Summary
Epidermale keratinocyten vormen een functionele huidbarrière en worden gepositioneerd in de voorste lijn van de gastheerverdediging tegen externe milieubeledigingen. Hier beschrijven we methoden voor isolatie en primaire cultuur van epidermale keratinocyten van neonatale en volwassen muishuid, en inductie van terminale differentiatie en UVB-geactiveerde ontstekingsrespons van keratinocyten.
Abstract
De keratinocyt (KC) is het overheersende celtype in de epidermis, de buitenste laag van de huid. Epidermale KC's spelen een cruciale rol in de bescherming van de huid door een intacte huidbarrière tegen milieubeledigingen te vormen, zoals UVB-bestraling of pathogenen, en ook door een ontstekingsrespons op die beledigingen te starten. Hier beschrijven wij methoden om KC's te isoleren van de neonatale muishuid en van de volwassen staarthuid van volwassenen. We beschrijven ook cultuuromstandigheden met gebruikmaking van gedefinieerde groeitillsupplementen (dGS) in vergelijking met chelexed foetale boviene serum (cFBS). Functioneel tonen wij aan dat zowel neonatale als volwassen KC's zeer responsief zijn voor hoge calciumgeïnduceerde terminale differentiatie, nauwe kruisvorming en stratificatie. Daarnaast zijn gekweekte volwassen KC's gevoelig voor UVB-geactiveerde celdood en kunnen grote hoeveelheden TNF vrijkomen bij UVB-bestraling. Samen zullen de hier beschreven methodes nuttig zijn voor onderzoekers voor de opstelling van het in vitro modelS epidermale biologie in de neonatale muis en / of de volwassen muis bestuderen.
Introduction
De huid is het grootste orgaan in het lichaam met de epidermis als de buitenste laag. De epidermis speelt een cruciale rol bij het vormen van een intacte epidermische barrière om het lichaam van het milieu af te scheiden, waardoor waterverlies voorkomt en bescherming biedt tegen milieubeledigingen, zoals allergenen, pathogenen en UVB-blootstelling. De epidermis ontwikkelt zich uit een enkele laag ongedifferentieerde basale keratinocyten (KC's) in een multi-layered stratified epithel bestaande uit een basale laag, gevolgd door een spinous layer, granulaire laag en stratum corneum. Basale KC's, bestaande uit zowel epidermale stamcellen als transit-amplificerende cellen, zijn proliferatief en ongedifferentieerd. Als de basale KC's de celcyclus verlaten, plegen de cellen op differentiatie en migreren ze geleidelijk naar het oppervlak van de epidermis, vergezeld van de rijping van celcellen en vorming van een epidermale doorlaatbaarheidsbarrière (EPB). De KC's bij de spinous laag drukken vroege differentiaat uitIonmarkers zoals Keratin 10 (K10); Als de KC's migreren naar de korrellaag, worden de cellen uitgedrukt in late differentiatie markers zoals Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) en Involucrin (INV). Bij de stratum corneum worden de KC's terminale gedifferentieerde corneocyten, die uiteindelijk door ontsmetting worden afgevoerd als nieuwe cellen ze vervangen.
Calcium wordt beschouwd als het meest fysiologische middel in de epidermis en verschilt op een vergelijkbare manier in vitro en in vivo differentiatie. Bij normale huid-epidermis vormen calciumionen een karakteristieke 'concentratiegradiënt', waardoor de concentratie naar het huidoppervlak 1 , 2 , 3 toeneemt. De calciumconcentratie stijgt van lage niveaus in de laagste onderlagen (basale en spinale lagen) tot een piek in de bovenste korrellaag en druppelt dan naar verwaarloosbare niveaus in de meest oppervlakkige laag (stratum corneum). De calciumgradiënt ontwikkelt ook toevallig met de opkomst van een componentpermeabiliteitsbarrière, die ondersteunt dat calciumsignaal een cruciale rol speelt bij KC-differentiatie. In vitro handhaaft lage calcium (0,02-0,1 mM) de proliferatie van basale KC's als een monolaag, terwijl hoog calcium (> 0,1 mM) een snelle en onomkeerbare inzet van de cellen tot terminale differentiatie veroorzaakt, zoals aangetoond door middel van nauwe verbinding en inductie Van LOR en INV op hoge calciumbehandeling aan de basale KCs 4 , 5 .
