Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bruke en tilpasset Microfluidic Olfactory Chip for avbilding av Neuronal aktivitet svar feromoner i mannlige C. Elegans hodet nerveceller

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/56026

Summary

Bruk av en tilpasset "olfactory chip" for effektiv kalsium avbilding av C. elegans menn er beskrevet her. Studier av mannlige eksponering til glyserol og en feromon vises også.

Abstract

Bruk av kalsium indikatorer har kraftig forbedret vår forståelse av nevrale dynamikk og regulering. Rundormer Caenorhabditis elegans, helt tilordnet nervesystemet og gjennomsiktig anatomi, presenterer en ideell modell for å forstå sanntid nevrale dynamics bruke kalsium indikatorer. I kombinasjon med microfluidic teknologi og eksperimentell design, er kalsium-imaging studier med disse indikatorene utført i både fritt bevegelige og fanget dyrene. Men har de fleste tidligere studier utnytte fangst enheter, for eksempel olfactory chip beskrevet i Chronis et al., enheter designet for bruk i den vanligste Hermafroditt, mindre vanlig hannen er begge morphologically og strukturelt ulike. En tilpasset olfactory chip ble designet og laget for økt effektivitet på mannlige neuronal bildebehandling med bruke ung voksen dyr. En sving ble innlemmet i ormen lasting port rotere dyrene og tillate for separasjon av individuelle neurons med et bilateralt par i 2D bildebehandling. Ormer er utsatt for en kontrollert flyt av odorant i microfluidic enheten, som beskrevet i tidligere Hermafroditt studier. Kalsium transienter analyseres deretter ved hjelp av åpen kildekode programvare ImageJ. Fremgangsmåten som er beskrevet her bør tillate økt mengde hann-baserte C. elegans kalsium imaging studier, utdype vår forståelse av mekanismer for sex-spesifikke neuronal signalering.

Introduction

Microfluidic enheter gir økt tilgang til nettopp kontrollerte miljøer, der dyr, som Rundormer C. elegans, kan være eksperimentelt manipulert1. Disse studiene inkluderer atferdsmessige analyser, kalsium tenkelig studier eller selv visninger for bestemte fenotyper, noe som resulterer i mer nøyaktige målinger av eksperimentelle resultater1,2,3,4, 5,6. MicroFluidics gir småskala flytende forhold som detaljert eksperimenter kan kjøres mens benytte minimale mengder reagenser. Det er en konstant produksjon av nye microfluidic enheten design, og bruk av hver varierer fra arenaer som tillater naturlig sinusformet bevegelse C. elegans i atferdsdata analyser og nevrale tenkelig studier, å fange enheter i nevrale bildebehandling og olfactory studier, til enheter som tillater for høy gjennomstrømming fenotypiske analyse i genetisk skjermer4,5,6,7. Etter fabrikasjon av en master mold, microfluidic enheter er billig å konstruere-gitt gjenbruk av master- og enkel å bruke, slik at for rask data generasjon via høy gjennomstrømming studier. Fabrikasjon av enheter ved hjelp av polymerer som polydimethylsiloxane (PDMS) tillater opprettelsen av nye enheter innen timer.

Kalsium tenkelig studier bruker genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) i målcellene for å måle nevrale dynamikken i disse cellene i sanntid8,9,10,11. Gjennomsiktig natur C. elegans tillater innspillingen av fluorescerende nivåene av disse proteinene i levende dyr. Tradisjonelt GECIs stole på grønne fluorescerende protein (GFP)-basert sensoren GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), selv om nyere studier har tilpasset disse sensorer for bedre signal-til-støy-forhold og rød-skiftet eksitasjon profiler. Etter utviklingen av GCaMP3, proteiner med disse spesifikasjonene har variert, inkludert sensorer som GCaMP6s og GCaMP6f (langsom og rask fluorescens av-priser, henholdsvis), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (RCaMP), som har en rød-skiftet aktivisering profil. Kombinasjonen av disse GECIs med C. elegans celle-spesifikke genet promoter sekvenser kan målrette celler av interesse, spesielt sensoriske neurons12,13,14,15 , 16.

Mens brukervennligheten C. elegans i microfluidic studier er tydelig, har nesten alle studier fokusert på hermafroditter. Til tross for menn bare regnskap for 0,01-0,02% av befolkningen vill type, uvurderlig funn kan oppstå fra deres karakteristikk. Mens den fysiske connectome i Hermafroditt nervesystemet er fullt tilordnet for tiår17, fortsatt den mannlige connectome ufullstendig, spesielt i regionen hodet i dyr18. Bruk av kalsium imaging hos menn vil hjelpe generere en forståelse av mannlige nervesystemet og forskjeller som oppstår mellom to kjønnene. Mindre størrelsen på C. elegans voksne hanner forhindrer effektiv og pålitelig overlapping i lasting portene på tradisjonelle olfactory enheter designet for større hermafroditter. For å løse dette, en modifisert versjon av Chronis Olfactory Chip19 ble utviklet med en smalere lasting port, en lavere kanal høyde, og viser i ormen lasting port (som roterer dyret), slik at effekten av bilaterale venstre/høyre neuronal parene. Dette tillater: (1) effektiv overlapping av unge voksne hanner, (2) en sikrere orientering av dyret for visualisering av både medlemmer av bilaterale sammenkoblede neurons, og (3) nøyaktig bildebehandling nevrale aktivitet i mannlige neurons.

