Summary
एपिडर्मल केरैटिनोसाइट्स एक कार्यात्मक त्वचा बाधा का निर्माण करते हैं और बाहरी पर्यावरणीय अपमान के खिलाफ मेजबान रक्षा की अगली पंक्ति पर तैनात हैं। यहाँ हम नवजात और वयस्क माउस त्वचा से एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स के अलगाव और प्राथमिक संस्कृति के तरीकों का वर्णन करते हैं, और टर्मिनल भेदभाव और यूवीबी द्वारा ट्रिगर किए जाने वाले कारेतिनोसाइट्स से भड़काऊ प्रतिक्रिया का आदान प्रदान करते हैं।
Abstract
केराटिनोसाइट (केसी) एपिडर्मिस में प्रमुख सेल प्रकार है, त्वचा की सबसे बाहरी परत। एपिडर्मल केसीएस पर्यावरण अपमान, जैसे कि यूवीबी विकिरण या रोगजनकों के खिलाफ एक अखंड त्वचा बाधा बनाने, और उन अपमानों पर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करके त्वचा की रक्षा प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ हम नवजात माउस त्वचा से और वयस्क माउस पूंछ त्वचा से केसी को अलग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। हम चेलेक्सित भ्रूण गोजातीय सीरम (सीएफबीएस) की तुलना में परिभाषित विकास की खुराक (डीजीएस) का उपयोग करते हुए कल्चरिंग शर्तों का भी वर्णन करते हैं। कार्यात्मक रूप से, हम यह दिखाते हैं कि दोनों नवजात और वयस्क केसी उच्च कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव, तंग जंक्शन गठन और स्तरीकरण के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत वयस्क केसी, यूवीबी-ट्रिगर सेल की मृत्यु के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और यूवीबी विकिरण पर बड़ी मात्रा में टीएनएफ जारी कर सकते हैं। साथ में, यहां वर्णित विधियां इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगीएस नवजात माउस और / या वयस्क माउस में एपिडर्मल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए
Introduction
त्वचा शरीर में सबसे बड़ा अंग है जो बाहरी सबसे परत के रूप में एपिडर्मिस के साथ है। एपिडर्मिस पर्यावरण से शरीर को अलग करने के लिए एक अखंड एपिडर्मल बाधा बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस तरह पानी के नुकसान को रोकता है और पर्यावरणीय अपमान, जैसे एलर्जी, रोगजनकों और यूवीबी एक्सपोजर से सुरक्षा प्रदान करता है। एपिडर्मिस, एक बेसिल परत से मिलकर बहु-स्तरीकृत स्टेरेटिफाइड एपिथेलियम में एक विशिष्ट परत के रूप में विकसित होती है, जिसके बाद स्पीनस लेयर, दानेदार परत, और स्ट्रेटम कॉर्नएम होता है। बेसल केसी, दोनों एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं और ट्रांजिट-एम्पलींग कोशिकाओं से मिलकर होते हैं, प्रोलिफायरेटिव और एडिटिफाइनेटेड हैं। चूंकि बेसल केसी बाहर सेल चक्र से बाहर निकलते हैं, कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्धता होती है और धीरे-धीरे एपिडर्मिस की सतह की ओर बढ़ जाती है, साथ में सेल सेल जंक्शनों की परिपक्वता और एपिडर्मल पारगम्यता बाधा (ईपीबी) के गठन के साथ। स्पिनस लेयर पर केसीएस शीघ्र ही अलग-अलग तरीके से पेश करते हैंआयन मार्कर जैसे किराटिन 10 (के 10); केसी के रूप में कणिकाय परत पर विस्थापित हो जाते हैं, कोशिकाएं फिलैगग्रिन (एफएलजी), लॉरिक्रिन (एलओआर) और इनग्लोक्रिन (आईएनवी) जैसे देर से भिन्नता वाले मार्करों को व्यक्त करती हैं। स्ट्रेटम कॉर्नियम में, केसी को कॉर्नोइसाइट्स के रूप में अलग-अलग विभेदित किया जाता है, जिसे अंततः डिस्क्मेमेंट के माध्यम से बहाया जाता है क्योंकि नई कोशिकाओं की जगह उन्हें बदल दिया जाता है।