Naast barrièrevorming zijn epidermische KC's ook een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem van de huid. Als reactie op pathogenen of beschadigde geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's) die worden vrijgegeven bij UVB-bestraling of verwonding, kunnen KC's grote hoeveelheden inflammatoire cytokinen produceren, zoals TNFa, IL6 en IFNβ, wat leidt tot het activeren van immuunsysteem> 6 , 7 , 8 , 9 . Hoewel een goede ontstekingsmelding van KC's nodig is voor pathogeenvrijstelling, kan onbeheerde ontstekingsreactie de ontwikkeling van auto-inflammatoire huidziekten veroorzaken, zoals psoriasis en rosacea 6 , 8 .
In het algemeen spelen KC's een vitale rol bij het handhaven van de intacte huidbarrière en het initiëren van een immuunrespons bij patogene invasie of milieubeledigingen. Daarom is de primaire cultuur van epidermale KC's een nuttige techniek om de epitheliale biologie, KC-differentiatie, en KC-gestimuleerde aangeboren immuunresponsen te bestuderen. De isolatie en cultuur van primaire muis epidermale KC's kan een uitdagend proces zijn door de gevoeligheid en gevoeligheid van KC voor diverse externe stimulanten. Hier beschrijven we een methode om KC's te isoleren en te cultiveren uit ofwel neonatale muishuid ofVolwassen muis staart huid. Voor volwassen KC-isolatie gebruiken we geen dorsale huid van de muis omdat voldoende hoeveelheden levensvatbare KC's uit dit weefsel kunnen isoleren, om de volgende redenen moeilijk kunnen zijn: Eerst bestaat de volwassen dorsale huid in de rustfase van de haarcyclus (telogen) uit een Dunne epidermis met slechts 1-2 lagen cellen, wat leidt tot een lage celopbrengst en inefficiënte scheiding van de epidermis uit de dermis, die de kritische stap voor succesvolle KC-isolatie is. Ten tweede draagt de hoge haarfollikeldichtheid die aanwezig is op volwassen dorsale huid bij tot de moeilijkheid bij het scheiden van epidermis uit de dermis. In plaats daarvan gebruiken we routinematig staarthuid als bron voor volwassen muis KC's, omdat dit epithelium dikker is met 3-5 lagen epidermale KC's. Het heeft ook een lagere haarfollikeldichtheid, die de epidermische afscheiding niet interfereert, waardoor KC-isolatie van elke volwassen muissterthuid mogelijk maakt, ongeacht de leeftijds- en haarcyclusfase van de muis. De geïsoleerde neonaTal KC's worden geperst op gelatine gecoate kweekschotels, terwijl kollageencoatede schotels worden gebruikt om geïsoleerde volwassen KC's te zaaien als gevolg van het verminderde vermogen van de volwassen cellen om te hechten in vergelijking met hun neonatale tegenhangers. Om de KC's van het muizen te cultiveren, wordt het basale calciummedium laag aangevuld met dGS, die epidermale groeifactor (EGF), boviene transferrine, insulineachtige groeifactor1 (IGF1), prostaglandine E2 (PGE2), boviene serumalbumine (BSA) en hydrocortison bevat. Tussen 2-4 dagen na de eerste plating kunnen de meeste van de gedifferentieerde KC's weggewassen worden tijdens dagelijkse mediumveranderingen, en de overige aanhechtende cellen tonen de typische kolfsteenmorfologie 4 , zijn proliferatie en drukken de vroege differentiatie markering K10 niet uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Primere Muis KC Isolatie en Cultuur uit Neonatale Huid
- Offer de postnatale dag 0-2 neonaten uit de C57B / 6 wildtype muis stam door decapitatie met behulp van een schaar. Knip de ledematen net boven de pols- en enkelgewrichten af, snijd de staart helemaal af en laat een klein gatje.
