Summary
אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.
Abstract
הקרטינוציטים (KC) הוא סוג התא השולט באפידרמיס, השכבה החיצונית ביותר של העור. לקרני אפידרמיס תפקיד קריטי במתן הגנה על העור על ידי יצירת מחסום עור שלם נגד עלבונות סביבתיים, כגון קרינה UVB או פתוגנים, וכן על ידי ייזום תגובה דלקתית על עלבונות אלה. כאן אנו מתארים שיטות לבודד KCs מעכבר העכבר הילוד ומבוגר העור זנב העכבר. כמו כן, אנו מתארים תנאים מתרבים באמצעות תוספי תזונה מוגדרים (dGS) בהשוואה לסרום של שור עוברית (cFBS). באופן פונקציונלי, אנו מראים כי הן Kons ניאונטליים ומבוגר הם מגיבים מאוד להבדיל גבוהה סידן המושרה מסוף, הצומת הצומת הדוק ריבוד. בנוסף, KCs מבוגר תרבותי רגישים למוות התא מופעלת UVB והוא יכול לשחרר כמויות גדולות של TNF על קרינה UVB. יחד, השיטות המתוארות כאן יהיה שימושי לחוקרים עבור ההתקנה של מודל במבחנהS ללמוד ביולוגיה האפידרמיס בעכבר הילוד ו / או העכבר הבוגר.
Introduction
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף עם האפידרמיס כמו השכבה החיצונית ביותר. האפידרמיס משחק תפקיד קריטי ביצירת מחסום אפידרמיס שלם כדי להפריד את הגוף מן הסביבה, ובכך מונע אובדן מים ומספק הגנה מפני עלבונות סביבתיים, כגון אלרגנים, פתוגנים וחשיפה UVB. האפידרמיס מתפתח משכבה אחת של קרטינוציטים בסיסיים לא מובחנים (KC) לתוך שכבת ביצה מרובת שכבות המורכבת משכבה בסיסית, ואחריה שכבה ספינית, שכבה גרגרנית ושכבת שכבה. KCs Basal, המורכב משני תאי גזע האפידרמיס ותאי הגברה טרנזיט, הם שגשוג ולא מובחן. כמו KCs בסיסית לצאת מחזור התא, התאים להתחייב להבחנה בהדרגה נודדים לעבר פני השטח של האפידרמיס, מלווה התבגרות של תאים סלולריים צמתים ויצירת מחסום חדירות epidermal (EPB). KCs על שכבת spinous להביע מוקדם differiatיונים כגון קראטין 10 (K10); כמו KCs נודדים לשכבה פרטנית, התאים להביע סמנים הבחנה מאוחר כגון Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) ו Involucrin (INV). בשכבת הקרנית, ה- KC הופכים לקרניאוציות מובחנות סופיות, אשר בסופו של דבר לשפוך באמצעות desquamation כמו תאים חדשים להחליף אותם.
סידן נחשב סוכן פיזיולוגי ביותר האפידרמיס ומפעיל differiation במבחנה in vivo באופן דומה. ב עור רגיל אפידרמיס, יוני סידן טופס אופייני "ריכוז שיפוע", הגדלת הריכוז לעבר פני העור 1 , 2 , 3 . ריכוז הסידן עולה מרמות נמוכות בשכבות המשנה התחתונות (שכבות בסיסיות וספיןיות) לשיא בשכבה הגרעינית העליונה ולאחר מכן יורד לרמות זניחות בשכבה השטחית ביותר (שכבת הקרנית). הסידן שיפוע גם מפתחת מקריות עם הופעתה של מחסום חדירות רכיב, אשר תומך כי סידן איתות משחק תפקיד קריטי של בידול KC. במבחנה , סידן נמוך (0.02-0.1 מ"מ) שומר על התפשטות של KCs בסיסי כמו monolayer, ואילו סידן גבוהה (> 0.1 מ"מ) גורם למחויבות מהירה בלתי הפיך של התאים לבידול הטרמינל כפי שהוכח על ידי הצומת הצומת הדוק אינדוקציה של LOR ו INV על טיפול סידן גבוהה על בסיס KCs 4 , 5 .