कैल्शियम को एपिडर्मिस में सबसे अधिक शारीरिक एजेंट माना जाता है और इसी तरह से इन विट्रो और विवो में भेद पैदा करता है। सामान्य त्वचा एपिडर्मिस में, कैल्शियम आयन एक विशेषता "एकाग्रता ढाल" बनाते हैं, त्वचा की सतह 1 , 2 , 3 की ओर एकाग्रता में बढ़ रही है। कैल्शियम की एकाग्रता ऊपरी दानेदार परत में एक शिखर पर सबसे कम निम्न स्तरों (बेसल और स्पीनस परत) में कम स्तर से उगता है और फिर सबसे सतही परत (स्ट्रेटम कॉर्नएम) में नगण्य स्तर तक चला जाता है। कैल्शियम ढाल भी एक घटक पारगम्यता बाधा के उद्भव के साथ संयोग से विकसित होता है, जो कि कैल्शियम सिग्नलिंग का समर्थन करता है, केसी भेदभाव की एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इन विट्रो में , कम कैल्शियम (0.02-0.1 मिमी) एक मोनोलायर के रूप में बेसल केसी के प्रसार को बनाए रखता है, जबकि उच्च कैल्शियम (> 0.1 मिमी) तंग-जंक्शन निर्माण और प्रेरण द्वारा प्रदर्शित किया गया टर्मिनल भेदभाव के लिए कोशिकाओं की एक तेज़ और अपरिवर्तनीय प्रतिबद्धता को प्रेरित करता है बेसल केसी 4 , 5 के लिए उच्च कैल्शियम उपचार पर LOR और INV का
बाधा बनाने के अलावा, एपिडर्मल केसी भी त्वचा की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक है। यूवीबी विकिरण या चोट पर जारी रोगज़नक़ों या क्षतिग्रस्त-जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) के जवाब में, केसी बहुत अधिक मात्रा में भड़काऊ साइटोकिन्स उत्पन्न कर सकते हैं, जैसे कि टीएनएफए, आईएल 6 और आईएफएनबी, जिससे प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण होती है> 6 , 7 , 8 , 9 यद्यपि केसी से उचित भड़काऊ संकेत को रोगजनन निकासी के लिए जरूरी है, अनियंत्रित भड़काऊ प्रतिक्रिया, ऑटो-सूजनयुक्त त्वचा रोगों जैसे कि छालरोग और रोसेएशिया 6 , 8 के विकास को गति दे सकती है।
कुल मिलाकर, के.सी. अक्षय त्वचा बाधा को बनाए रखने और रोगज़नक़ों के आक्रमण या पर्यावरण अपमान पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसलिए, epidermal केसी की प्राथमिक संस्कृति उपकला जीव विज्ञान, केसी भेदभाव के अध्ययन के लिए एक उपयोगी तकनीक है, साथ ही साथ केसी प्रेरित उत्तेजित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं। प्राथमिक माउस एपिडर्मल केसी की अलगाव और संस्कृति केसी की संवेदनशीलता और विभिन्न बाहरी उत्तेजक को संवेदनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया हो सकती है। यहां हम एक नवप्रवर्तित माउस त्वचा से या तो अलग-अलग केसी को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैंवयस्क माउस पूंछ त्वचा वयस्क केसी अलगाव के लिए, हम माउस पृष्ठीय त्वचा का उपयोग नहीं करते क्योंकि इस ऊतक से पर्याप्त मात्रा में व्यवहार्य केसी को अलग करना निम्नलिखित कारणों से कठिन हो सकता है: सबसे पहले, बाल चक्र (टेलोजेन) के आराम चरण में प्रौढ़ पृष्ठीय त्वचा के होते हैं कोशिकाओं के केवल 1-2 परतों के साथ पतली एपिडर्मिस, जिससे कम सेल उपज और अपरिवर्तक की अपर्याप्तता पृथक होती है, जो कि केसी अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम है। दूसरा, ऊतक बाल कूप घनत्व जो वयस्क पृष्ठीय त्वचा पर मौजूद है, उससे आगे त्वचा से एपिडर्मिस को अलग करने में कठिनाई का योगदान होता है। इसके बजाय, हम पूंछ त्वचा को वयस्क माउस केसी के स्रोत के रूप में नियमित रूप से इस्तेमाल करते हैं क्योंकि इस एपिथेलियम एपिडर्मल केसी के 3-5 परतों के साथ मोटा है। यह भी एक छोटे बाल कूप घनत्व है, जो एपिडर्मल जुदाई में हस्तक्षेप नहीं करता है, इस प्रकार माउस की उम्र और बाल साइक्लिंग चरण की परवाह किए बिना किसी भी वयस्क माउस पूंछ त्वचा से केसी अलगाव की अनुमति देता है। पृथक नियोनतालक केसी को जिलेटिन-लेपित संस्कृति व्यंजन के लिए वरीयता दी जाती है, जबकि कोलेजन-लेपित डिश का उपयोग वयस्कों के अलग-अलग केसी के लिए किया जाता है