- Om de hele huid af te plakken, schuift u eerst een scherpe schaar door het gat aan de staart en snijd de huid langs de dorsale middenlijn van het lichaam naar de opening op de nek. Vervolgens gebruik één tang om het blootgestelde lichaam en de andere tang te grijpen om de huid te grijpen en schud de hele huid van het lichaam en over de beenstompen met een continue beweging af.
- Verwijder de huid als een intact stuk en wees voorzichtig om de huid niet in stukken te breken, aangezien dit celverlies tijdens de dispasstap zal veroorzaken.
<Li> Spoel de geschilde huid met 15 ml steriele PBS in een 10 cm Petri-schotel en plaats de huid van elke pup in een 2 ml buis gevuld met ijskoude afzettingsbuffer, die 4 mg / ml dispas in KC groeimedium bevat (KC basismedium heeft 0,06 mM CaCl2, DG en antibiotica / antimycotica). - Zorg ervoor dat de huid niet in de buis wordt gevouwen, omdat dit onvoldoende blootstelling van het gevouwen gebied tot de dispasoplossing zal veroorzaken.
- Vervolgens de volgende dag (na 12-18 uur in dispase) de huid samen met de dispasoplossing in een Petri-schotel overbrengen. Breng elk weefselstuk over naar een nieuwe Petri-schotel met 15 mL steriele PBS om overmatig dispas te wassen.
- Gebruik twee paar tangjes, pak de huid van PBS,Lig de huid op en overplaats naar een nieuwe Petri schotel met de epidermale zijde naar beneden en de dermis kant omhoog. Strijk de huidvouwen voorzichtig uit zodat het volledig op de Petri-schotel wordt verlengd.
- Plaats 500 μL van een trypsine-gebaseerde vertering oplossing voor elke huid in een nieuwe Petri schotel. Trek de dermis langzaam op en weg van de epidermis, terwijl u de epidermis vasthoudt. Verwijder de dermis als biohazard materiaal. Breng de gescheiden epidermis over en drijf op elke druppel trypsineoplossing met de basale laag naar beneden.
- Als de epidermis op de trypsineoplossing wordt gevouwen, verwijder eventuele plooien met behulp van pincet om een efficiënte vertering van basale KC's uit het epitheel te waarborgen.
- Incubeer de huid op een petri schotel in trypsine-oplossing bij kamertemperatuur (met deksel bedekt) op een horizontale shaker met zachte agitatie gedurende 20 minuten.
- Voeg 2 ml aangevuld KC groeimedium per epidermis toe (ongeveer 1 vierkante inch in grootte perEpidermis) aan de Petri schotel. Grijp de epidermis met behulp van tang en veeg de epidermis krachtig en heen en weer om enkele cellen uit het epidermale vel los te maken.
- Bekijk de middelste beurt steeds turbid als cellen los van de epidermis zijn. Kantel de Petri-schotel om de celsuspensie te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe buis die het overblijvende epidermale blad op de schotel laat.
- Herhaal nog twee keer het wrijven van het epidermale vel na het toevoegen van 2 ml KC groeimedium, en combineer de cel suspensies in dezelfde buis.
- Pipet de celoplossing zachtjes een paar keer zachtjes om alle celklompen te breken met behulp van een passend serologisch pipet, dan door een 100 μm filter naar een nieuwe 50 ml centrifugebuis.
- Centrifugeer de gefiltreerde cellen gedurende 5 minuten bij 180 x g.
- Aspirateer het supernatant en verzacht de celpellet voorzichtig opnieuw in 1 ml koud KC groeimedium / epidermis.
- Tel de cellen met een hemocytometer.
- Zaad de cellen bij een dichtheid van 5 x 10 4 / cm2 in groeimedium KC in kweekschalen vooraf bekleed met een extracellulaire matrix (ECM) product dat celhechting bevordert.