Stadig, viser studier at C. elegans menn reagere annerledes enn hermafroditter til en rekke ascarosides (ascr) eller Rundormer feromoner20,21,22,23 ,24. Derfor blitt utvikle en forståelse av nevrale dynamikk og representasjoner i den mannlige connectome enda mer relevant. Mannlige C. elegans inneholder 87 sex-spesifikke neurons finnes ikke i Hermafroditt25,26, endre connectome i som-ennå ubestemt måter. Å kunne bilde disse unike nevrale dynamikken vil tillate oss å bedre forstå sex-spesifikke tiltak og nevrale representasjoner.

Denne protokollen beskriver bruken av en mann-tilpasset olfactory chip for neural avbilding av mannlige C. elegans chemosensation. Nociceptive Nevron aske svarer pålitelig 1 M glyserol inne hanndyr, konsekvent med forrige hermafroditter studier27. Eksponering for ascarosides kan framprovosere reaksjoner som er variabel fra dyr til dyr, krever et større antall dyr skal testes. Responsen av mann-spesifikke CEM neurons har tidligere vist, gjennom både electrophysiology og kalsium imaging studier, svare ulik ascaroside #323.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enheten fabrikasjon

Merk: se referanse 1.

Merk: Silicon master formene ble laget ved hjelp av photolithographic for mønstre SU-8 photoresist på en silicon master 1 , 7. Photomasks for kjeks mønstre ble trykt på 25.000 dpi. De mannlige-tilpasset enhetsfunksjoner en Chronis Olfactory Chip design 19 med en endring i ormen lasting port, tilpasse en design fra M. Zimmer (personlig korrespondanse, 2016). En tur er inkludert for å kontrollere rotasjon av dyrene. Bredden av lasting port kanal er smalere til 50 μm. Alle kanaler er 32 μm høye. Når en silicon master mold er tilgjengelig for brukeren, brukeren kan følge den påfølgende protokollen, som beskrevet tidligere 1.

  1. Blanding PDMS base og herding agent i 10:1 forholdet vekt.
  2. Bland godt med overføring pipetter.
  3. Degas blandingen i et vakuum desiccator 1t, før alle synlige bobler er fjernet.
  4. Hell blandingen på en silicon formen mester i en 150 mm diameter rett til det er 5 mm tykk (100 g). Bruke en Pasteur pipette for å fjerne bobler eller støv som har blitt introdusert for blandingen.
  5. Stek ved 65 ° C i minst 3 timer eller over natten.
  6. Kutte PDMS unna mugg ved hjelp av en skalpell og kutte de separate enhetene fra hverandre med et barberblad.
  7. Hull innløp og utløp med 1 mm dermal punch.
  8. Rødme hullene med dH 2 O, etanol, og igjen med dH 2 O å fjerne partikler fra slag. Tørr enheten i en luft strøm puls.
  9. Både kanal sider og oversiden av enheten med teip, fjerne alle støv eller rester igjen på enheten å tillate for vellykket binding.
  10. Plasma-bond enheten, kanal-side ned til et nr. 1 dekke glass.
    1. Utsett cover glass og enheten (kanal side opp) til luft plasma betingelser som tillater riktig binding, for eksempel 100 W for 30 s eller 24 M 60 s.
      Merk: Innstillingene kan justeres for å effektivisere bånd. Plasma-binding forholdene er ikke like avgjørende som skikkelig rengjøring ved forsøk på å effektivisere bånd. En tilstrekkelig rengjort enhet vil ikke bindingen, selv under perfekte plasma forhold.
    2. Inverter dekket glasset ved kanalen siden av enheten og trykk ned med tommelen for 5 s.

2. Bufre forberedelse

  1. Dilute 1 x S Basal (100 mM NaCl og 0,05 M KPO 4, pH 6.0) fra et sterilt 10 x lager.
  2. Fortynne 1 M tetramisole aksjer til en siste konsentrasjon av 1 mM 1 x S Basal for alle buffer løsninger.
  3. Legge fluorescein til både det " flytkontroll " og " buffer " reservoarer.
    1. Opprette en 100-mg/mL lager av fluorescein i 1 x S Basal.
    2. Fortynne sluttvederlag til siste konsentrasjoner av 1 µg/mL i flytkontrollen og 0,1 µg/mL i bufferen.
  4. Opprette stimuli.
    1. Fortynne glycerol å en final konsentrasjon av 1 M 1 X S Basal.
    2. Fortynnet ascaroside #3 (ascr #3) til en siste konsentrasjon på 1 µM til 1 X S Basal.