בנוסף היווצרות המכשול, KCs האפידרמיס הם גם מרכיב חשוב של מערכת החיסון המולדת של העור. בתגובה לפתוגנים או לדפוסים מולקולאריים פגומים (DAMP) שפורסמו על קרינה UVB או פגיעה, KCs יכול לייצר כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNFα, IL6 ו IFNβ, המוביל ההפעלה המערכת החיסונית> 6 , 7 , 8 , 9 . למרות איתות דלקתיות נכון מ KCs נדרש פינוי הפתוגן, תגובה דלקתית בלתי מבוקרת עלולה לגרום להתפתחות של מחלות עור דלקתיות אוטומטי, כגון פסוריאזיס ו רוזצצה 6 , 8 .
בסך הכל, KCs לשחק תפקיד חיוני בשמירה על מחסום עור שלם ויזום תגובה חיסונית על פלישה הפתוגן או עלבונות סביבתיים. לכן, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס היא טכניקה שימושית ללמוד ביולוגיה אפיתל, בידול KC, כמו גם KC- מגורה תגובות החיסון המולדת. הבידוד והתרבות של KCs האפידרמיס העכבר הראשוני יכול להיות תהליך מאתגר בשל רגישות של KC ורגישות גירויים חיצוניים שונים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד KCs תרבות מעכבר העכבר neonatal אועכבר מבוגר זנב עור. עבור בידוד KC מבוגר, אנחנו לא משתמשים בעור הגב של העכבר כי בידוד כמויות מספיקות של קייסי קיימא מ רקמה זו יכולה להיות קשה מהסיבות הבאות: ראשית, העור הגבי בוגר בשלב המנוחה של מחזור השיער (טלוגן) מורכב רזה עם רק 1-2 שכבות של תאים, המוביל תשואה תא נמוך הפרדה יעילה של האפידרמיס מן הדרמיס, המהווה את השלב הקריטי לבידוד KC מוצלח. שנית, צפיפות זקיקי השיער הגבוהה הקיימת על עור הגב הבוגר תורמת עוד יותר לקושי בהפרדת האפידרמיס מהדרמיס. במקום זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי בעור הזנב כמקור למקלטי עכבר בוגרים כמו אפיתל זה הוא עבה עם 3-5 שכבות של KCs האפידרמיס. כמו כן, יש צפיפות זקיקי השיער התחתונה, אשר אינו מפריע ההפרדה האפידרמיס, ובכך המאפשר בידוד KC מכל זנב העכבר העכבר הבוגר ללא קשר לגיל ואת שלב רכיבה על השיער של העכבר. הניאונה המבודדתKCs טל הם seeded כדי מנות מצופה ג 'לטין תרבות, ואילו קולגן מצופה מנות משמשים זרע מבוגר KCs מבוגר בשל יכולת לקויה של התאים הבוגרים לדבוק לעומת עמיתים הילודים שלהם. לתרבית KS של עכבר תרבותית, בינוני נמוך של סידן בסלמי הוא בתוספת dGS, המכיל גורם לגדילה באפידרמיס (EGF), העברת שור, גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGF1), פרוסטגלנדין E2 (PGE2), אלבומין בסרום של שורש (BSA) והידרוקורטיזון. בין 2-4 ימים לאחר ציפוי הראשוני, רוב KCs מובחן ניתן לשטוף משם במהלך שינויים יומיים יומיים, ואת התאים חסיד הנותרים להראות מורפולוגיה מרוצף טיפוסי 4 , הם מתרבים, ואינם מבטאים את סמן K10 מוקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי UCSD מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.
1. עכבר ראשי KC בידוד ותרבות מ עור ניאונטלי
- להקריב את היום שלאחר הלידה 0-2 הילודים מן זן העכבר C57B / 6 wildtype ידי עריפת ראש באמצעות מספריים. חותכים את הגפיים רק מעל מפרק כף היד ו מפרקי, ואז לחתוך את הזנב לחלוטין, משאיר חור קטן.
- כדי לקלף את העור כולו, תחילה להוסיף מספריים חדים דרך החור בזנב לחתוך את העור לאורך קו האמצע הגבי של הגוף לפתיחה על הצוואר. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים אחת כדי לתפוס את הגוף חשוף ואת מלקחיים אחרים לתפוס את העור, בעדינות לקלף את העור כולו מעל הגוף על גדם רגל עם תנועה אחת רציפה.