OPMERKING: Wij gebruiken een commercieel beschikbaar (bijv. Bevestigingsfactor, dat is een gelatine-gebaseerde coatingmateriaal (zie de Tabel van Materialen voor details). Cellen werden gekweekt in bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C en vers medium waren Opgevuld elke andere dag.- Om de coating te bedekken, bedek de kweekschotels met het celbevestigingsbekledingsmateriaal gedurende 10 minuten tot 2 uur voor kamertemperatuur tot kamertemperatuur. Verwijder de bijlage factor net voorToevoegen van de cel suspensie.
- Vervang het medium 24 uur na de eerste plating om losgebonden cellen te verwijderen en verander het medium dagelijks totdat de cellen voorafgaand aan het experiment de gewenste confluentie bereiken.
OPMERKING: Meerdere huidisolaten kunnen gecombineerd en geïncubeerd worden in een 15 ml buis (tot 5 vellen per buis) die 12 ml dispasoplossing bevat. Incubeer de huidbuis overnacht in een 4 ° C koelkast op een rotator.
2. Primaire muizen KC-isolatie uit de volwassene staarthuid
- Offer een volwassen C57BL / 6 muis (bij voorkeur tussen 6-15 weken oud, ofwel man of vrouw) volgens de dierenvoorschriften. Knip de staart van het lichaam af van de staartbasis en snij ~ 2 mm van de staartpunt af, zodat er een zichtbaar gat bij de punt is.
- Om de staarthuid af te schillen, gebruik eerst een scherp mes om de staarthuid van de basis naar de staart te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om het blootgestelde staartbeen en de andere pincet te grijpen om de huid te grijpen en schud de staarthuid van het bot met een continue beweging af. Knip de geschilde huid van de middellijn zodat elk stuk minder dan 2-3 cm lang is.
- Spoel de geschilde huid witH 15 ml steriele PBS in een 10 cm Petri-schotel, plaats dan de huid van elke staart in een 2 ml buis gevuld met ijskoude afgiftebuffer (4 mg / ml dispas in KC groeimedium).
OPMERKING: Veelvoudige huidstukken kunnen ook gecombineerd en geïncubeerd worden in een 15 ml buis (tot 5 staart per buis) die 12 ml dispasoplossing bevat.- Incubeer de huidbuis overnacht in een 4 ° C koelkast op een rotator.
- Voer stappen 1.4 tot 1.13 uit om de enkelcelsuspensie van de staart-epidermis te isoleren.
- Zaad de volwassen cellen bij een dichtheid van 10 x 10 4 / cm2 (geteld met een hematocytometer) in KC groeimedium in kweekschalen voorbekleed met collageen.
OPMERKING: we gebruiken een in de handel verkrijgbare collageen gebaseerde coating kit (zie de tabel van materialen voor details). Cellen werden gekweekt in bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, en vers medium werd om de dag bijgevuld. In het algemeen is de cCulturen moeten gedurende 30 minuten tot 1 uur voorafgaand aan de celzaad worden gecoateerd met collageen. We merken op dat er een significante verbetering van de volwassen KC-bijlage op het gerecht is wanneer het wordt gecoat met collageen in vergelijking met de bevestigingsfactor, die een gelatine-gebaseerde bekledingsmateriaal is. - Vervang het medium 24 uur na de eerste plating om losgebonden cellen te verwijderen en verander het medium dagelijks totdat de cellen voorafgaand aan het experiment de gewenste confluentie bereiken.
3. In Vitro Differentiatie van KC's door middel van hoog calcium
- Naar terminale differentiatie induceren voeg CaCl 2-0,2 mM in het kweekmedium.
- Alternatief, verhit de gekweekte KC's overnacht zonder extra toegevoegde groeistoffen in een laag calcium KC basaal medium voorafgaand aan de toevoeging van hoog calcium.
OPMERKING: Groei factor hongersnood zal de celverbintenis tot vroege differentiatie verbeteren en de inductie van vroege differentiatie markers, zoals K10 5
4. UVB Bestraling Gemedieerde Cell Death en TNFa Release van KCs
- Cultuur de muis KC's in KC groeimedium (in bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C) met dagelijkse gemiddelde verandering tot de cellen confluentie bereiken. Onmiddellijk voor de UVB-bestraling, verwijder het groeimedium en vervang met 500 μl PBS. Vervolgens de cellen onderworpen aan 25 mJ / cm 2 UVB of mock control (geen UVB).
OPMERKING: UVB bestraling wordt uitgevoerd met handheld UVB lampen met twee 8 W lampen (312 nm) zoals eerder beschreven 10 . Na UVB-bestraling wordt PBS gesuspendeerd en vers medium toegevoegd. - Meet en kwantificeer de cellevendabiliteit door de CCK-8-cellevendabiliteitsbepaling bij 6, 8 en 24 uur na UVB-behandeling volgens de instructie van de fabrikant 11 .
- Verzamel het gecondenseerde medium uit de KC's die met UVB zijn behandeld op gewenste tijdspunten en meet de toegediende TNFaIn het gecondenseerde medium door de Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoge calcium geïnduceerde terminale differentiatie van neonatale en volwassen KC's. De primaire muis epidermale KCS uitgeplaat en gehandhaafd op 0,06 mM CaCl2 gegroeid als monolaag en individuele cellen hadden een veelhoekige vorm met verschillende intercellulaire ruimte, toont een geplaveide uiterlijk bij confluent (Figuur 1A en Figuur 2A). Verhogen van de CaCl 2-0,2 mM veroorzaakte een snelle verandering morfologie van de cellen. Binnen 8 uur na de hoge calciumschakelaar werden de cellen platgeslagen en de duidelijke intercellulaire ruimte werd minder duidelijk en door 24 uur bleek de celceladhesie met strakke kruispunten duidelijk te zijn ( Figuur 1A en Figuur 2B ). De vorming van de gehoornde cel envelop en verticale cel stratificatie begon rond 48-72 uur na de hoge calcium schakelaar ( Figuur 2B). De actine remodellering en cel-cel strakke formatie overgang tijdens de hoge calcium schakelaar analyseren KCS behandeld met 0,2 mM CaCl2 werden gekleurd met falloïdine (figuur 1B) naar het actine remodellering tijdens KC 13 differentiatie te meten. De vorming van de actinvezelrijke filopodiale projeksies tussen de aangrenzende cellen werd zo vroeg als 3 uur na de calciumschakelaar gedetecteerd en de actinvezel-remodeling ging verder tussen 6-24 uur en door 48 uur werd de cellratratificatie prominent ( Figuur 1B ).
Ontvankelijkheid van muis KC's aan UVB-geactiveerde cel dood en TNFa vrijlating . De gekweekte volwassen muis KCs werden blootgesteld aan 25 mJ / cm2 UVB straling, en de levensvatbaarheid van de cellen en TNFa uitgebracht in het kweekmedium werden geanalyseerd. Zoals blijkt uit de fase contrast beelden ( FiguRe 3A), evenals de cellevendheidsassay ( Figuur 3B ), de UVB een tijdafhankelijke dood van de KC's geactiveerd. Na 24 uur werden de meeste cellen afgerond en werden losgemaakt van de schotel ( Figuur 3A ). Zoals gekwantificeerd door de cellevendheidsassay, waren 90% van de cellen binnen 24 uur na de UVB-behandeling dood ( Figuur 3B ; p <0,001 zoals berekend door een eenmalige ANOVA meervoudige vergelijkingstest). Tenslotte hebben we aangetoond dat TNFα, een belangrijk cytokine dat door UVB geïnduceerd wordt en KC-apoptose veroorzaakt na UVB-bestraling 14 , ruimschoots afgescheiden werd (~ 250 pg / ml binnen 24 uur na UVB-bestraling; p <0,001) in het kweekmedium van UVB-behandelde KC's op een tijdafhankelijke wijze ( Figuur 3C ).
