmaps को भी इस विश्लेषण में साथ देना चाहिए ।

आगे बढ़ते हुए, इस डिवाइस को आगे भी लोडिंग पोर्ट को संकरा करके लार्वा-टेज सूत्रकृमि के इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा लदान बंदरगाह के अंत के संकुचन पशु की बाधा के लिए अनुमति देने के लिए बस संवेदी ंयूरॉंस की cilia के इमेजिंग के लिए अनुमति देगा, के रूप में सेल शरीर के खिलाफ । जबकि अंय उपकरणों और अधिक सामांयतः अध्ययन द्विलिंग के लिए डिजाइन किए हैं, यह अनुकूलित घ्राण चिप पुरुष तंत्रिका सर्किट में तंत्रिका गतिविधि के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । पुरुष के connectome के रूप में अभी भी आविर्भाव किया जा रहा है, सेक्स विशेष नेटवर्क में तंत्रिका गतिशीलता को मापने के लिए सक्षम होने के लिए पूरी तरह से न्यूरॉन सिग्नलिंग को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. उभयलिंगी और पुरुष प्रतिक्रियाओं के बीच मतभेद अब परीक्षण किया जा सकता है और इस उपकरण का उपयोग कर मापा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम हमें प्रारंभिक डिजाइन फ़ाइल है कि पुरुषों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था के साथ उपलब्ध कराने के लिए मैनुअल Zimmer शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; संश्लेषण और ascr # 3 की आपूर्ति के लिए फ्रैंक श्रोएडर; अंतर्दृष्टि और इमेजिंग और विश्लेषण के साथ सहायता के लिए रॉस लागो; और गुरु निर्माण के लिए लौरा Aurilio और जो, क्रिस्टोफर ढलान के साथ, इस पांडुलिपि की समीक्षा करने के लिए योगदान दिया । इस काम के लिए फंडिंग नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट 1R01DC016058-01 (जे), नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट CBET १६०५६७९ (D.R.A.), और साइंटिफिक इंटरफेस (बरोज) में D.R.A. वेलकम करियर अवार्ड के तहत प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Wafer University Wafer 452
SU-8 2035 MicroChem Y111070-0500L1GL
Developer MicroChem Y020100-4000L1PE
Wafer Mask Cad/Art Services - Custom order. Printed at 25,000 dpi.
Sylgard-184 Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm Dermal Punches Acuderm Inc. P150
Soft Tubing Cole-Palmer EW-06419-01
Hard Tubing IDEX Health & Science 1622
Pins New England Small Tube NE-1027-12
Blocking Pins New England Small Tube 0.415/0.425" OD x .500 Long Batch PB07027
3 mL syringes BD 309657
30 mL syringes Vitality Medical 302832 Used as buffer reservoirs.
Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer Component Supply Company NE-231PL-50
Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile Cole-Palmer EW-30600-07
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5M
Mercator Control System LF-5 Plasma System Mercator LF-5
Scotch Tape Scotch BSN43575
Series 20 Chamber Warner Instruments P-2
Vacuum Desicator Bel-Art Scienceware 420250000 24 cm inner diameter.
Weigh Boats Cole-Palmer EW-01017-27
Classic Plus Balance Mettler Toledo PB1501-S/FACT
Glass Pasteur Pipettes Cole-Palmer EW-25554-06
Transfer pipettes Genesee Scientific 30-202
Oven Sheldon Manufacturing Inc 9120993 Model Number: 1500E.
60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes TriTech Research T3308
Zeiss Axio Observer.A1 Zeiss -
Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS Hammamatsu C11440-22CU
Blue Fluorescent Light Lumencor SOLA SM6-LCR-SA 24-30V/7.9A DC.
Illumination Adaptor Zeiss 423302-0000
Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve Parker 001-0017-900 3-way valve for controlling flow.
ValveLink8.2® AutoMate Scientific 01-18 Flow Switch Controller
Micro Manager Micro-Manager - Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ ImageJ - Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological Grade Apex 9012-36-6
Peptone Apex 20-260
CaCl2 VWR BDH0224-1KG
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-1kg
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Ethanol Sigma-Aldrich 270741-4L
Tetramisole Sigma-Aldrich L9756-10(G) Store at 4 °C.
Fluorescein Sigma-Aldrich FD2000S-250mg Light Sensitive. Store in photoprotective vials.
Glycerol Sigma-Aldrich G6279-1L
Ascaroside #3 - - Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).
NaCl Genesee Scientific 18-215
KH2PO4 BDH BDH9268.25
K2HPO4 J.T. Baker 3252-025
ASH GCaMP3 line - - CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.
CEM GCaMP6 line - - JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center OP50
"Reservoir" - - To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२७ Microfluidics कैल्शियम इमेजिंग GCaMP सी. एलिगेंस नर CEM ंयूरॉन ascaroside
पुरुष <em>C. एलिगेंस </em>सिर ंयूरॉंस में Pheromones के जवाब में ंयूरॉन गतिविधि के इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित Microfluidic घ्राण चिप का प्रयोग
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Reilly, D. K., Lawler, D. E.,… More

Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons. J. Vis. Exp. (127), e56026, doi:10.3791/56026 (2017).

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