Summary
Les kératinocytes épidermiques forment une barrière fonctionnelle de la peau et sont positionnés à la ligne de front de la défense de l'hôte contre les insultes environnementales externes. Nous décrivons ici des méthodes d'isolement et de culture primaire de kératinocytes épidermiques provenant de peau de souris néonatale et adulte, et l'induction de la différenciation terminale et la réponse inflammatoire déclenchée par les UVB des kératinocytes.
Abstract
Le kératinocyte (KC) est le type de cellule prédominante dans l'épiderme, la couche la plus externe de la peau. Les KC épidermiques jouent un rôle essentiel dans la défense de la peau en formant une barrière cutanée intacte contre les insultes environnementales, telles que l'irradiation UVB ou les agents pathogènes, et aussi en déclenchant une réponse inflammatoire à ces insultes. Nous décrivons ici des méthodes pour isoler les KC de la peau néonatal de la souris et de la peau de queue de souris adulte. Nous décrivons également des conditions de culture utilisant des suppléments de croissance définis (dGS) par rapport au sérum bovin fœtal chelexé (cFBS). Fonctionnellement, nous montrons que les KC néonatals et adultes répondent très bien à une différenciation terminale élevée due au calcium, à une formation de jonction étroite et à une stratification. En outre, les KC adulte cultivés sont sensibles à la mort cellulaire déclenchée par les UVB et peuvent libérer de grandes quantités de TNF lors de l'irradiation UVB. Ensemble, les méthodes décrites ici seront utiles aux chercheurs pour la mise en place d'un modèle in vitroS pour étudier la biologie épidermique chez la souris néonatal et / ou la souris adulte.
Introduction
La peau est le plus grand organe du corps avec l'épiderme comme couche extérieure. L'épiderme joue un rôle essentiel dans la formation d'une barrière épidermique intacte pour séparer le corps de l'environnement et empêche ainsi la perte d'eau et protège contre les insultes environnementales telles que les allergènes, les agents pathogènes et l'exposition aux UVB. L'épiderme se développe à partir d'une seule couche de kératinocytes basaux indifférenciés (KC) en un épithélium stratifié multicouches constitué d'une couche basale, suivie d'une couche épineuse, d'une couche granulaire et d'un stratum corneum. Les KC basales, constituées à la fois par des cellules souches épidermiques et par des cellules amplificatrices de transit, sont prolifératives et indifférenciées. À mesure que les KC basal sortent du cycle cellulaire, les cellules s'engagent à se différencier et migrent progressivement vers la surface de l'épiderme, accompagnées de la maturation des jonctions cellule-cellule et de la formation d'une barrière de perméabilité épidermique (EPB). Les KC à la couche épineuse expriment des différences précocesMarqueurs d'ions tels que la kératine 10 (K10); Lorsque les KC migrent vers la couche granulaire, les cellules expriment des marqueurs de différenciation tardive tels que Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) et Involucrin (INV). À la stratum corneum, les KC deviennent des cornéocytes terminés en différé, qui sont finalement rejetés par desquamation à mesure que de nouvelles cellules les remplacent.
Le calcium est considéré comme l'agent le plus physiologique dans l'épiderme et déclenche une différenciation in vitro et in vivo d'une manière similaire. Dans l'épiderme cutané normal, les ions calcium forment un «gradient de concentration» caractéristique, augmentant en concentration vers la surface de la peau 1 , 2 , 3 . La concentration de calcium provient de niveaux faibles dans les sous-couches les plus basses (couches basales et épineuses) jusqu'à un pic dans la couche granulaire supérieure, puis tombe à des niveaux négligeables dans la couche la plus superficielle (stratum corneum). Le gradient de calcium se développe également de manière coïncidente avec l'émergence d'une barrière de perméabilité des composants, qui soutient que la signalisation de calcium joue un rôle essentiel dans la différenciation KC. In vitro , le faible calcium (0,02-0,1 mM) maintient la prolifération des KC basiques comme monocouche, alors que le calcium élevé (> 0,1 mM) induit un engagement rapide et irréversible des cellules à la différenciation terminale, comme en témoigne la formation et l'induction de la jonction étroite De LOR et INV sur un traitement de calcium élevé aux KC basiques 4 , 5 .