3. Enhetsinnstillinger

Merk: se 1.

Figure 1
figur 1. Microfluidic enhetsinnstillinger. (A) reservoarer og rør. En 30 mL sprøyte uten en stempelholderen fungerer som den " reservoaret. " dette er knyttet til en Luer ventil med tre alternativer for tekstflyt. En stikkontakt er koblet til en 3 mL sprøyte med en plunger, mens den andre er koblet til en nål (oransje) som settes inn i slangen som kobles til den microfluidic enheten. (B) totalt oppsettet av microfluidic imaging eksperiment. Enheten plasseres på et stadium i en omvendt epifluorescence mikroskop, over målet linser. Den " flytkontroll " buffer reiser gjennom en 3-veis ventil som er kontrollert av en enhet på sokkelen over oppsettet. Linjer som inneholder buffere deretter inn riktige enheten portene. (C) av portene på microfluidic enheten. Den " flytkontroll " porter flanke andre innløp portene: den " stimulans " og " buffer " porter. Den " utløp " porten er den høyre-porten. På grunn av plasseringen av ormen lasting arena, den " orm lasting " port er sentral-mest porten på enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Forberede tre flytende reservoarer ved å feste en 30 eller 60 mL sprøyte til 3-veis Luer ventil, med 3 mL sprøyte og sprøytespiss knyttet til Luer ventilen også (som i figur 1A). Koble nålen til rør som strekker seg til den microfluidic enheten (som i figur 1A -B).
  2. Fjerne luftboblene fra reservoaret og rør.
  3. Fylle 3 mL sprøyte med vedlagte rør med 1 x S Basal og sett det inn i stikkontakten havn
  4. Forsiktig gjelder trykket sprøyten til bufferen vises på toppen av innløp hull.
  5. Koble til flytkontroll, buffer og stimulans rør til riktig innløp hull (som i figur 1B -C), sikrer at væske synker finnes på både lasting port hull og buffer slangen skal knyttes.
  6. Igjen, forsiktig bruke press på sprøyten som er koblet til uttaket porten til dråper vises i ormen lasting port innløpet.
  7. Sette inn en solid blokkerer pin til ormen lasting porten.
  8. Fjern sprøyten fra stikkontakten-porten og fest utløp linjen koblet til huset vakuum (-670 Torr).
  9. Kontrollere enheten for bobler i flyten kanaler, visuelt og gjennom video bekreftelse via en programvare forenlig med kameraet brukes, for eksempel det åpen-kilde programvaren mikro-Manger. Se trinn 6 for tips om bruk av mikro-Manager.
    1. Hvis bobler, venter dem å fortrenge eller bli absorbert i PDMS vegg før lasting noen dyr, tilstedeværelse av bobler vil forstyrre riktig strømmen av væske gjennom innretningen.
  10. Bruker et GFP-filter, bekrefte flyter dynamikken i enheten før ormen laster ved actuating 3-veis ventilen og observere bytte buffrene.
    1. Fastslå flyter dynamikken: observere fluorescein i flyt kontroll og buffer løsninger ( figur 2D -2E) endre når flyten kontrollverdien endres ved å trykke kontroll knappen som tilsvarer den 3-veis ventilen ventil koblingen ( figur 1B).
    2. Etter åpning mikro-Manager, klikk på " Live " å observere et levende bilde av enheten. Slå på fluorescerende lyskilden å følge de buffere i enheten ( figur 2D -2E).

Figure 2
Figur 2: En mann-tilpasset microfluidic olfactory brikke. (A) flyt mønstre av enheten når ormen er utsatt til bufferen. Buffer (B) vises i brunt, og flytkontroll (FC) vises i gul med stimulans (S) i hvitt. Ormen lasting port har blitt tilpasset for å inkludere en kurve, noe som gir bedre kontroll av ormen orientering. (B) flyt mønstre av enheten når ormen er utsatt for stimulans. Buffer (B) vises i brunt, og flytkontroll (FC) vises i gul med stimulans (S) i hvitt. (C) målinger av tilpasset enheten som fabrikkerte. Ormen lasting port ender i en 42 µm åpning, med en 50 µm kanal designet for mannlige bredden. Målt høyden av kanalene er 32 µm, til tross for et mål på 25 µm i utformingen. (D-E) A fanget mannlige uttrykke p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 selskapet er ikke ASH-spesifikke og noen uttrykk kan observeres i ASI Nevron, selv om ingen kalsium transienter ble observert i ASI. Bildet er (D) en kombinasjon av lyse-feltet og fluorescerende lys, mens (E) er fluorescerende bare. Skala linjene betegne 42 µm. (F) The aske Nevron reagerer 1 M glyserol stimulering med robust nevrale aktivitet. Det blå området angir tidspunktet for 1 M glyserol stimulans. Den skyggelagte regionen markerer standardfeilen, med n = 20 pulser fra syv ormer. Rød spor betegne depolarizing svar. De y-akser viser ΔF/F 0. Baren skala angir 5 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. animal forberedelse

Merk: se referanse 23.