Figuur 1: Primaire Cultuur van Neonatale Muis KCs, en High Calcium Induced Terminaldifferentiatie en Tight Cell Cell Junction Formation. ( A ). Primaire neonatale muis KCS werden behandeld met veel calcium (0,2 mM CaCl2) en fasecontrastbeelden op 4x vergroting werden genomen bij 0 uur (ctrl) en 8 uur na behandeling. Schaalbalk = 100 μm. ( B ). Neonatale KCS werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van 0,2 mM CaCl2, en de cellen werden gekleurd met falloïdine (rood) de vorming van actine vezelrijke filopodial uitsteeksels tussen de aangrenzende cellen te visualiseren tijdens differentiatie. Nuclei werden tegenstapeld met DAPI, en actinvezels werden gekleurd met rhodamine phalloidine. Schaalbalk = 25 μm. Beelden werden genomen bij 20X vergroting met behulp van een fluorescentiemicroscoop ingesteld op het DAPI-kanaal (voor nucleaire kleuring) en RFP-kanaal (voor actinkleuring). Lank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: Primaire cultuur en hoge calcium geïnduceerde terminale differentiatie van volwassen KCs van volwassenen. ( A ). Fase contrast beelden bij 10x vergroting van primaire volwassen muis KC's om 8 uur, 1 dag, 2 dagen en 3 dagen na de eerste plating. Het bovenste paneel vertegenwoordigt cellen die gegroeid zijn in dGS, en het onderste paneel vertegenwoordigt cellen die worden gegroeid in 10% chelexed FBS (cFBS) met 8 ng / ml recombinante muis EGF. Schaalbalk = 100 μm. ( B ). Confluente volwassen muis KCS werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van 0,2 mM CaCl2 en fasecontrastbeelden bij 10x vergroting werden genomen op 0 (ctrl), 8, 24, 48 en 72 uur na hoge calcium switch. Schaalbalk = 100 μm.Nk "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Primaire cultuur van volwassen muis KC's en susceptibiliteit van volwassen KC's tegen UVB-geïnduceerde celdood en vrijgave van TNFa. Primaire volwassen muis KCs werden gekweekt tot confluentie, dan blootgesteld aan 25 mJ / cm2 UVB-straling. ( A ) Fase contrast beelden bij 10X vergroting genomen op 12 en 24 uur na blootstelling aan UVB vertoonde een tijdsafhankelijke UVB-geïnduceerde celdood. Schaalbalk = 100 μm. ( B ) De cellevendabiliteit werd gekwantificeerd door de CCK-8-cellevendabiliteitsbepaling bij 6, 8 en 24 uur na UVB behandeling. ( C ) UVB geïnduceerde afgifte van TNFa aan de media op aangegeven tijdspunten werd gemeten door ELISA. Alle foutbalken geven gemiddelde ± SEM aan. De p-waarden werden berekend door een eenmalige ANOVA meervoudige vergelijkingTest (***, p <0.001) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huid epidermis functioneert als een kritieke barrière om het lichaam te scheiden en te beschermen tegen de buitenomgeving en schade door waterverlies, pathogenen, hitte en UV-bestraling. De KC's zijn de overheersende cellijn van de epidermis, en de primaire cultuur van epidermale KC's is een nuttig instrument om de biologische processen van barrièrevorming en de respons van KC's te bestuderen en te begrijpen op milieubeledigingen in vitro .
Hier beschrijven we methoden om primaire epidermale KC's te isoleren en te cultiveren vanuit de neonatale en volwassen muishuid. Terwijl primaire muis KC's gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd uit de neonatale muizenhuid, worden de isolatie en succesvolle cultuur van volwassen KC's als moeilijk beschouwd door het verdunnen van de epidermis en de hoge haarfollikeldichtheid van de dorsale huid van de volwassen muis. De hier beschreven methode maakt gebruik van een volwassen muisstaart als een handige en overvloedige bron van basale KC's. Door de aanwezigheid van een dikke epidermis en laag Haarfollikeldichtheid in de staarthuid, wordt de kritische stap van het isoleren van KC's door de epidermis uit de dermis te scheiden, haalbaar na de spijsvertering van de staarthuid. Onze poging om KC's van volwassen dorsale huid te isoleren met dit protocol was daarentegen niet succesvol, wat resulteerde in een lage celopbrengst na isolatie en lage celbevestiging na plating. Echter, succesvolle isolatie en kweek van KC's uit volwassen dorsale huid is gerapporteerd na een nacht trypsine digestie van de bontvrije huid 15 , wat suggereert dat dispase alleen mogelijk niet voldoende is om folliculaire KC's uit de dermis van de volwassen dorsale huid te extraheren.