En plus de la formation de barrière, les KC épidermiques sont également un élément important du système immunitaire inné de la peau. En réponse à des agents pathogènes ou à des modèles moléculaires associés endommagés (DAMP) libérés lors d'une irradiation ou d'une lésion UVB, les KC peuvent produire de grandes quantités de cytokines inflammatoires, telles que TNFα, IL6 et IFNβ, conduisant à une activation du système immunitaire> 6 , 7 , 8 , 9 . Bien qu'une signalisation inflammatoire appropriée des KC soit requise pour le dépistage des agents pathogènes, une réponse inflammatoire incontrôlée peut déclencher le développement de maladies de la peau auto-inflammatoires, telles que le psoriasis et la rosacée 6 , 8 .
Dans l'ensemble, les KC jouent un rôle essentiel dans le maintien de la barrière cutanée intacte et l'initiation d'une réponse immunitaire contre l'invasion des agents pathogènes ou les insultes environnementales. Par conséquent, la culture primaire des KC épidermiques est une technique utile pour étudier la biologie épithéliale, la différenciation KC, ainsi que les réponses immunitaires innées stimulées par KC. L'isolement et la culture des KC épidermiques primaires de souris peuvent être un processus difficile en raison de la sensibilité et de la sensibilité de KC à divers stimulants externes. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler et culture-KC de la peau néonatal de la souris ouPeau de queue de souris adulte. Pour l'isolement KC pour adultes, nous n'utilisons pas la peau dorsale de la souris car l'isolement de quantités suffisantes de KC viables à partir de ce tissu peut être difficile pour les raisons suivantes: Premièrement, la peau dorsale adulte à la phase de repos du cycle des cheveux (telogène) se compose d'un Épiderme mince avec seulement 1-2 couches de cellules, conduisant à un faible rendement cellulaire et une séparation inefficace de l'épiderme du derme, étape cruciale pour l'isolement KC réussi. Deuxièmement, la densité du follicule capillaire élevée sur la peau dorsale adulte contribue davantage à la difficulté à séparer l'épiderme du derme. Au lieu de cela, nous utilisons systématiquement la peau de la queue comme source de KC de souris adultes car cet épithélium est plus épais avec 3 à 5 couches de KC épidermiques. Il a également une densité de follicule capillaire plus faible, ce qui n'interfère pas avec la séparation épidermique, ce qui permet l'isolement KC de toute peau de queue de souris adulte, quel que soit l'âge et le stade de cyclisme des cheveux de la souris. La neona isoléeLes KC sont ensemencés dans des plats de culture revêtus de gélatine, tandis que les plats revêtus de collagène sont utilisés pour semer des KC adultes isolés en raison de la capacité altérée des cellules adultes à adhérer par rapport à leurs homologues néonatals. Pour la culture de KC de souris, le milieu basal de calcium faible est complété par dGS, qui contient le facteur de croissance épidermique (EGF), la transferrine bovine, le facteur de croissance analogue à l'insulinec1 (IGF1), la prostaglandine E2 (PGE2), l'albumine de sérum bovin (BSA) et l'hydrocortisone. Entre 2 à 4 jours après le plaquage initial, la plupart des KC différenciés peuvent être éliminés pendant les changements quotidiens du milieu, et les cellules adhérentes restantes présentent une morphologie typique en cobond 4 , prolifèrent et n'expriment pas le marqueur de différenciation précoce K10.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'UCSD.
1. Isolation et culture primaire de la souris KC contre la peau néonatale
- Sacrifiez les néonats post-nés 0-2 de la souche de souris de type sauvage C57B / 6 par décapitation à l'aide de ciseaux. Coupez les membres juste au-dessus des articulations du poignet et de la cheville, puis coupez complètement la queue, laissant un petit trou.