  1. Imaging aske Svar å 1 M glyserol.
    1. Plass ca 20 C. elegans menn som er positivt for p sra-6:: GCaMP3 matrise uttrykk på en Rundormer vekst medium (NGM) agar tallerken plantet med en plen av OP50 E. coli. Bruke uttrykk for fluorescerende GECI og/eller en co injeksjon markør for identifikasjon av matrisen-positive dyr.
      Merk: Utvalg positiv dyr vil fluoresce etter GECI brukt (dvs. dyr uttrykke GCaMP vil fluoresce grønne under blå lys stimulering, mens RCaMP dyr vil fluoresce rødt under grønt lys stimulering). Brønnpar kan variere fra andre fluorescerende proteiner, som GFP og RFP, til fenotypiske markører, for eksempel rol-6, eller kan redde en dominerende fenotype, som de pha-1 mutasjon 28.
      1. Hvis plukke umiddelbart før analysen, plukke unge voksne hanner. Hvis plukke dagen før analysen, plukke L4 larver menn.
  2. Imaging CEM Svar 1 µM ascr #3.
    1. Plukke ca 20 L4 C. elegans menn (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); ham-5 (e1490); lite-1 (ce314)) som er positivt for dsRed co injeksjon markør uttrykk.
      Merk: dsRed uttrykket i ray neurons av mannlige tale er lettere å observere og bekrefte enn GCaMP uttrykket i fire CEM neurons.
    2. Isolere disse menn fra hermafroditter på en NGM agar plate plantet med en plen av OP50 E. coli 5-14 h før du utfører tenkelig eksperimentet.
      Merk: Menn ikke isolert i minst 5 h ikke behaviorally svarer på ascr #3 og derfor kan ha enda færre kalsium transienter til ascaroside enn observert her.

5. Dyr lasting

Merk: se refefence 1.

  1. Plukke en orm på en unseeded NGM agar plate med standard ormen vedlikehold teknikker.
    1. Plukke ormer av flammende en hakke (laget av flate platina wire), plukke bakterier på plukkingen og " dabbing " en orm å plukke den opp. Forsiktig plassere ormen på den nye platen, slik at det å gjennomgå av på sin egen.
  2. Legge til ca 5 mL 1 x S Basal unseeded platen, slik at platen er oversvømmet.
  3. Trekke ormen lasting sprøyter (dvs. 3 mL sprøyte med vedlagte rør) som er forhåndsutfylt med 1 x S Basal til.
    1. Må du suge ormen bare til slangen, ikke helt i sprøyten.
      Merk: Hvis ormen reiser i sprøyten, det er nesten umulig å få den tilbake i slangen.
  4. Slå av vakuum å stoppe strømmen ved å slå stikkontakt Luer ventilen.
  5. Fjerne solid pin blokkerer ormen lasting havn
  6. Slå Luer ventilen koblet til uttaket porten ( figur 1B) slik at det er ventilering.
    Merk: Bruk en live video feed under lasting ormen for å bekrefte og dreie av dyret (trinn 5.8-5.13).
  7. Sett inn ormen legger rør inn ormen lasting havn
  8. Forsiktig gjelder trykket sprøyten til ormen vises i lasting kanalen.
  9. Hvis ormen begynner å åpne hale-første, trekke på sprøytestempelet hindre at ormen inn kanalen.
  10. Bytte mellom søker og snu press til hodet i kanalen først.
  11. Åpne vakuum ved å slå 3-veis Luer ventilen koblet til uttaket porten å åpen den å tomrom i stedet for atmosfære.
  12. Manuelt legge press av nedslående sprøytestempelet å orientere og plassere ormen hodet slik at den er utsatt til buffer strømmen kanalen, men ikke så langt at hodet kan bevege seg fritt ( figur 2 D-2E).