- לקלף את העור כמו חתיכה אחת שלם ולהיזהר לא לשבור את העור לחתיכות כמו זה יוביל הפסד התא במהלך שלב dispase.
<Li> לשטוף את העור קלופים עם 15 מ"ל של PBS סטרילית בצלחת 10 ס"מ פטרי, ואז למקם את העור מכל גור לתוך צינור 2 מ"ל מלא קר חיץ קר dispase חיץ, אשר מכיל 4 מ"ג / מ"ל dispase במדיום צמיחה KC (בינוני בסיס KC יש 0.06 מ"מ CaCl 2 , dGS, אנטיביוטיקה / antimycotics). - ודא כי העור אינו מקופל בצינור כמו זה יגרום החשיפה מספיק של האזור מקופל לפתרון dispase.
- ביום הבא (לאחר 12-18 שעות ב dispase), להעביר את העור יחד עם פתרון dispase לתוך צלחת פטרי. מעבירים כל פיסת רקמה צלחת פטרי חדש עם 15 מ"ל סטרילי PBS לשטוף משם dispes עודף.
- באמצעות שני זוגות מלקחיים, לתפוס את העור מ PBS,להרים את העור, ולהעביר לצלחת פטרי חדשה עם הצד האפידרמי למטה ואת הצד dermis למעלה. בזהירות למתוח את העור מתקפל כך שהוא המורחבת במלואה על צלחת פטרי.
- מקום 500 μL של פתרון העיכול מבוסס טריפסין לכל העור בצלחת פטרי חדש. בעזרת מלקחיים, לאט להרים את הדרמיס למעלה מן האפידרמיס, תוך החזקת האפידרמיס למטה. להשליך את הדרמיס כחומר biohazardous. מעבירים את האפידרמיס מופרדים לצוף על כל טיפה של פתרון טריפסין עם השכבה הבסיסית כלפי מטה.
- אם האפידרמיס מקופל על הפתרון טריפסין, להסיר את כל הקפלים באמצעות מלקחיים כדי להבטיח עיכול יעיל של KCs הבסיסית מן האפיתל.
- דגירה את העור על צלחת פטרי פתרון טריפסין בטמפרטורת החדר (עם מכסה מכוסה) על שייקר אופקי עם תסיסה עדינה במשך 20 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של תוספת KC בינוני צמיחה לכל האפידרמיס (כ 1 אינץ 'מרובע בגודל לכלהאפידרמיס) לצלחת פטרי. לתפוס את האפידרמיס באמצעות מלקחיים, ולשפשף במרץ את האפידרמיס קדימה ואחורה כדי לשחרר תאים בודדים מהגיליון אפידרמיס.
- צפה בינוני להפוך יותר ויותר עכירות כמו תאים מנותקים האפידרמיס. להטות את צלחת פטרי לאסוף ולהעביר את ההשעיה תא לצינור חדש עוזב את גיליון האפידרמיס הנותרים על המנה.
- חזור על שתי פעמים יותר את שפשוף של גיליון האפידרמיס לאחר הוספת 2 מ"ל KC בינוני צמיחה, ולשלב את המתלים התא באותה צינור.
- Pipet הפתרון התא מעלה ומטה בעדינות כמה פעמים כדי לשבור את כל גושי התא באמצעות פיפטה סרולוגית המתאימים, ולאחר מכן להעביר אותו דרך מסנן 100 מיקרומטר לצינור צנטריפוגות חדש 50 מ"ל.
- צנטריפוגה תאים מסוננים במשך 5 דקות ב 180 x גרם.
- לשאוב את supernatant ו resuspend בעדינות גלולה תא 1 מ"ל קר KC בינוני צמיחה / האפידרמיס.
- ספירת התאים על ידי hemocytometer.
- זרע את התאים בצפיפות של 5 x 10 4 / cm 2 במדיום צמיחה KC בצלחות תרבות מראש מצופה מטריקס תאיים (ECM) מוצר המקדם מצורף התא.
הערה: אנו משתמשים מסחרי זמין (למשל גורם מצורף, שהוא חומר ציפוי ג 'לטין מבוסס (ראה טבלה של חומרים לפרטים) תאים היו מתורבת בחממה humidified עם 5% CO 2 ב 37 ° C, בינוני טרי היו מתחדשת מדי יום ביומו.- עבור ציפוי, מעיל את מנות תרבות עם תא מצורף ציפוי חומר מחומם לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עד 2 שעות לפני זריעת התא. הסר את הגורם המצורף ממש לפניהוספת ההשעיה התא.