- Pour éplucher toute la peau, insérez d'abord des ciseaux tendus à travers le trou à la queue et coupez la peau le long de la ligne médiane dorsale du corps jusqu'à l'ouverture sur le cou. Ensuite, utilisez une pince pour saisir le corps exposé et l'autre pince pour saisir la peau et éplucher doucement la peau entière du corps et sur les souches de la jambe avec un mouvement continu.
- Épluchez la peau comme une pièce intacte et faites attention de ne pas casser la peau en morceaux, car cela entraînera une perte de cellule pendant l'étape de la dispase.
<Li> Rincer la peau pelée avec 15 ml de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm, puis placer la peau de chaque chiot dans un tube de 2 ml rempli de tampon de digestion à base de glace, contenant 4 mg / ml de dispase dans du milieu de croissance KC (Le milieu basal KC a 0,06 mM CaCl 2 , dGS et antibiotiques / antimycotiques). - Assurez-vous que la peau n'est pas pliée dans le tube, car cela entraînera une exposition insuffisante de la région pliée à la solution dispersée.
- Le lendemain (après 12-18 h dans le dispase), transférez la peau avec la solution de dispase dans une boîte de Petri. Transférer chaque morceau de tissu dans une nouvelle boîte de Petri avec 15 ml de PBS stérile pour éliminer les excès de dispase.
- En utilisant deux paires de pinces, saisissez la peau de PBS,Soulève la peau et transfère à une nouvelle boîte de Petri avec le côté épidermique vers le bas et le derme vers le haut. Étendez soigneusement les plis de la peau afin de l'étendre complètement sur la boîte de Petri.
- Placez 500 μL d'une solution de digestion à base de trypsine pour chaque peau dans une nouvelle boîte de Petri. À l'aide d'une pince, soulevez lentement le derme et éloignez-vous de l'épiderme, tout en maintenant l'épiderme vers le bas. Éliminer le derme sous forme de matériau dangereux pour la santé. Transférer l'épiderme séparé et flotter sur chaque goutte de solution de trypsine avec la couche basale vers le bas.
- Si l'épiderme est plié sur la solution de trypsine, éliminer les plis à l'aide d'une pince pour assurer une digestion efficace des KC basiques de l'épithélium.
- Incuber la peau sur une boîte de Petri dans une solution de trypsine à température ambiante (avec le couvercle recouvert) sur un agitateur horizontal avec agitation douce pendant 20 min.
- Ajouter 2 ml de milieu de croissance KC additionné par épiderme (environ 1 pouce carré de taille parÉpiderme) à la boîte de Petri. Saisissez l'épiderme à l'aide d'une pince et frottez vigoureusement l'épiderme d'avant en arrière pour libérer des cellules individuelles de la feuille épidermique.
- Regardez le milieu devenir de plus en plus trouble car les cellules sont détachées de l'épiderme. Inclinez la boîte de Petri pour collecter et transférer la suspension de cellules dans un nouveau tube en laissant la feuille épidermique restante sur le plat.
- Répétez encore deux fois le frottement de la feuille épidermique après avoir ajouté 2 mL de milieu de croissance KC et combinez les suspensions de cellules dans le même tube.
- Pipeter doucement la solution cellulaire à plusieurs reprises pour casser les bourrelets cellulaires à l'aide de la pipette sérologique appropriée, puis passer à travers un filtre de 100 μm dans un nouveau tube de centrifugation de 50 ml.
- Centrifuger les cellules filtrées pendant 5 min à 180 x g.
- Aspirer le surnageant et restreindre doucement le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de croissance / épiderme de KC froid.
- Comptez les cellules par un hémocytomètre.
- Graisser les cellules à une densité de 5 x 10 4 / cm 2 dans un milieu de croissance KC dans des boîtes de culture pré-revêtues d'un produit de matrice extracellulaire (ECM) qui favorise la fixation des cellules.