6. Stimulans og oppkjøp

  1. bruker en åpen kildekode mikroskopi programvare, for eksempel mikro-Manager, registreres ved ta bilder som en TIFF-stabel på 10 rammer/s med blå lys eksitasjon (470 nm) for 30 s.
  2. Satt eksponeringen i hovedmenyen til 100 ms.
    1. Åpne " multi D Acq. " fra hovedmenyen av programvaren. Angi den " nummer " å " 300, " og " intervall " til " 0. " Klikk " anskaffe! " å erverve videoen.
  3. Bruk en 10 s puls av stimulans 5 s etter oppstarten oppkjøpet. Juster varigheten på stimulans programmet som.
    1. Etter å anskaffe 5 s av video, endre 3-veis ventilen kontrollere flyt kontroll bufferen for å bruke stimulans dyret testes. Klikk venstre på koblingen ventilen ( figur 1B).
    2. Etter 10 s stimulans eksponering (denne gangen kan justeres som ønsket av brukeren), endre flyten av buffere ved igjen å trykke knappen lengst til venstre på koblingen ventil.
  4. Post under buffer bare til vinduet 30-s er fullført slik at GECI fluorescens å gå tilbake til opprinnelig.
  5. Gjenta etter ønske. Vent 30 s mellom slutten av oppkjøpet og initiering av neste rettssaken.

7. Bildeanalyse

  1. Åpne TIFF stabelen med åpen kildekode programvare, ImageJ, ved å dra filen til vinduet ImageJ.
  2. Klikk med markøren og dra for å angi regionen rundt (ROI) rundt Nevron rundt. Angi regionen med soma av Nevron interessepunkter (som i figur 3A).
  3. Plot z-stakken fluorescens intensitet av Avkastningen over stabler ved å klikke Åpne-> bilde - > stabler - > Plot z profil.
  4. Klikk " listen " i vinduet som åpnes. Klikk Rediger - > kopier for å kopiere verdiene. Lime inn verdiene i et regnearkprogram.
  5. Analyserer bakgrunnen fluorescens for hver puls ved å dra Avkastningen til en region av ormen som ikke inneholder GCaMP uttrykk.
  6. Utføre bakgrunn subtraksjon for hver puls ved å trekke bakgrunn fluorescens verdien fra Nevron fluorescens intensitetsverdien.
  7. Beregner ΔF/F 0 for hver ramme av hver puls.
    1. Beregne F 0 som gjennomsnittlig intensitetsverdien av Avkastningen for første 1 s oppkjøpet (f.eks rammer 1-10).
    2. Beregner ΔF/F 0 ved bakgrunn-subtraheres verdien for rammen rundt med beregnet F 0 verdi.
  8. Gjenta for hver Nevron fotografert og hver stimulans puls.
  9. For neurons med konsistent svar profiler, som ASH, gjennomsnittlig alle pulser for hver Nevron og beregne SEM (som i figur 2F).
  10. Plot gjennomsnittlig ΔF/F 0 med SEM over tid for hver Nevron.
    Merk: I dette tilfellet, det er vanlig praksis å inkludere heatmaps av personlige neuronal svarene på hvert forsøk. Neurons som ikke forårsaker konsekvent endringer i kalsium transienter ved eksponering til stimuli over gjentatte stimulations eller ulike individer 23, kan det være mer gjeldende for Vis personlige puls spor (som i Figur 4). Se diskusjon for detaljer om å finne ut hvordan du viser dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på den samlede Enhetsinnstillinger ses i figur 1A-B. Figur 1A viser riktig reservoaret konstruksjon og installasjon. Figur 1B viser forbindelsen med reservoarene til den microfluidic enheten. Figur 1 c viser en microfluidic enhet med individuelle porter merket for klarhet.

Utformingen av mann-tilpasset microfluidic enheten inneholder en kurve i lasting port, men flow dynamics er identisk med enheten er designet av Chronis et al.19(figur 2A2 C). Flyten av buffere kan kontrolleres ved å endre hvilke flyt kontrollventilen er åpen (figur 2A-2B). Målinger av enheten som fabrikkert varierer fra filen designet. Målene i figur 2C er "som fabrikkerte" mål.

Etter lasting mannlige C. elegans i hann-tilpasset olfactory enheten, deres plassering og retning, samt kanal flow dynamics, kontrolleres via både lyse-feltet og fluorescerende imaging (figur 2D-2E). Eksponering av ormer uttrykke GCaMP3 i nociceptive Nevron, ASH, til 1 M glyserol resulterer i synlige endringer i fluorescens i aske Nevron, indikativ nevrale aktivitet (figur 2F). Subtile endringer i fluorescens kan ikke vises av øyet, men programvaren kan brukes å kvantifisere endringene. Gratis ImageJ programvare kan brukes til å analysere og kvantifisere fluorescerende intensiteten av aske neurons ved eksponering til 1 M glyserol over tid (figur 2F). Dette ligner på hva er observert i hermafroditter27 , og robusthet av aske nevrale respons til glyserol, er dette observert i alle dyr testet.