- שנה את המדיום 24 שעות לאחר ציפוי הראשוני כדי להסיר תאים ללא התערבות, ולשנות את המדיום היומי עד לתאים להגיע confluency הרצוי לפני הניסוי.
הערה: מספר בודדים העור יכול להיות משולב מודגרות בצינור 15 מ"ל אחד (עד 5 עורות לכל צינור) המכיל 12 מ"ל של פתרון dispase. דגירה צינור העור לילה במקרר 4 מעלות צלזיוס על rotator.
2. עכבר ראשי KC בידוד מבוגר זנב העור
- להקריב עכבר C57BL מבוגר / 6 (רצוי בין 6-15 שבועות של גיל, או זכר או נקבה) על פי תקנות מתקן בעלי חיים. חותכים את הזנב את הגוף מן הבסיס הזנב, לחתוך ~ 2 מ"מ של קצה הזנב, כך יש חור גלוי בקצה.
- כדי לקלף את הזנב העור, תחילה להשתמש להב חד לחתוך לאורך הזנב העור מהבסיס אל קצה הזנב. לאחר מכן, השתמש אחד מלקחיים לתפוס את עצם הזנב חשוף ואת מלקחיים אחרים לתפוס את העור, בעדינות לקלף את העור הזנב את העצם עם תנועה אחת רציפה. חותכים את העור מקולף מאמצע השורה, כך שכל פיסת הוא פחות מ 2-3 ס"מ.
- שוטפים את שנינות העור המקולףשעה 15 מ"ל של PBS סטרילית בצלחת פטרי 10 ס"מ, ואז למקם את העור מכל זנב לתוך צינור 2 מ"ל מלא קר חיץ קר dispase חיץ (dispes 4 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה KC).
הערה: מספר חתיכות העור יכול גם להיות משולב מודגרת בצינור 15 מ"ל אחד (עד 5 זנבות לכל צינור) המכיל 12 מ"ל של פתרון dispase.- דגירה צינור העור לילה במקרר 4 מעלות צלזיוס על rotator.
- בצע צעדים 1.4 עד 1.13 לבודד את ההשעיה תא בודד מן האפידרמיס הזנב.
- זרע את התאים הבוגרים בצפיפות של 10 x 10 4 / cm 2 (נספר על ידי hematocytometer) במדיום צמיחה KC במאכלים תרבות מראש מצופה קולגן.
הערה: אנו משתמשים זמין מסחרית קולגן מבוסס ציפוי ציפוי (ראה טבלה של חומרים לפרטים). תאים היו מתורבת בחממה humidified עם 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס, בינוני טרי היו מתחדשים כל יום אחר. ככלל, גמנות ulture צריך להיות מצופה קולגן במשך 30 דקות עד 1 שעות לפני זריעת התא. אנו רואים כי יש שיפור משמעותי של מצורף KC מבוגר לצלחת כאשר מצופה קולגן לעומת גורם ההתקשרות, שהוא חומר ציפוי ג 'לטין מבוסס. - שנה את המדיום 24 שעות לאחר ציפוי הראשוני כדי להסיר תאים ללא התערבות, ולשנות את המדיום היומי עד לתאים להגיע confluency הרצוי לפני הניסוי.
3. ב מבחנה vitroiation של KCs על ידי סידן גבוהה
- כדי לעודד בידול מסוף, להוסיף CaCl 2 ל 0.2 מ"מ במדיום התרבות.
- לחלופין, להרעיב את KCs מתורבת בן לילה ללא תוספת תוספי תזונה בינוני סידן נמוך KC בסל לפני תוספת של סידן גבוהה.
הערה: גורם רעב הצמיחה יגביר את מחויבות התא להבדל מוקדם ואת אינדוקציה של סמנים בידול מוקדם, כגון K10 5
4. UVB קרינה מתווך תאים מוות TNFα שחרור מ KCs
- תרבות KCs העכבר במדיום צמיחה KC (ב חממה humidified עם 5% CO 2 ב 37 ° C) עם שינוי בינוני היומי עד התאים להגיע confluency. מיד לפני הקרנה UVB, להסיר את המדיום הצמיחה ולהחליף 500 μL של PBS. ואז הנושא את התאים 25 mJ / cm 2 UVB או מדומה שליטה (לא UVB).
הערה: הקרנה UVB מבוצעת באמצעות מנורות UVB כף יד עם שתי נורות 8 W (312 ננומטר) כפי שתואר לעיל 10 . לאחר הקרנה UVB, PBS הוא aspirated בינוני טרי נוסף. - למדוד לכמת את הכדאיות התא על ידי assay חיית מחמד CCK-8 ב 6, 8, ו 24 שעות שלאחר טיפול UVB בעקבות ההוראה של היצרן 11 .
- איסוף בינוני מותנה מן KCs שטופלו UVB בנקודות הזמן הרצוי למדוד את TNFα שוחררב בינוני מותנה על ידי TNF עכבר (מונו / מונו) ELISA Kit בעקבות הוראות היצרן של 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סידן גבוהה המושרה בידול מסויים של KCs ילודים ומבוגרים. העכבר העיקרי KCs העור אפידר מצופה ומתוחזק ב 0.06 מ"מ CaCl 2 גדל כמו monolayer, תאים בודדים היו צורה מצולע עם שטח בין תאיים שונים, מראה מראה מרובעת כאשר confluent ( איור 1 א ו איור 2 א ). הרמת CaCl 2 ל 0.2 מ"מ גרם שינוי מורפולוגיה מהירה של התאים. בתוך 8 שעות לאחר המעבר הסידן גבוה, התאים הפכו שטוחה ואת שטח בין תאיים מובהק הפך פחות בולט, ועל ידי 24 שעות הידבקות תא סלולרי עם צמתים הדוק הפך ברור ( איור 1 א ו איור 2 ב ). היווצרות המעטפה תא cornific ו ריבוד תא אנכי התחיל סביב 48-72 שעות לאחר מתג הסידן גבוהה ( איור 2 ב). כדי לנתח את האקטין שיפוץ תא תא הצומת הצומת הדוק במהלך מתג הסידן גבוה, KCs שטופלו 0.2 מ"מ CaCl 2 היו מוכתמות עם phalloidin ( איור 1 ב ) כדי למדוד את אקטין שיפוץ במהלך בידול KC 13 . היווצרות הסיבים אקטין עשירים פילופודיאליים בין תאים סמוכים זוהה מוקדם כמו 3 שעות לאחר הסידן לעבור, ואת סיבים אקטין שיפוץ נוסף התקדמה בין 6-24 שעות, ועל ידי 48 שעות ריבוד התא הפך בולט ( איור 1B ).
רגישות של KCs העכבר למוות תאים מופעלת UVB שחרור TNFα . עכברים מתורבתים מבוגרים KC נחשפו 25 הקרנה UVB 2 ס"מ, ו הכדאיות התא TNFα שוחרר במדיום התרבות נותחו. כפי שמוצג על ידי תמונות בניגוד שלב ( איור)Re 3A), כמו גם את הכדאיות התא assay ( איור 3 ב ), UVB מופעלת מוות תלוי זמן של KCs. על ידי 24 שעות, רוב התאים היו מעוגלים מנותקים מן המנה ( איור 3 א ). כפי לכמת על ידי assay הכדאיות התא, ~ 90% של תאים מתו תוך 24 שעות לאחר טיפול UVB ( איור 3B , p <0.001 כפי שחושב על ידי חד כיווני ANOVA השוואה מרובים השוואה). לבסוף, הראינו כי TNFα, ציטוקין חשוב המושרה על ידי UVB ומניע את אפופטוזיס KC לאחר הקרנה UVB 14 , היה מופרש בשפע (~ 250 pg / mL בתוך 24 שעות שלאחר קרינה UVB, p <0.001) במדיום התרבות של UVB שטופלו KCs באופן תלוי זמן ( איור 3 ג ).
דמות 1: תרבות ראשונית של KCs עכבר ילודים, סידן גבוהה Induced מסוף הבחנה ו צמוד תא Cell צומת התהוות. ( א ). KCs עכבר ניאונטליים ראשוניים טופלו בסידן גבוה (0.2 mM CaCl 2 ), ותמונות ניגודיות פאזה בהגדלה של 4X נלקחו בשעה 0 (ctrl) וב 8 שעות לאחר הטיפול. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ב ). NeCatal KCs היו מובחנים בנוכחות 0.2 מ"מ CaCl 2 , והתאים היו מוכתמים עם phalloidin (אדום) כדי להמחיש את היווצרות של סיבים עשירים סיבים פילופודיאליים עשירים בין התאים הסמוכים במהלך בידול. גרעינים היו counterstained עם DAPI, וסיבי אקטין היו מוכתמים עם רודולמין phalloidin. סולם בר = 25 מיקרומטר. התמונות צולמו בהגדלה 20X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוגדר ערוץ DAPI (עבור מכתים גרעיני) וערוץ RFP (עבור מכתים אקטין). Lank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תרבות ראשונית גבוהה סידן מיוצר מסוף הבחנה של KCs העכבר למבוגרים. ( א ). שלב ניגודיות תמונות בהגדלה 10x של KCs העכבר הבוגר העיקרי ב 8 שעות, 1 יום, 2 ימים 3 ימים לאחר ציפוי הראשוני. הפאנל העליון מייצג תאים הגדלים dGS, ואת הפאנל התחתון מייצג תאים הגדלים FBS 10% chlexed (cFBS) עם 8 ng / mL רקומביננטי עכבר EGF. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ב ). עכברים מבוגר עכברים KCs היו מובחנים בנוכחות 0.2 מ"מ CaCl 2 , ו תמונות בניגוד שלב בהגדלה 10X נלקחו ב 0 (ctrl), 8, 24, 48, ו 72 שעות לאחר העברת סידן גבוהה. סולם בר = 100 מיקרומטר.Nk "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תרבות ראשית של KCs העכבר למבוגרים, ואת הרגישות של מבוגרים KCs כדי UVB- המושרה תאים Cell שחרור של TNFα. ראשי KCs העכבר הבוגרים היו מתורבת כדי confluency, ולאחר מכן נחשף 25 mJ / cm 2 קרינה UVB. ( A ) תמונות בניגוד שלב בהגדלה 10X נלקח ב 12 ו 24 שעות לאחר חשיפה UVB הראה זמן תלוי מות תאים UVB. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ב ) הכדאיות התא היה לכמת על ידי assay הכדאיות 8 תאים קיימא ב 6, 8, ו 24 שעות לאחר טיפול UVB. ( C ) שחרור UVB- המושרה של TNFα לתקשורת בנקודות הזמן שצוינו נמדדה על ידי ELISA. כל סרגלי השגיאות מציינים ממוצע ± SEM. P- ערכים חושבו על ידי חד כיווני ANOVA השוואה מרוביםבדיקה (***, p <0.001) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האפידרמיס העור משמש כמכשול קריטי להפריד ולהגן על הגוף מפני הסביבה החיצונית ופגיעה מאובדן מים, פתוגנים, חום וקרינה אולטרה סגולה. KCs הם השושלת התא השלטת של האפידרמיס, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס הוא כלי שימושי ללמוד ולהבין את התהליכים הביולוגיים של היווצרות המכשול ואת התגובה של KCs עלבונות סביבתיים במבחנה .
כאן אנו מתארים שיטות לבודד תרבות KPs אפידרמיס העיקרי מעכבר העכבר הילוד ומבוגרים. בעוד KCs העכבר הראשי יכול להיות מבודדים בנוחות עור העכבר הילוד, בידוד תרבות מוצלחת של KCs מבוגרים נחשבים קשים בשל דילול של האפידרמיס ואת השיער גבוה צפיפות זקן העור הבוגר עור הגב. השיטה המתוארת כאן משתמשת בעור זנב העכבר המבוגר כמקור נוח ושופע של KCs בסיסי. בגלל נוכחות של אפידרמיס עבה נמוך צלקת זקיק השיער בעור הזנב, השלב הקריטי של בידוד KCs על ידי הפרדת האפידרמיס מן הדרמיס הופך ריאלי לאחר לילה dispase העיכול של העור הזנב. לעומת זאת, הניסיון שלנו לבודד KCs מן העור הגבי בוגרים באמצעות פרוטוקול זה לא היה מוצלח, וכתוצאה מכך תשואה תא נמוך לאחר בידוד מצורף התא נמוך לאחר ציפוי. עם זאת, בידוד מוצלח ותרבות של KCs מן העור הגבי הבוגר כבר דיווחו לאחר עיכול טריפסין לילה של העור ללא פרווה 15 , מה שמרמז כי dispase לבד לא יכול להיות מספיק כדי לחלץ KCs הזקיקים מן הדרמיס של העור הגבי הבוגר.
בפרוטוקול זה, KCs העיקרי גדלו בינוני סידן נמוך בתוספת dGS במקום סידן- depleted chlexed- FBS, אשר היה בשימוש נרחב במספר שפורסם בעבר KC פרוטוקולים תרבות 4 , 15 , "16 , 17 , 18. במחקר זה, ראינו כי dGS עדיפה על FBS chlexed כדי תרבות KCs העכבר הבוגרים ולשמור על מורפולוגיה התא הבסיסי של KC ( איור 2 א ). עם זאת, סביר להניח כי האפקטיביות של CHlexed-FBS כדי לשמור על מורפולוגיה בסיסית של KC עשוי להיות תלוי במגרש FBS בשימוש בכל מחקר.
באמצעות השיטות המוצגות כאן, הראינו כי הן את הלידה ואת הבוגר עכבר kCs העור הגיב סידן גבוהה מופעלות בידול מסוף, הצומת תא הצומת הדוק ריבוד ( איור 1 ו איור 2 ). באופן כללי, העלאת רמת הסידן החוץ-תאגידי ליותר מ -0.1 מ"מ גורמת להבדל מסוף של KCs בסיסי 4 , 5 , 17 ,התחת = "xref"> 19. זה כבר דיווח כי רמת ביניים של סידן (0.1- 0.16 מ"מ) גרמה באופן משמעותי את הביטוי של סמנים בידול מוקדם, כגון K1 ו K10, במהלך 24 שעות הראשון על מתג הסידן, ואילו K1 ו K10 היה רק המושרה שבר של תאים כאשר מטופלים עם בינוני סידן גבוהה יותר (1 מ"מ) 19 , 20 . עם זאת, המדיום הסידן הגבוה יותר (≥ 1 mM) נמצא בשימוש נרחב במחקרים רבים אחרים במהירות ובמהירות לגרום ריבוד KC ואת הביטוי של גנים נבדלים מאוחר, כגון INV ו LOR 4 , 21 , 22 , 23 . בהתבסס על הניסיון שלנו, רמה בינונית של סידן, כגון 0.2 מ"מ m CaCl 2 , מובילה להתפתחות הדרגתית ואטית יותר של בידול מסוף, בעוד רמות סידן גבוהות יותר (≥ 1 מ"מ) באופן דרסטי להאיץ את תחילתה של KC teRminal differentiation, המוביל לחלון זמן קצר יותר כדי ללמוד את השינויים הסלולר במהלך בידול. לכן, השתמשנו 0.2 מ"מ CaCl 2 כדי לעורר בידול מסוף KC, והראינו כי זה רמת סידן ביניים הוביל לשינוי הדרגתי של מורפולוגיה התא הבסיסי כדי מורפולוגיה קורנפוציטים מרובד בתוך 72 שעות לאחר מתג הסידן ( איור 2 ב ).
הקבוצה שלנו הוכיחה בעבר כי KCs אפידרמיס גם לשחק תפקיד חשוב ליזום תגובות דלקתיות פתוגנים או DAMP שפורסמו במהלך פציעה ו / או קרינה UVB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . בקנה אחד עם אלה בתצפיות vivo , כאן הראינו כי מבוגרים מתורבתים עכברים מבוגרים היו רגישים מאוד למוות תאים מופעלים UVB ו KBs שטופלו UVB שוחרר גדולכמות של TNFα, שהיא ציטוקינים דלקתיים מרכזיים המפעילה את המערכת החיסונית.
לסיכום, את העור העיקרי אפידרמיס תא התרבות KC מספק שימושי במודל חוץ גופית ללמוד את הקמת מחסום האפידרמיס התגובה החיסונית המולדת של KCs, השיטות המתוארות כאן יהיה עניין לחוקרים רודף מחקרים בביולוגיה עורית בעכבר הילוד כמו גם בעכבר הבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארתריטיס ו MUSCULOSKELETAL ו מחלת עור מענק (R01AR069653 כדי ג 'אנג LJ), ואת המכונים הלאומיים לבריאות תמיכה (5T32AR062496-03 ל CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