REMARQUE: Nous utilisons un produit commercial disponible (p. Ex. Facteur de fixation, qui est un matériau de revêtement à base de gélatine (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C et du milieu frais Réapprovisionné tous les deux jours.- Pour revêtir, revêtir les boîtes de culture avec le matériau de revêtement de fixation de la cellule réchauffé à température ambiante pendant 10 min à 2 h avant l'ensemencement cellulaire. Supprimer le facteur de fixation juste avantEn ajoutant la suspension cellulaire.
- Changez le milieu 24 h après le placage initial pour éliminer les cellules non attachées, et changez le milieu tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence souhaitée avant l'expérience.
REMARQUE: Plusieurs isolats de peau peuvent être combinés et incubés dans un tube de 15 mL (jusqu'à 5 peaux par tube) contenant 12 ml de solution dispersée. Incuber le tube de peau pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 ° C sur un rotateur.
2. Isolation primaire de la souris KC de la peau de queue adulte
- Sacrifiez une souris C57BL / 6 adulte (de préférence entre 6-15 semaines d'âge, soit mâle, soit femelle) selon la réglementation des installations animales. Coupez la queue hors du corps à partir de la base de la queue et coupez ~ 2 mm de la pointe de la queue de sorte qu'il y ait un trou visible à la pointe.
- Pour éplucher la peau de la queue, utilisez d'abord une lame tranchante pour couper la peau de la queue de la base à la pointe de la queue. Ensuite, utilisez une pince pour saisir l'os de la queue exposée et l'autre pince pour saisir la peau et éplucher doucement la peau de la queue de l'os avec un mouvement continu. Couper la peau pelée du milieu de la ligne afin que chaque pièce soit moins longue de 2-3 cm.
- Rincer l'esprit de peau peléeH 15 ml de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm, puis placer la peau de chaque queue dans un tube de 2 ml rempli de tampon de digestion à base de glace (dispase de 4 mg / ml dans un milieu de croissance KC).
REMARQUE: Plusieurs morceaux de peau peuvent également être combinés et incubés dans un tube de 15 ml (jusqu'à 5 queues par tube) contenant 12 ml de solution dispersée.- Incuber le tube de peau pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 ° C sur un rotateur.
- Effectuez les étapes 1.4 à 1.13 pour isoler la suspension de cellule unique de l'épiderme de la queue.
- Graisser les cellules adultes à une densité de 10 x 10 4 / cm 2 (compté par un hématocytomètre) en milieu de croissance KC dans des boîtes de culture pré-revêtues de collagène.
REMARQUE: Nous utilisons un kit de revêtement à base de collagène disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C, et le milieu frais a été reconstitué tous les deux jours. En général, le cLes plats d'ulture devraient être revêtus de collagène pendant 30 minutes à 1 heure avant l'ensemencement cellulaire. Nous observons qu'il existe une amélioration significative de la fixation KC adulte dans le plat lorsqu'il est revêtu de collagène par rapport au facteur de fixation, qui est un matériau de revêtement à base de gélatine. - Changez le milieu 24 h après le placage initial pour éliminer les cellules non attachées, et changez le milieu tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence souhaitée avant l'expérience.
3. La différenciation in vitro des KC par le calcium élevé
- Pour induire une différenciation terminale, ajouter du CaCl 2 à 0,2 mM dans le milieu de culture.
- Alternativement, affamer les KC cultivés pendant la nuit sans addition de suppléments de croissance dans un milieu basal KC à faible teneur en calcium avant l'addition de calcium élevé.
NOTE: La famine du facteur de croissance améliorera l'engagement des cellules dans la différenciation précoce et l'induction de marqueurs de différenciation précoce, tels que K10 5
4. Mortalité cellulaire médiatisée par irradiation UVB et sortie TNFα des KC
- Culturez les KC de la souris dans le milieu de croissance KC (dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C) avec un changement de milieu quotidien jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence. Immédiatement avant l'irradiation UVB, retirer le milieu de croissance et remplacer par 500 μL de PBS. Ensuite, soumettez les cellules à 25 mJ / cm 2 UVB ou à la commande simulée (sans UVB).
NOTE: L'irradiation UVB est réalisée à l'aide de lampes UVB portables avec deux ampoules de 8 W (312 nm) comme décrit précédemment 10 . Après irradiation UVB, le PBS est aspiré et le milieu frais est ajouté. - Mesurer et quantifier la viabilité cellulaire par le dosage de la cellule CCK-8 à 6, 8 et 24 heures après traitement UVB suivant les instructions du fabricant 11 .
- Recueillir le milieu conditionné des KC traités avec UVB aux points de temps souhaités et mesurer le TNFα libéréDans le milieu conditionné par le kit ELISA Mouse TNF (Mono / Mono) suivant les instructions 7 , 12 du fabricant.
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Representative Results
La différenciation terminale induite par le calcium élevé des KC néonatals et adultes. L'épiderme de souris primaire KCs plaquée et maintenue à 0,06 mM de CaCl 2 a augmenté en monocouche, et les cellules individuelles ont une forme polygonale avec un espace intercellulaire distinct, montrant un aspect pavimenteux lorsque confluentes (figure 1A et la figure 2A). L'élévation du CaCl 2 à 0,2 mM induit un changement de morphologie rapide des cellules. Dans les 8 h après l'interruption du calcium élevé, les cellules se sont aplaties et l'espace intercellulaire distinct est devenu moins apparent et, 24 h, l'adhérence cellule-cellule avec des jonctions étroites devient évidente ( figure 1A et figure 2B ). La formation de l'enveloppe cellulaire cornifiée et la stratification cellulaire verticale ont commencé environ 48-72 h après l'interruption du calcium élevé ( figure 2B). Pour analyser le remodelage d'actine et la formation de jonction de cellule cellulaire lors du changement de calcium élevé, les KC traitées avec CaCl 2 0,2 mM ont été colorées avec de la phalloidine ( Figure 1B ) pour mesurer le remodelage d'actine pendant la différenciation KC 13 . La formation des projections filopodiques riches en fibres d'actine entre les cellules adjacentes a été détectée dès 3 heures après l'échange de calcium et le remodelage de la fibre d'actine progressait encore entre 6-24 h et de 48 h la stratification cellulaire devint importante ( figure 1B ).
Susceptibilité des KC de souris à la mort cellulaire déclenchée par les UVB et à la libération de TNFα . Les KC de souris adultes cultivés ont été exposés à une irradiation UVB de 25 mJ / cm 2 , et la viabilité cellulaire et le TNFα libérés dans le milieu de culture ont été analysés. Comme le montrent les images de contraste de phase ( FiguRe 3A), ainsi que le test de viabilité cellulaire ( Figure 3B ), l'UVB a déclenché une mort dépendant du temps des KC. Par 24 h, la majorité des cellules étaient arrondies et détachées du plat ( figure 3A ). Comme quantifié par le test de viabilité cellulaire, ~ 90% des cellules étaient mortes dans les 24 h après le traitement UVB ( Figure 3B ; p <0,001 calculé par un test de comparaison multiple ANOVA unidirectionnel). Enfin, nous avons montré que le TNFα, une cytokine importante induite par les UVB et qui entraîne l'apoptose KC suite à l'irradiation UVB 14 , a été sécrété abondamment (~ 250 pg / mL dans les 24 h après l'irradiation UVB; p <0,001) dans le milieu de culture de KC traités par UVB de manière dépendante du temps ( figure 3C ).
Figure 1: culture primaire de KC de souris néonatale et différenciation de terminal induite par un apport élevé en calcium et formation de jonction cellule-cellule serrée. ( A ). Les KC primaires de souris néonatales ont été traités avec du calcium élevé (CaCl 2 0,2 mM) et des images de contraste de phase au grossissement 4X ont été prises à 0 heure (ctrl) et à 8 h après le traitement. Barre d'échelle = 100 μm. ( B ). Les KC néonatals ont été différenciés en présence de CaCl 2 0,2 mM et les cellules ont été colorées avec de la phalloidine (rouge) pour visualiser la formation de projections filopodiales riches en fibres d'actine entre les cellules adjacentes lors de la différenciation. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI, et les fibres d'actine ont été colorées avec de la phalloidine à la rhodamine. Barre d'échelle = 25 μm. Les images ont été prises à un grossissement de 20X à l'aide d'un microscope à fluorescence réglé sur le canal DAPI (pour la coloration des noyaux) et le canal RFP (pour la coloration de l'actine). Lank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Culture primaire et différentiation des terminaux induits par le calcium élevé des KC de souris adultes. ( A ). Les images de contraste de phase au grossissement 10x des KC de souris adultes primaires à 8 h, 1 jour, 2 jours et 3 jours après le placage initial. Le panneau supérieur représente les cellules cultivées en dGS, et le panneau inférieur représente les cellules cultivées dans 10% de FBS chelexé (cFBS) avec 8 ng / ml d'EGF recombinant de souris. Barre d'échelle = 100 μm. ( B ). Les KC de souris adultes confluents ont été différenciés en présence de CaCl 2 0,2 mM, et des images de contraste de phase au grossissement 10X ont été prises à 0 (ctrl), 8, 24, 48 et 72 h après un échange de calcium élevé. Barre d'échelle = 100 μm.Nk "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Culture primaire de KC de souris adultes et Susceptibilité des KC adultes à la mort cellulaire induite par UVB et à la libération de TNFα. Les KC de souris adultes primaires ont été cultivés en confluence, puis exposés à une irradiation UVB de 25 mJ / cm 2 . ( A ) Les images de contraste de phase au grossissement 10X prises à 12 et 24 heures après l'exposition aux UVB ont montré une mort cellulaire induite par UVB dépendant du temps. Barre d'échelle = 100 μm. ( B ) La viabilité cellulaire a été quantifiée par l'essai de viabilité cellulaire CCK-8 à 6, 8 et 24 heures après traitement UVB. ( C ) La libération induite par UVB de TNFα sur le milieu aux points de temps indiqués a été mesurée par ELISA. Toutes les barres d'erreur indiquent une moyenne ± SEM. Les valeurs p ont été calculées par comparaison multiple ANOVA à sens uniqueTest (***, p <0.001) Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'épiderme de la peau fonctionne comme une barrière critique pour séparer et protéger le corps de l'environnement extérieur et des dommages causés par la perte d'eau, les agents pathogènes, la chaleur et l'irradiation UV. Les KC sont la lignée cellulaire prédominante de l'épiderme, et la culture primaire de KC épidermiques est un outil utile pour étudier et comprendre les processus biologiques de formation de barrière et la réponse des KC aux insultes environnementales in vitro .
Nous décrivons ici des méthodes d'isolement et de culture des KC épidermiques primaires de la peau de souris néonatale et adulte. Alors que les KC de souris primaires peuvent être commodément isolés à partir de peau de souris néonatale, l'isolement et la culture réussie des KC adultes sont considérés comme difficiles en raison de l'amincissement de l'épiderme et de la densité du follicule capillaire élevé de la peau dorsale de souris adulte. La méthode décrite ici utilise la peau de queue de souris adulte comme une source pratique et abondante de KC basal. En raison de la présence d'un épiderme épais et faible Densité du follicule capillaire dans la peau de la queue, l'étape critique consistant à isoler les KC en séparant l'épiderme du derme devient réalisable après la digestion de la peau de la queue pendant la nuit. En revanche, notre tentative d'isoler les KC de la peau dorsale adulte en utilisant ce protocole n'a pas réussi, ce qui a entraîné un faible taux de cellules après l'isolement et une faible fixation des cellules après le placage. Cependant, l'isolement et la culture réussis des KC provenant de la peau dorsale chez l'adulte ont été signalés après une digestion de la peau de la trypsine pendant la nuit 15 , ce qui suggère que le dispase seul peut ne pas être suffisant pour extraire des KC folliculaires du derme de la peau dorsale adulte.