En liten mengde aksial eller roterende bevegelse forventes unparalyzed dyr, ofte nødvendiggjør en Nevron sporing algoritme under videoanalyse (figur 3A). Tillegg av en lamme: i bufferne (f.eks 1 mM tetramisole) eliminerer nesten denne effekten, selv om noen dyr (~ 10%) fortsatt flytte under forsøkene. Dette kan omgås ved å: (a) bruke eldre menn, som er mer effektivt fanget; (b) redusere bredden eller tykkelsen av lasting port ytterligere; eller (c) øker enten konsentrasjonen av den lamme: brukt eller bruker en annen lamme:. Dette sikrer også at det ikke er for mye av hodet forbi slutten av fellen og utsatt for lukt kanalen. Hvis det oppstår en rettssak med ormen bevegelse, kan området analyse flyttet og lese fra den nye neuronal plasseringen, starter på rammen som oppstår bevegelse (figur 3B). Manuell rekonstruksjon av nevrale spor av brukeren er nødvendig i dette tilfellet. Skript som analyserer fluorescerende endringene i Nevron og som følger nevrons center når den beveger seg kan også skrives19.

Mannlige C. elegans forstand attraktive biogene feromoner kalt ascarosides via fire sex-spesifikke CEM neurons23. Når kalsium transienter er observert hos menn, er svarene variabel i form, tegn og omfanget mellom både nevroner og dyr (figur 4A-B). Men er mann svar på feromoner ikke pålitelig observert som kalsium transienter i mange dyr (figur 4C). Dette er ikke nedslående, som de fleste ascarosides ikke framprovosere kalsium transienter på sensasjon13,14,15.

Figure 3
Figur 3: adressering ormen bevegelse i bildet oppkjøpet perioden. (A) ΔF/F0 (endre fluorescerende intensitet delt på gjennomsnittlig bakgrunn fluorescerende intensiteten for første 1 s oppkjøpet) ble beregnet med ImageJ ved å definere et område der Nevron rundt var pålitelig statisk for 1 s. Under stimulans pulsen (blå området), dyret flyttet, sett på bildene ovenfor kalsium spor, resulterer i Nevron ikke lenger er innenfor området analysert (gul boks). Skala linjene betegne 42 µm. det stiplede linjer viser området av sporet som tilsvarer plasseringen av ormen i hvert bilde. (B) hvis området analyse er flyttet å følge Nevron under rettssaken og individuelle spor gjenoppbygges formidle faktiske nevrale dynamikken spor vises som om dyret ikke flytte. De stiplede linjene viser regionen spor som ble rettet for ormen bevegelse. Spor for både ASH-nerveceller, venstre og høyre (ASHL (rød) og ASHR (blå), henholdsvis) vises. De y-akser viser ΔF/F0. Baren skala angir 5 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Mannlige C. elegans CEM svar på 1 μM ascr #3 er variabel. Hann-spesifikke CEM neurons vise unike mønstre av svar biogene feromoner. (A) svar observert i hver CEM Nevron for en støtpuls i en forståelsesfull dyr vises. Det er fire CEM neurons: dorsal høyre (CEM DR), dorsal venstre (CEM DL), ventral høyre (CEM VR) og ventrale venstre (CEM VL). Tre av de fire nervecellene svarer med depolarizations av varierende form og omfanget, den fjerde ikke reagerer på ascaroside. (B) omtrent en tredjedel av fanget dyrene (2/7 testet i denne studien) resulterer i bare tre neurons kan avbildes. Svarene på en orm i denne retning resulterte i CEM kalsium transienter som var annerledes enn de observeres i første ormen. Dette var ikke på grunn av endring i retning av ormen, som CEM DR er synlig i begge retninger og utstillinger variabel svar mellom dyr. (C) mange ormer ikke svar med noen synlig kalsium transienter (5/7 testet i denne studien). Individuelle spor vises er representant for enkelt dyrene vist i bildene ovenfor tomter. Denskala barer betegne 42 µm. spor: det blå området angir tidspunktet for 1 μM ascr #3 eksponering. Rød spor betegne depolarizing svaret. Svart spor betegne ingen observert respons. De y-akser viser ΔF/F0. Baren skala angir 5 s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hann-tilpasset olfactory chip opptar en sving i en smalere lasting port, som gir mer kontroll over retningen og effektiv overlapping av mannlige C. elegans. Dette gir effekten av både venstre og høyre neuronal bilaterale par, uten behov for z-stabling. Denne kurven fører til en retning fra loddrett 100% av tiden i worms hvor bare ett bilaterale par er mål fluorescerende markøren, som ASH (figur 2D-E)29,30. Imidlertid neuronal klasser med fire radielt symmetrisk neurons, som CEM, alle fire neurons, vises bare en tredjedel av tiden. En tredel av testet har bare tre av de fire nervecellene synlig, og en tredjedel, bare skjelnes forskjellen mellom dorsal og ventrale celle kroppen, ikke den venstre høyre asymmetri (data ikke vist). Smalere porten er kombinert med en lavere kanal høyde å hindre ormen svingninger i z-aksen. Denne utformingen gir avbilding av menn i fremtiden studier, som kombinert med stadig økende kunnskap om de mannlige connectome25,31, gjør en bedre forståelse av sex-spesifikke nevrale funksjon.