क्योंकि उनके नवजात समकक्षों की तुलना में वयस्क कोशिकाओं का पालन करने की अक्षमता की क्षमता होती है। संस्कृति माउस केसीएस के लिए, कम कैल्शियम बेसल माध्यम डीजीएस से पूरक होता है, जिसमें एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), बोवाइन ट्रांसफिरिन, इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक सी 1 (आईजीएफ 1), प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 (पीजीई 2), गोजाइन सीरम एल्बूमिन (बीएसए) और हाइड्रोकार्टेसोन शामिल हैं। प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 2-4 दिनों के बीच, विभिन्न माध्यमिक परिवर्तनों के दौरान अधिकांश अलग-अलग केसीओं को धोया जा सकता है, और शेष अनुयायी कोशिकाएं आम तौर पर cobblestone morphology दिखाती हैं 4 , विस्तार कर रही हैं, और प्रारंभिक भेदभाव मार्कर K10 को व्यक्त नहीं करते हैं।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों को यूसीएसडी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. नवजात त्वचा से प्राथमिक माउस केसी अलगाव और संस्कृति
- शिशुओं के बाद शिशु मृत्यु से C57B / 6 wildtype माउस तनाव से प्रसवोत्तर दिन 0-2 नवजात शिशुओं का त्याग करें कलाई और टखने के जोड़ों के ऊपर अंगों को काट लें, फिर पूंछ को पूरी तरह से काट लें, छोटे छेद छोड़ दें।
- पूरी त्वचा को छीलने के लिए, पहले पूंछ पर छेद के माध्यम से तेज कैंची डालें और शरीर की पृष्ठीय मिडलाइन के साथ गर्दन पर खोलने के लिए त्वचा काट लें। इसके बाद, त्वचा को समझने के लिए उजागर हुए शरीर और अन्य संदंशों को समझने के लिए एक संदंश का उपयोग करें, और धीरे-धीरे शरीर की पूरी त्वचा को छील कर दें और एक सतत गति के साथ पैर स्टंप पर।
- त्वचा को एक बरकरार टुकड़े के रूप में छीलकर रखें और त्वचा को टुकड़ों में नहीं तोड़ना सावधान रहें क्योंकि इससे डिस्प्रेस चरण के दौरान सेल में नुकसान होगा।
<ली> 10 सेमी पेट्री डिश में 15 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ खुली हुई त्वचा को कुल्ला, फिर बर्फ के ठंडे फैलाव पाचन बफर से भरी हुई 2 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक पिल्चर से त्वचा रखें, जिसमें केसी ग्रोथ माध्यम में 4 मिलीग्राम / एमएल डिस्पले शामिल है (केसी बेसल माध्यम में 0.06 एमएम CaCl 2 , डीजीएस, और एंटीबायोटिक्स / एंटीमिकोटिक) है। - सुनिश्चित करें कि त्वचा ट्यूब में गुना नहीं है क्योंकि इससे परिणामस्वरूप गुना क्षेत्र के अपर्याप्त फैलाव को निपटाने के लिए समाधान होगा।
- अगले दिन (12-18 घंटे के बाद), पेट्री डिश में डिस्प्रेस समाधान के साथ त्वचा को स्थानांतरित करें। प्रत्येक ऊतक का टुकड़ा एक नया पेट्री डिश में 15 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ स्थानांतरित करें, जिससे अतिरिक्त वितरण हटा दें।
- संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, पीबीएस से त्वचा को समझो,त्वचा को ऊपर उठाना, और एपिडर्मल तरफ नीचे और त्वचा की तरफ के साथ एक नया पेट्री डिश में स्थानांतरण करें। ध्यान से त्वचा की परतों को बढ़ाएं ताकि यह पेट्री डिश पर पूरी तरह से बढ़ाया जा सके।
- एक नया पेट्री डिश में प्रत्येक त्वचा के लिए एक trypsin- आधारित पाचन समाधान के 500 μL रखें। संदंश का प्रयोग, धीरे-धीरे एपिडर्मिस को पकड़ते समय, त्वचा को ऊपर और दूर एपिडर्मिस से उठाएं। त्वचा को बायोहेज़र्डस सामग्री के रूप में निकालना बेसल परत नीचे की ओर ट्रिप्सिन समाधान के प्रत्येक बूंद पर अलग-अलग एपिडर्मिस और फ्लोट स्थानांतरण करें।
- यदि एपिडर्मिस ट्रिप्सिन समाधान पर मुड़ा हुआ है, तो एपिथेलियम से बेसल केसी की कुशल पाचन सुनिश्चित करने के लिए संदंश का उपयोग कर किसी भी परत को हटा दें।