Dans ce protocole, les KC primaires ont été développés dans un milieu faible en calcium complété par dGS au lieu du FBS chelexé appauvri en calcium, qui a été largement utilisé dans plusieurs protocoles de culture de souris KC 4 , 15 précédemment publiés , "> 16 , 17 , 18. Dans cette étude, nous avons observé que dGS est supérieur au FBS chelexé pour cultiver des KC de souris adultes et pour maintenir la morphologie basale de KC ( Figure 2A ). Cependant, il est probable que l'efficacité de FBS chelexé Pour maintenir la morphologie basale de KC peut dépendre du lot de FBS utilisé dans chaque étude.
En utilisant les méthodes présentées ici, nous avons démontré que les KC épidermiques de souris néonatales et adultes ont répondu à une différenciation terminale déclenchée par un calcium élevé, une formation de jonction et une stratification étanches ( figure 1 Et la figure 2 ). En général, l'élévation du taux de calcium extracellulaire à plus de 0,1 mM déclenche la différenciation terminale des KC basiques 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Il a été rapporté qu'un taux intermédiaire de calcium (0,1- 0,16 mM) induit essentiellement l'expression de marqueurs de différenciation précoce, tels que K1 et K10, pendant les 24 premières heures après le changement de calcium, alors que K1 et K10 ne sont induits que dans un petit Fraction de cellules lorsqu'elles sont traitées avec un milieu calcique plus élevé (1 mM) 19 , 20 . Cependant, le milieu calcique supérieur (≥1 mM) a été largement utilisé dans de nombreuses autres études pour induire rapidement et de manière robuste la stratification KC et l'expression de gènes de différenciation tardive, tels que INV et LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Sur la base de notre expérience, un niveau intermédiaire de calcium, tel que le CaCl 2 0,2 mM, entraîne un début progressif et plus lent de la différenciation terminale, alors qu'un taux de calcium plus élevé (≥1 mM) accélère considérablement l'apparition de KC teLa différenciation des rminels, conduisant à une fenêtre de temps plus courte pour étudier les changements cellulaires au cours de la différenciation. Par conséquent, nous avons utilisé 0,2 mM de CaCl 2 pour induire la différenciation des terminaux KC, et nous avons montré que ce niveau intermédiaire de calcium a entraîné un changement graduel de la morphologie basocellulaire vers une morphologie des cornéocytes stratifiés dans les 72 h après l'interruption du calcium ( figure 2B ).
Notre groupe a déjà démontré que les KC épidermiques jouent également un rôle important pour initier des réponses inflammatoires aux agents pathogènes ou aux DAMP libérés lors d'une blessure et / ou d'une irradiation UVB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . En cohérence avec les observations in vivo , nous avons montré que les KC de souris adultes cultivés étaient très sensibles à la mort cellulaire déclenchée par les UVB et que les KC traités par UVB ont libéré une grandeQuantité de TNFα, qui est une cytokine inflammatoire clé qui active le système immunitaire.
En résumé, la culture de cellules KC épidermiques de souris primaires fournit un modèle in vitro utile pour étudier la formation de barrière épidermique et la réponse immunitaire innée des KC, et les méthodes décrites ici intéresseront les chercheurs qui poursuivent des études en biologie cutanée chez la souris néonatal comme Ainsi que dans la souris adulte.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'octroi de l'INSTITUT NATIONAL DE L'ARTHRITE ET DES MALADIES MUSCULOSKÉLÉTIQUES ET DE LA PEAU (R01AR069653 à Zhang LJ) et des National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 à CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
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