Analyse utført i denne protokollen bruker gratisprogrammet ImageJ for å måle endringer i fluorescens i Nevron rundt. Med dagens design, 1 mM tetramisole i bufferen effektivt lammer ormer og hindrer bevegelsen av neurons å bli fotografert. Hvis bevegelsen ikke er forebygges, eller hvis brukeren ønsker å unngå bruk av en lamme:, må mer komplekse sporingsskriptene skrives som spore neurons som de beveger seg7. Men i denne protokollen flytte mannlig ormer bare da de var for liten til å være effektivt begrenset ved lasting port og når presentert med en ekstremt aversive stimulans, som glyserol. Selv i slike tilfeller, bevegelsen er kort og ikke krever store mengder sporing justeringer, sette en avkastning rundt den nye Nevron plasseringen reduserer feil fluorescerende readouts (figur 2).

En begrensning av enkelt-orm, felle-basert bildebehandling er det bare ettall orm kan avbildes på en time1. En annen begrensning av disse feller er at ormer kan sette seg fast i enheten, forårsaker enheter til å være tette og "brukt opp" etter imaging kun få ormer. Imidlertid lindrer er rask behandlingstid for fabrikasjon av nye enheter fra en master mold denne ulempen. Utvidet blått lys belysning har også vist seg å indusere photodamage C. elegans32,33. Relativt kort eksperimentelle tidsramme på denne protokollen (30 s) tillater tenkelig uten målbar photobleaching. Men for å unngå photobleaching og photodamage i lengre eksperimenter, kan lyskilden være pulserende7. For eksempel under hver 100-ms eksponering, kan lyset være pulsed i 10 ms. for dette har blitt vist å eliminere økt kroppen autofluorescence over tid7.

For å skikkelig teste menn sine svar til ascarosides, må larvestadiet 4 (L4) mannlige være isolert fra hermafroditter, minst 5 h, for å oppnå en nær-naiv svar feromoner23. Isolasjon for mindre enn tidsrom kan forårsake dyr å unnlate å svare på ascarosides. Denne isolasjonen er imidlertid ikke nødvendig når du tester ikke-ascaroside indikatorer, for eksempel glyserol. For konsistens, men var dyr alltid isolert minst 5 h før kalsium bildebehandling. I noen neurons, som CEM, ikke alle stimulering vil elicit neuronal svar og hver CEM som svarer gjør det for å generere en viss "koden" nevrale representasjon. Dette fenomenet i CEM er observert via elektrofysiologi studier, samt med kalsium imaging studier som de beskrevet her23. Dermed er målbare kalsium transienter i CEM nerveceller i hvert ascaroside-eksponerte dyr ikke garantert23. Faktisk, framprovosere mange av ascarosides undersøkt ennå ikke målbare kalsium transienter13,15,34,35. Den vellykkede elicitation av målbare transienter ble observert i bare én av tre pulser av feromon i to av de fem dyr utsatt for ascaroside av interesse (Figur 3). Dette samsvarer med frekvensen av suksess tidligere observert i andre labs23. Denne variasjonen er en begrensning når studere feromon svar og er ikke på grunn av hann-baserte fokus for denne protokollen.

Når undersøke kalsium transienter elicited svar på ascarosides, bør en ikke avvise mangel konsistent svar uten videre etterforskning. Dette kan testes gjennom eksperimenter som elektrofysiologi studier bekrefte variabel svaret i en neuronal klasse. For neurons, som ASH, svare som pålitelig, manglende samsvar respons kunne være indikativ av større eksperimentelle problemer, for eksempel feil stimulans kontroll. Topp intensiteten av svarene kan også undersøkes hvis variasjon forventes i svaret. Spor kan tegnes med standardavvik eller standardfeil (som i figur 2F). Hvis standardavvik er liten, kan spor plottet og analyseres som sådan. Hvis det er merkbar mengde variant fører til moderat standardavvik, data kan tegnes det samme, med tilhørende heatmaps sortert etter svar "type" vise svar-av-svar variasjonen. Hvis det er betydelig variasjon (Figur 3), der toppene ikke kan distribueres på en Gaussian måte, svar kan kategoriseres i svaret "typer" (f.eks, depolarizing, hyperpolarizing eller ikke-polarisert)23. Svar som faller inn i en bestemt "type" kan tegnes og analysert sammen. Tilsvarende skal heatmaps følge denne analysen.