In dit protocol werden de primaire KC's gegroeid in laag calciummedium aangevuld met dGS in plaats van het calcium-uitgeputte chelexed-FBS, dat veel gebruikt werd in verscheidene eerder gepubliceerde muis KC-cultuurprotocollen 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. In deze studie bleek dat dGS superieur is aan chelexed FBS om volwassen KC's van volwassen muis te cultiveren en de basale celmorfologie van KC te handhaven ( Figuur 2A ). Het is echter waarschijnlijk dat de effectiviteit van chelexed-FBS Om de basale morfologie van KC te handhaven kan afhangen van de FBS-veelheid die in elke studie wordt gebruikt.
Met behulp van de methoden die hier worden gepresenteerd, bleken we dat zowel de epidermale KC's van de neonatale en volwassen muis gereageerd hebben op hoge calciumgerichte einddifferentiatie, strakke celpuntvorming en stratificatie ( Figuur 1 En figuur 2 ). In het algemeen verhoogt het extracellulaire calciumniveau tot meer dan 0,1 mM de terminale differentiatie van basale KC's 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Er is gemeld dat een intermediair niveau van calcium (0,1-0,16 mM) in hoofdzaak de expressie van vroege differentiatiemarkers zoals K1 en K10 gedurende de eerste 24 uur op calciumschakelaar induceerde, terwijl K1 en K10 slechts in een kleine Fractie cellen wanneer behandeld met hoger calciummedium (1 mM) 19 , 20 . Het hogere calciummedium (≥1 mM) is echter in veel andere studies veel gebruikt om snel KC-stratificatie en de expressie van late differentiatiegenen, zoals INV en LOR 4 , 21 , 22 , 23, te veroorzaken . Gebaseerd op onze ervaring, een tussenliggend niveau van calcium, zoals 0,2 mM CaCl2, tot geleidelijk en langzamer begin van terminale differentiatie, terwijl een hoger calciumgehalte (≥1 mM) aanzienlijk snellere aanvang van KC teRminale differentiatie, wat leidt tot een kortere tijdvenster om de cellulaire veranderingen tijdens de differentiatie te bestuderen. Daarom gebruikten we 0,2 mM CaCl2 KC terminale differentiatie induceren en we hebben aangetoond dat dit tussenproduct calciumniveau tot een geleidelijke verandering van de basale celmorfologie een gelaagde corneocyt morfologie binnen 72 uur nadat het calcium schakelaar (figuur 2B).
Onze groep heeft eerder aangetoond dat epidermale KC's ook een belangrijke rol spelen om inflammatoire reacties op pathogenen of DAMP's vrij te geven tijdens het letsel en / of UVB-bestraling 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . In overeenstemming met die in vivo waarnemingen, we hebben hier aangetoond dat gekweekte volwassen KC's van volwassen muizen zeer gevoelig waren voor UVB-geactiveerde celdood en UVB-behandelde KC's vrijgegeven een groteHoeveelheid TNFa, die een belangrijke inflammatoire cytokine is die het immuunsysteem activeert.
Samenvattend verschaft de primaire muis-epidermische KC-celkweek een bruikbaar in vitro- model om de epidermale barrièrevorming en aangeboren immuunrespons van KC's te bestuderen en de hier beschreven methodes zullen van belang zijn voor onderzoekers die studies uitvoeren op de huid in de neonatale muis als Evenals in de volwassen muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het NATIONALE INSTITUUT VAN ARTHRITIS EN MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 naar Zhang LJ), en National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 tot CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