- 20 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान (ढक्कन के ढक्कन के साथ) पर ट्रिप्सिन समाधान में पेट्री डिश पर त्वचा सेते हैं।
- एपिडर्मिस प्रति पूरक के.सी. विकास माध्यम के 2 एमएल (लगभग 1 वर्ग इंच का आकार प्रतिएपिडर्मिस) पेट्री डिश के लिए संदंश का उपयोग करते हुए एपिडर्मिस को समझें, और एपिडर्मल शीट से एकल कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए आगे और पीछे एपिडर्मिस रगड़ें।
- मध्यम टर्न को तेजी से टरबाइड देखें क्योंकि कोशिकाएं एपिडर्मिस से अलग होती हैं। डिश पर शेष epidermal शीट छोड़ने के लिए एक नई ट्यूब को सेल निलंबन एकत्र और हस्तांतरण करने के लिए पेट्री डिश झुकाएं।
- 2 मिलीलीटर के.सी. वृद्धि माध्यम को जोड़ने के बाद एपिडर्मल शीट के रगड़ को दो बार दोहराएं, और एक ही ट्यूब में सेल निलंबन को गठबंधन करें।
- सेल सॉल्यूशन पाइपेट को ऊपर और नीचे धीरे से कुछ समय के लिए उपयुक्त सेल्युलिक विंदुक के उपयोग से किसी भी सेल क्लंप को तोड़ने के लिए, फिर इसे एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पास करें।
- 5 मिनट के लिए फ़ॉल्टर किए गए कोशिकाओं को 180 x ग्रा में अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला को बंद करना और धीरे-धीरे सेल गोली को 1 एमएल सर्दी केसी ग्रोथ माध्यम / एपिडर्मिस में पुन: पेश करना।
- एक हेमोसिटामीटर द्वारा कोशिकाओं की गणना करें।
- 5 x 10 4 / संस्कृति व्यंजन में केसी विकास माध्यम में 2 सेमी की एक घनत्व पर कोशिकाओं बीज एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) उत्पाद है कि सेल लगाव को बढ़ावा देता है के साथ पूर्व में लिपटे।
नोट: हम एक वाणिज्यिक उपलब्ध (जैसे एक्टिबैक्टर फैक्टर का उपयोग करते हैं, जो कि जिलेटिन-आधारित कोटिंग सामग्री है (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। कोशिकाओं को आर्द्रित इनक्यूबेटर में 37% से 5% सीओ 2 में सुसंस्कृत किया गया था, और ताजी माध्यम हर दूसरे दिन मंगाया- कोटिंग के लिए, कोटिंग संस्कृति को सेल लगाव कोटिंग सामग्री के साथ बर्तन जो 10 से 2 घंटे के लिए कक्ष सीडिंग से पहले कमरे के तापमान पर गर्म होता है। अटैचमेंट फैक्टर को ठीक से पहले निकालेंसेल निलंबन जोड़ने
- अप्रचलित कोशिकाओं को निकालने के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के बाद मध्यम 24 घंटे बदलें, और तब तक माध्यम के दैनिक परिवर्तन करें जब तक प्रयोगों से पहले कोशिका वांछित संगम तक नहीं पहुंचती।
नोट: एक से अधिक त्वचा आइसोलेट को मिलाकर 15 मिलीलीटर ट्यूब (प्रति ट्यूब तक 5 खाल) में मिलाया जा सकता है जिसमें 12 एमएल का डिस्प्रेस समाधान होता है। एक चक्कर पर एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रात भर त्वचा ट्यूब सेते हैं।
2. वयस्क टेल लैंग से प्राथमिक माउस केसी अलगाव
- पशु सुविधा विनियमों के अनुसार एक वयस्क C57BL / 6 माउस (अधिमानतः 6-15 सप्ताह की उम्र के बीच में या तो पुरुष या महिला) बलिदान करें। पूंछ के आधार से शरीर की पूंछ को काट कर, और पूंछ की टिप का ~ 2 मिमी काट कर ताकि टिप पर एक दृश्य छेद हो।
- पूंछ की त्वचा को छीलने के लिए, पूंछ की तरफ पूंछ की त्वचा के साथ पूंछ की टिप तक काटने के लिए पहले एक तेज ब्लेड का उपयोग करें। इसके बाद, त्वचा को समझने के लिए उजागर पूंछ की हड्डी और अन्य संदंश को समझने के लिए एक संदंश का उपयोग करें, और हड्डी की एक सतत गति से धीरे-धीरे पूंछ की त्वचा को छील कर दें। छिद्रित त्वचा को मध्य रेखा से काटें ताकि प्रत्येक टुकड़ा 2-3 सेमी लंबा से कम हो।
- खुली त्वचा बुद्धि को कुल्ला10 सेमी पेट्री डिश में बाँझ पीबीएस एच 15 मिलीलीटर, फिर प्रत्येक पूंछ से बर्फ को ठंडा डिस्पैसे पाचन बफर (4 मिलीग्राम / एम.एल. केसी विकास माध्यम में) से भरा 2 एमएल ट्यूब में रखें।
नोट: एकाधिक त्वचा के टुकड़े को एक 15 एमएल ट्यूब (5 ट्यूब प्रति ट्यूब तक) में मिलाया जा सकता है जिसमें 12 एमएल का डिस्प्रेस समाधान होता है।- एक चक्कर पर एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रात भर त्वचा ट्यूब सेते हैं।
- पूंछ एपिडर्मिस से सिंगल सेल निलंबन को अलग करने के लिए 1.4 से 1.13 चरणों का पालन करें।
- 10 x 10 4 / सेमी 2 के एक घनत्व में वयस्क कोशिकाओं बीज संस्कृति व्यंजन कोलेजन के साथ पूर्व में लिपटे में केसी विकास माध्यम में (एक hematocytometer द्वारा गिना)।
नोट: हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेजन-आधारित कोटिंग किट (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ आर्मीड इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया और हर दूसरे दिन ताजा माध्यम की भरपाई की गई। सामान्य तौर पर, सीकवक के व्यंजनों को सेल सीडिंग से 30 मिनट से 1 घंटे पहले कोलेजन के साथ लेपित किया जाना चाहिए। हम मानते हैं कि एग्जाकेट फैक्टर के मुकाबले कोलेजन के साथ लेपित डिश में वयस्क केसी अटैचमेंट की एक महत्वपूर्ण वृद्धि है, जो एक जिलेटिन-आधारित कोटिंग सामग्री है। - अप्रचलित कोशिकाओं को निकालने के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के बाद मध्यम 24 घंटे बदलें, और तब तक माध्यम के दैनिक परिवर्तन करें जब तक प्रयोगों से पहले कोशिका वांछित संगम तक नहीं पहुंचती।
3. उच्च कैल्शियम द्वारा केसी की विट्रो भेदभाव में
- टर्मिनल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, संस्कृति माध्यम में 2 2 एमएएम में CaCl जोड़ें।
- वैकल्पिक रूप से, उच्च कैल्शियम के अतिरिक्त होने से पहले कम कैल्शियम केसी बेसल माध्यम में बिना बढ़ी हुई वृद्धि की खुराक के बिना सुसंस्कृत केसी को भूखा।
नोट: विकास कारक भूख से शुरुआती भेदभाव के लिए सेल की प्रतिबद्धता और प्रारंभिक भेदभाव मार्करों को शामिल करना, जैसे K10 5
4. यूवीबी इररायडिएशन मेडिएटेड सेल मौत और केसी द्वारा टीएनएफए रिलीज
- केसी विकास माध्यम में माउस केसी (संस्कृति में आर्मीड इनक्यूबेटर में), दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ 5% सीओ 2 (37 डिग्री सेल्सियस पर), जब तक कि कोशिकाओं तक पहुंच न हो। यूवीबी विकिरण के तुरंत बाद, विकास माध्यम को हटा दें और पीबीएस के 500 μL के साथ बदलें। फिर कोशिकाओं को 25 एम.जे. / सेमी 2 यूवीबी या नकली नियंत्रण (कोई यूवीबी नहीं) के अधीन।
नोट: यूवीबी विकिरण को दो 8 डब्ल्यू बल्ब (312 एनएम) के साथ हाथ में यूवीबी लैंप का उपयोग किया जाता है जैसा पहले 10 वर्णित था। यूवीबी विकिरण के बाद, पीबीएस की इच्छाशक्ति और ताजा माध्यम जोड़ा जाता है। - सीसीके -8 सेल व्यवहार्यता परख द्वारा सेल व्यवहार्यता को 6, 8, और 24 घंटे के बाद यूवीबी उपचार के निर्माता के अनुदेश 11 के बाद उपाय और मापें।
- यूकेबी के साथ वांछित समय बिंदुओं के साथ इलाज किए गए केसी से वातानुकूलित माध्यम ले लीजिए और TNFα जारी किए गए मापउत्पादक के निर्देश 7 , 12 के बाद माउस टीएनएफ (मोनो / मोनो) एलिसा किट द्वारा वातानुकूलित माध्यम में
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Representative Results
नवजात और वयस्क केसी के उच्च कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव प्राथमिक माउस एपिडर्मल केसी की चढ़ाई और 0.06 एमएम CaCl 2 पर बनाए रखा, एक मोनोलायर के रूप में बढ़ी, और अलग-अलग कोशिकाओं में अलग-अलग कोशिकीय अंतरिक्ष के साथ एक बहुभुज आकार था, जिसमें मिला हुआ ( चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए ) एक कोबैलेस्टोन उपस्थिति दिखा रहा था। CaCl 2 से 0.2 मिमी को ऊपर उठाने से कोशिकाओं के एक तीव्र आकारिकी परिवर्तन को प्रेरित किया गया। उच्च कैल्शियम स्विच के बाद 8 घंटे के भीतर, कोशिकाएं चपटा हो गईं और अलग-अलग अंतरण अंतरिक्ष कम स्पष्ट हो गया, और 24 घंटे तक तंग जंक्शनों के साथ सेल-सेल आसंजन स्पष्ट हो गया ( चित्रा 1 ए और चित्रा 2 बी )। कोरिफाइड सेल लिफाफा और ऊर्ध्वाधर सेल स्तरीकरण के गठन का प्रारंभिक कैलशियम स्विच ( चित्रा 2 बी) के बाद लगभग 48-72 घंटे)। उच्च कैल्शियम स्विच के दौरान एक्टिन रीमॉडेलिंग और सेल-सेल तंग जंक्शन संरचना का विश्लेषण करने के लिए, 0.2 एमएम CaCl 2 के साथ इलाज किए गए केसी (एसएसी) 2, केसी भेदभाव 13 के दौरान एक्टिन रीमॉडलिंग को मापने के लिए फीलाइनइडिन ( चित्रा 1 बी ) के साथ दाग गया। निकटवर्ती कोशिकाओं के बीच एक्टिन फाइबर युक्त समरूप अनुमानों का गठन 3 घंटे बाद कैल्शियम स्विच के रूप में शुरू किया गया था, और एक्टिन फाइबर रीमॉडेलिंग 6-24 घंटे के बीच और आगे बढ़कर 48 घंटे तक सेल स्तरीकरण प्रमुख बन गया ( चित्रा 1 बी )।
यूवीबी-ट्रिगर सेल मृत्यु और TNFα रिहाई के लिए माउस केसी की संवेदनशीलता । सुसंस्कृत वयस्क माउस के.सी. 25 एमजे / सेमी 2 यूवीबी विकिरण के संपर्क में थे, और संस्कृति के माध्यम में जारी सेल व्यवहार्यता और टीएनएफए का विश्लेषण किया गया। जैसा कि चरण के विपरीत छवियों ( Figuफिर से 3 ए), साथ ही साथ सेल व्यवहार्यता परख ( चित्रा 3 बी ), यूवीबी ने केसी के एक समय पर निर्भर मृत्यु को जन्म दिया। 24 घंटे तक, अधिकांश कोशिकाओं को गोल किया गया था और डिश ( चित्रा 3 ए ) से अलग थे। सेल व्यवहार्यता परख द्वारा निर्धारित मात्रा में, ~ 9 0% कोशिकाएं 24 घंटों के भीतर यूवीबी उपचार ( चित्रा 3 बी ; पी <0.001 के रूप में एक-मार्ग एएनओवीए बहु तुलना परीक्षण द्वारा गणना की गई थी) अंत में, हमने दिखाया कि टीएनएफए, एक महत्वपूर्ण साइटोकिन जो कि यूवीबी द्वारा प्रेरित है और यूसीबी विकिरण 14 के बाद केसी एपप्टोसिस को चलाता है, को संस्कृति के माध्यम में बहुतायत से (24 घंटे के भीतर 250 पीजी / एमएल के भीतर यूवीबी-विकिरण; पी <0.001) स्रावित किया गया था एक समय पर निर्भर तरीके से यूवीबी-उपचार वाले केसी ( चित्रा -3 सी )।
आकृति 1: नवजात माउस केसी की प्राथमिक संस्कृति, और उच्च कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव और तंग सेल सेल जंक्शन संरचना। ( ए ) प्राथमिक नवजात माउस केसी को उच्च कैल्शियम (0.2 मिमी CaCl 2 ) के साथ इलाज किया गया था, और 4X बढ़ाई पर चरण के विपरीत छवियों को 0 घंटे (ctrl) और उपचार के बाद 8 घंटे में लिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) नवजात केसी को 0.2 एमएम CaCl 2 की उपस्थिति में विभेदित किया गया था, और कोशिकाओं को भेदभाव के दौरान आसन्न कोशिकाओं के बीच एक्टिन फाइबर-समृद्ध फाइलोडाइड संबंधी अनुमानों के निर्माण के लिए कल्पना करने के लिए phalloidin (लाल) के साथ दाग रहे थे। नाभिक डीएपीआई के साथ counterstained थे, और actin तंतुओं rhodamine phalloidin के साथ दाग रहे थे। स्केल बार = 25 माइक्रोन डीएपीआई चैनल (नाभिक धुंधला के लिए) और आरएफपी चैनल (एक्टिन स्लेन्गिंग के लिए) पर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सेट का उपयोग करके छवियां 20 एक्स बढ़ाई गईं थीं। Lank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्राथमिक संस्कृति और वयस्क कैस के उच्च कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव ( ए ) प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 8 घंटे, 1 दिन, 2 दिन और 3 दिन में प्राथमिक वयस्क माउस केसी के 10x बढ़ाई पर चरण विपरीत छवियाँ। ऊपरी पैनल डीजीएस में विकसित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, और निचले पैनल 8% एनजी / एमएल रीकॉम्बाइनेंट माउस ईजीएफ के साथ 10% चेलेक्स युक्त एफबीएस (सीएफबीएस) में विकसित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) कन्फ्लुएंट वयस्क माउस के.सी.एस 0.2 एमएम CaCl 2 की उपस्थिति में विभेदित किया गया था, और 10X बढ़ाई पर चरण के विपरीत छवि 0 (ctrl), 8, 24, 48, और 72 घंटे में उच्च कैल्शियम स्विच के बाद लिया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोनNk "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: वयस्क माउस केसी की प्राथमिक संस्कृति, और यूवीबी प्रेरित सेल मौत और टीएनएफए की रिलीज के लिए वयस्क केसी की संवेदनशीलता। प्राइमरी वयस्क माउस केसी को संगम के लिए सुसंस्कृत किया गया था, फिर 25 एम.जे. / सेमी 2 यूवीबी विकिरण के संपर्क में आया था। ( ए ) 12 और 24 घंटों के बाद-यूवीबी एक्सपोज़र पर 10X बढ़ाई गई चरण के विपरीत छवियों में एक समय पर निर्भर यूवीबी प्रेरित कोशिका मृत्यु दिखायी गयी। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) सेल व्यवहार्यता 6, 8, और 24 घंटे के बाद यूवीबी उपचार पर सीसीके -8 सेल व्यवहार्यता परख द्वारा निर्धारित किया गया था। ( सी ) यूएनबीआई द्वारा प्रेरित टीएनएफए से प्रेरित समय बिंदुओं पर मीडिया को एलिसा द्वारा मापा गया था। सभी त्रुटि सलाखों का मतलब ± एसईएम मतलब है पी-मान का एकतरफा एनोवा कई तुलना द्वारा गणना किया गया थापरीक्षण (***, पी <0.001) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
बाहरी वातावरण से शरीर को अलग करने और शरीर को बचाने, पानी के नुकसान, रोगजनकों, गर्मी और यूवी विकिरण से अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में त्वचा एपिडर्मिस कार्य। के सी एस एपिडर्मिस की प्रमुख सेल वंश हैं, और एपिडर्मल के प्राथमिक संस्कृति के सी एस का अध्ययन करने और बाधा गठन की जैविक प्रक्रियाओं और इन विट्रो में पर्यावरण अपमान करने के सी एस की प्रतिक्रिया को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
यहाँ हम नवजात और वयस्क माउस त्वचा से प्राथमिक एपिडर्मल केसी को पृथक करने और संस्कृति के तरीकों का वर्णन करते हैं। जबकि प्राइमरी माउस केसी को नवजात त्वचा की त्वचा से आसानी से अलग किया जा सकता है, जबकि वयस्क केसी के अलगाव और सफल संस्कृति को एपिडर्मिस के पतलेपन और वयस्क माउस पृष्ठीय त्वचा के उच्च बाल कूप घनत्व के कारण मुश्किल माना जाता है। यहां वर्णित विधि वयस्क माउस की पूंछ त्वचा का उपयोग बेसल केसी के सुविधाजनक और प्रचुर स्रोत के रूप में करती है। एक मोटी एपिडर्मिस और कम की उपस्थिति के कारण पूंछ की त्वचा में बाल कूप घनत्व, त्वचा की त्वचा की रातोंरात प्रसव पाचन के बाद त्वचा के अपरिवर्तक को अलग करके केसी को अलग करने के महत्वपूर्ण चरण संभव होते हैं। इसके विपरीत, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए प्रौढ़ पृष्ठीय त्वचा से केसी को अलग करने का हमारा प्रयास सफल नहीं हुआ था, जिसके परिणामस्वरूप चढ़ाई के बाद अलगाव और निम्न सेल लगाव के बाद कम सेल उपज निकलता था। हालांकि, प्रौढ़ पृष्ठीय त्वचा से केसी की सफल अलगाव और संस्कृति को फर-मुक्त त्वचा 15 के रातोंरात ट्रिप्सिन पाचन के बाद सूचित किया गया है, यह सुझाव है कि अकेले फैलाव वयस्क पृष्ठीय त्वचा की त्वचा से पुटिकाल केसी को निकालने के लिए पर्याप्त नहीं होगा।
इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक केसी कम कैल्शियम माध्यम में उगाए गए थे जो कि कैल्शियम-लुप्त हो चुके चेलेक्स-एफबीएस के बजाय डीजीएस के साथ पूरक थे, जिसका उपयोग कई पहले प्रकाशित माउस केसी संस्कृति प्रोटोकॉल 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. इस अध्ययन में, हमने देखा कि डीजीएस संस्कृति वयस्क माउस केसी के लिए चेलेक्स युक्त एफबीएस से बेहतर है और केसी के बेसल सेल आकृति विज्ञान ( चित्रा 2 ए ) को बनाए रखने के लिए है। हालांकि, यह संभावना है कि छाती-फ्रेड्स की प्रभावशीलता केसी के बेसल आकारिकी को बनाए रखने के लिए प्रत्येक अध्ययन में उपयोग किए गए एफबीएस लॉस पर निर्भर हो सकता है।
यहां प्रस्तुत तरीकों का इस्तेमाल करते हुए, हमने दिखाया कि नवजात और वयस्क माउस एपिडर्मल केसी दोनों ने उच्च कैल्शियम को ट्रिगर किया गया टर्मिनल भेदभाव, तंग सेल जंक्शन गठन और स्तरीकरण ( चित्रा 1 और चित्रा 2 )। सामान्य तौर पर, बाह्य कैल्शियम स्तर को 0.1 एमएम से अधिक तक बढ़ाकर बेसल केसी 4 , 5 , 17 के टर्मिनल भेदभाव को ट्रिगर किया जाता है ,Ass = "xref"> 1 9 यह सूचित किया गया है कि कैल्शियम (0.1-0.16 एमएम) का मध्यवर्ती स्तर कैल्शियम स्विच पर पहले 24 घंटे के दौरान प्रारंभिक भेदभाव मार्करों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जबकि K1 और K10 केवल एक छोटे से प्रेरित होते थे उच्च कैल्शियम मध्यम (1 एमएम) 1 9 , 20 के साथ इलाज के दौरान कोशिकाओं का अंश। हालांकि, कई अन्य अध्ययनों में अधिक कैल्शियम माध्यम (≥ 1 एमएम) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है ताकि तेजी से और मजबूत रूप से केसी स्तरीकरण और अंतराल भेदभाव जीनों की अभिव्यक्ति हो सकती है, जैसे आईएनवी और एलओआर 4 , 21 , 22 , 23 । हमारे अनुभव के आधार पर, कैल्शियम का एक मध्यवर्ती स्तर, जैसे कि 0.2 एमएम CaCl 2 , टर्मिनल भेदभाव के क्रमिक और धीमी शुरुआत की ओर जाता है, जबकि एक उच्च कैल्शियम स्तर (≥ 1 एमएम) के.सी.टी.खूनी भेदभाव, भिन्नता के दौरान सेलुलर परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक छोटी समय खिड़की का कारण बनता है। इसलिए, हम केसी टर्मिनल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए 0.2 एमएम CaCl 2 का इस्तेमाल किया है और हमने दिखाया है कि कैल्शियम स्विच ( चित्रा 2 बी ) के बाद 72 घंटे के भीतर, इस मध्यवर्ती कैल्शियम के स्तर से बेसल सेल आकारिकी के एक स्तरीकृत कॉर्नोसायट आकृति विज्ञान में क्रमिक परिवर्तन हो गया।
हमारे समूह ने पहले यह दिखाया है कि epidermal केसी भी चोट और / या यूवीबी-विकिरण 6 , 7 , 8 , 9 , 10 के दौरान जारी होने वाले रोगजनक रोगियों या दंपों के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। विवो अवलोकन में उन लोगों के अनुरूप, हमने यहां बताया कि सुसंस्कृत वयस्क माउस केसी बहुत ही यूवीबी-ट्रिगर सेल की मौत के लिए अतिसंवेदनशील थे और यूवीबी द्वारा इलाज वाले केसी ने एक बड़ेटीएनएफए की मात्रा, जो एक प्रमुख भड़काऊ साइटोकिन है जो प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करता है।
संक्षेप में, प्राथमिक माउस एपिमर्मल केसी सेल संस्कृति एपीडर्मल बाधा गठन और केसी के जन्मजात प्रतिरोधी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में उपयोगी साबित करती है, और यहां वर्णित विधियों के शोधकर्ताओं ने नवजात माउस में त्वचेय जीव विज्ञान में अध्ययन का अध्ययन करने के लिए दिलचस्पी होगी अच्छी तरह से वयस्क माउस के रूप में
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय संस्थानों के आर्थथिटिस और मस्कुलोस्केलेलेट और त्वचा रोग अनुदान (झांग एलजे के लिए R01AR069653), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य सहायता संस्थान (सीए के लिए 5T32AR062496-03) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
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