Fremover, kan denne enheten tilpasses for å tillate for avbilding av larver-trinnvis nematoder ved innsnevring lasting port ytterligere. Videre innsnevring av slutten av lasting port vil tillate begrensningen av dyret å tillate avbilding av bare flimmerhårene av sensoriske neurons, i motsetning til celle kroppen. Mens andre enheter er designet for den mer vanlig studerte Hermafroditt, lar denne tilpasset olfactory brikken for avbilding av nevrale aktivitet i mannlige nevrale kretser. Som connectome av hannen er fortsatt blir utredet, er å kunne måle nevrale dynamikk i sex-spesifikke nettverk avgjørende for å fullt ut forstå neuronal signalering. Forskjellene mellom hermafroditter og mannlige svar kan nå testes og målt ved hjelp av denne enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Manuel Zimmer for å gi oss filen opprinnelige utforming som ble tilpasset for bruk med menn; Frank Schroeder for syntese og forsyning av ascr #3; Ross Lagoy for innsikt og hjelp med bildebehandling og analyse; og Laura Aurilio for master fabrikasjon og som, sammen med Christopher Chute, bidro til gjennomgang av dette manuskriptet. Midler til dette arbeidet ble gitt under den National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (js), National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) og Burroughs Wellcome karriere prisen på vitenskapelige Interface (D.R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Wafer University Wafer 452
SU-8 2035 MicroChem Y111070-0500L1GL
Developer MicroChem Y020100-4000L1PE
Wafer Mask Cad/Art Services - Custom order. Printed at 25,000 dpi.
Sylgard-184 Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm Dermal Punches Acuderm Inc. P150
Soft Tubing Cole-Palmer EW-06419-01
Hard Tubing IDEX Health & Science 1622
Pins New England Small Tube NE-1027-12
Blocking Pins New England Small Tube 0.415/0.425" OD x .500 Long Batch PB07027
3 mL syringes BD 309657
30 mL syringes Vitality Medical 302832 Used as buffer reservoirs.
Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer Component Supply Company NE-231PL-50
Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile Cole-Palmer EW-30600-07
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5M
Mercator Control System LF-5 Plasma System Mercator LF-5
Scotch Tape Scotch BSN43575
Series 20 Chamber Warner Instruments P-2
Vacuum Desicator Bel-Art Scienceware 420250000 24 cm inner diameter.
Weigh Boats Cole-Palmer EW-01017-27
Classic Plus Balance Mettler Toledo PB1501-S/FACT
Glass Pasteur Pipettes Cole-Palmer EW-25554-06
Transfer pipettes Genesee Scientific 30-202
Oven Sheldon Manufacturing Inc 9120993 Model Number: 1500E.
60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes TriTech Research T3308
Zeiss Axio Observer.A1 Zeiss -
Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS Hammamatsu C11440-22CU
Blue Fluorescent Light Lumencor SOLA SM6-LCR-SA 24-30V/7.9A DC.
Illumination Adaptor Zeiss 423302-0000
Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve Parker 001-0017-900 3-way valve for controlling flow.
ValveLink8.2® AutoMate Scientific 01-18 Flow Switch Controller
Micro Manager Micro-Manager - Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ ImageJ - Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological Grade Apex 9012-36-6
Peptone Apex 20-260
CaCl2 VWR BDH0224-1KG
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-1kg
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Ethanol Sigma-Aldrich 270741-4L
Tetramisole Sigma-Aldrich L9756-10(G) Store at 4 °C.
Fluorescein Sigma-Aldrich FD2000S-250mg Light Sensitive. Store in photoprotective vials.
Glycerol Sigma-Aldrich G6279-1L
Ascaroside #3 - - Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).
NaCl Genesee Scientific 18-215
KH2PO4 BDH BDH9268.25
K2HPO4 J.T. Baker 3252-025
ASH GCaMP3 line - - CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.
CEM GCaMP6 line - - JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center OP50
"Reservoir" - - To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
  2. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
  3. Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
  4. Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
  5. Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
  6. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
  7. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
  8. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
  9. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
  10. Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
  11. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  12. Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
  13. Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
  14. Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
  15. McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
  16. Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
  17. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
  18. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  21. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  22. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
  23. Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
  24. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  25. Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
  26. Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
  27. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
  28. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  29. Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
  30. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  31. García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
  32. Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
  33. Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
  34. Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
  35. Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).

Tags

Nevrovitenskap problemet 127 Microfluidics kalsium imaging GCaMP C. elegans menn CEM Nevron ascaroside
Bruke en tilpasset Microfluidic Olfactory Chip for avbilding av Neuronal aktivitet svar feromoner i mannlige <em>C. Elegans </em>hodet nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reilly, D. K., Lawler, D. E.,More

Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons. J. Vis. Exp. (127), e56026, doi:10.3791/56026 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter