Summary
I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.
Abstract
Il keratinocyte (KC) è il tipo di cellula predominante nell'epidermide, lo strato più esterno della pelle. I KC epidermici svolgono un ruolo fondamentale nel fornire la difesa della pelle, formando una barriera cutanea intatta contro gli insulti ambientali, come l'irradiazione UVB o gli agenti patogeni e anche avviando una risposta infiammatoria su tali insulti. Qui descriviamo metodi per isolare i KC dalla cute del neonato e dalla pelle adulta di coda del mouse. Descriviamo anche le condizioni di coltura usando gli integratori di crescita definiti (dGS) in confronto al siero bovino fetale chelexed (cFBS). Funzionalmente, dimostriamo che sia KC neonatali che adulti sono altamente reattivi per l'alta calcio-indotta della differenziazione dei terminali, alla stretta formazione di giunzione e stratificazione. Inoltre, i KC adulti coltivati sono suscettibili di morte cellulare causata da UVB e possono rilasciare grandi quantità di TNF dopo l'irraggiamento UVB. Insieme, i metodi qui descritti saranno utili ai ricercatori per la messa a punto del modello in vitroS per studiare la biologia epidermica nel mouse neonatale e / o nel mouse adulto.
Introduction
La pelle è l'organo più grande del corpo con l'epidermide come lo strato più esterno. L'epidermide svolge un ruolo fondamentale nella formazione di una barriera epidermica intatta per separare il corpo dall'ambiente, impedendo così la perdita di acqua e protegge dagli insulti ambientali, come gli allergeni, gli agenti patogeni e l'esposizione UVB. L'epidermide si sviluppa da un unico strato di cheratinociti basali (KCs) indifferenziati in un epitelio stratificato multistrato costituito da uno strato basale seguito da uno strato spinoso, uno strato granulare e uno strato corneo. I KC basali, costituiti da cellule staminali epidermiche e cellule di transito-amplificazione, sono proliferative e indifferenziate. Poiché i KC basali usciranno dal ciclo cellulare, le cellule si impegnano a differenziarsi e gradualmente migrare verso la superficie dell'epidermide, accompagnate dalla maturazione delle giunzioni delle cellule cellulari e alla formazione di una barriera permeabilità epidermica (EPB). I KC nello strato spinoso esprimono la differenziazione precoceMarcatori ioni come Keratin 10 (K10); Mentre i KC migrano allo strato granulare, le cellule esprimono marcatori di differenziazione tardiva come Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). Allo strato corneo, i KCs diventano terminali corneociti differenziati, che vengono infine sparati attraverso la desquamazione quando le nuove cellule li sostituiscono.
Il calcio è considerato l'agente più fisiologico nell'epidermide e provoca la differenziazione in vitro e in vivo in modo simile. Nell'epidermide della pelle normale, gli ioni di calcio formano un caratteristico "gradiente di concentrazione", aumentando la concentrazione verso la superficie della pelle 1 , 2 , 3 . La concentrazione di calcio sale da bassi livelli nei sottosuperfici più bassi (basi e spinosi) ad un picco dello strato granulare superiore e poi scende a livelli trascurabili nello strato più superficiale (strato corneo). Il gradiente di calcio si sviluppa coincidente anche con l'emergere di una barriera di permeabilità del componente, che sostiene che la segnalazione di calcio svolge un ruolo fondamentale della differenziazione del KC. In vitro , il basso contenuto di calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferazione dei KC basali come monostrato, mentre alto contenuto di calcio (> 0,1 mM) induce un impegno rapido e irreversibile delle cellule alla differenziazione dei terminali come dimostrato dalla formazione di stretti giunti e dall'induzione Di LOR e INV su un trattamento di calcio alto ai KC basali 4 , 5 .
Oltre alla formazione di barriera, i KC epidermici sono anche una componente importante del sistema immunitario innato della pelle. In risposta agli agenti patogeni o agli schemi molecolari associati danneggiati (DAMP) rilasciati all'irraggiamento o lesioni UVB, i KCs possono produrre grandi quantità di citochine infiammatorie, quali TNFα, IL6 e IFNβ, che portano all'attivazione del sistema immunitario> 6 , 7 , 8 , 9 . Sebbene sia necessaria una corretta indicazione infiammatoria da KC per la clearance del patogeno, la risposta infiammatoria incontrollata può innescare lo sviluppo di malattie cutanee auto-infiammatorie, come la psoriasi e la rosacea 6 , 8 .
Nel complesso, i KC svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la barriera cutanea intatta e iniziare una risposta immunitaria su invasione degli agenti patogeni o insulti ambientali. Pertanto, la cultura primaria di KC epidermici è una tecnica utile per studiare la biologia epiteliale, la differenziazione del KC, così come le risposte immunitarie innate di KC. L'isolamento e la cultura di KC epidermici del mouse primario possono essere un processo impegnativo dovuto alla suscettibilità e alla sensibilità di KC a vari stimolanti esterni. Qui descriviamo un metodo per isolare e coltivare KC da una pelle al neonato o da un topoPelle adulta della coda del mouse. Per l'isolamento adulto di KC non usiamo la pelle dorsale del mouse perché isolare quantità sufficienti di KC vitali da questo tessuto può essere difficile per i seguenti motivi: In primo luogo, la pelle dorsale adulta alla fase di riposo del ciclo dei capelli (telogen) è costituita da un Sottile epidermide con solo 1-2 strati di cellule, portando ad un rendimento a bassa cella e alla separazione inefficiente dell'epidermide dal derma, che è il passo fondamentale per l'isolamento di successo di KC. In secondo luogo, l'elevata densità dei follicoli dei capelli presenti sulla pelle dorsale adulta contribuisce ulteriormente alla difficoltà di separare l'epidermide dal derma. Al contrario, utilizziamo abitualmente la pelle della coda come sorgente per i topi adulti del KC, poiché questo epitelio è più spesso con 3-5 strati di KC epidermici. Ha anche una densità inferiore dei follicoli dei capelli, che non interferisce con la separazione epidermica, consentendo quindi l'isolamento di KC da qualsiasi pelle adulta del cervello per adulti, indipendentemente dall'età e dalla fase di ciclismo dei capelli del mouse. La neona isolataTal KCs vengono seminati a piatti di coltura rivestiti in gelatina, mentre i piatti rivestiti con collagene vengono impiegati per seminare KC adulti isolati a causa della capacità compromessa delle cellule adulte ad aderire rispetto alle loro controparti neonatali. Per la coltivazione del KCs del topo, il medium basico a basso contenuto di calcio è integrato con dGS, che contiene il fattore di crescita epidermico (EGF), il transferrin bovino, il fattore di crescita di insulina-like (IGF1), il prostaglandina E2 (PGE2), l'albumina del siero bovino (BSA) e l'idrocortisone. Tra 2-4 giorni dopo la placcatura iniziale, la maggior parte dei KC differenziati può essere lavata durante i cambiamenti medi giornalieri e le restanti cellule aderenti mostrano la tipica morbologia dei ciottoli 4 , si proliferano e non esprimono il marker di differenziazione precoce K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali UCSD.
1. Isolamento e coltura primaria del KC del mouse dalla pelle neonatale
- Sacrifica il giorno dopo-natalizio 0-2 neonati del ceppo C57B / 6 del mouse selvatico da decapitazione con forbici. Tagliare gli arti appena sopra le articolazioni del polso e della caviglia, poi tagliare completamente la coda, lasciando un piccolo foro.
- Per sbucciare tutta la pelle, prima inserire forbici affilate attraverso il foro alla coda e tagliare la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all'apertura sul collo. Quindi, utilizzare una pinza per afferrare il corpo esposto e l'altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente tutta la pelle dal corpo e sopra le gambe delle gambe con un solo movimento continuo.
- Scorri la pelle come un pezzo intatto e fai attenzione a non rompere la pelle in pezzi, in quanto ciò comporterà perdite di cellule durante la fase di dispersione.
<Li> Sciacquare la pelle pelata con 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm e quindi posizionare la pelle da ogni cucciolo in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a ghiaccio a ghiaccio, che contiene 4 mg / ml di dispersa nel mezzo di crescita KC (KC mezzo basale trovi 0.06 mM CaCl 2, DG e antibiotici / antimicotici). - Assicurarsi che la pelle non sia piegata nel tubo poiché ciò comporterà un'esposizione insufficiente della regione piegata alla soluzione di dispersione.
- Il giorno successivo (dopo 12-18 h in dispersione), trasferire la pelle insieme alla soluzione di dispersione in un piatto di Petri. Trasferire ogni pezzo di tessuto a un nuovo piatto di Petri con 15 ml di sterile PBS per lavare l'eccesso di dispersione.
- Utilizzando due coppie di pinze, afferrare la pelle da PBS,Sollevare la pelle e trasferirsi in un nuovo piatto di Petri con il lato epidermico verso il basso e il lato del derma verso l'alto. Stendere con attenzione la piega della pelle in modo che sia completamente estesa sul piatto di Petri.
- Porre 500 μL di una soluzione di digestione a base di tripsina per ogni pelle in un nuovo piatto di Petri. Usando le pinze, lentamente sollevate il derma e lontano dall'epidermide, tenendo l'epidermide verso il basso. Smaltire il derma come materiale biochimico. Trasferire l'epidermide separata e fluttuare su ogni goccia di soluzione di tripsina con lo strato basale verso il basso.
- Se l'epidermide è piegato sulla soluzione della tripsina, rimuovere le pieghe usando le pinze per assicurare una digestione efficiente di KC basali dall'epitelio.
- Incubare la pelle su un piatto di Petri nella soluzione di trysina a temperatura ambiente (con coperchio coperto) su un agitatore orizzontale con agitazione leggera per 20 minuti.
- Aggiungere 2 ml di supporto di crescita KC supplementare per epidermide (circa 1 pollice per dimensione perEpidermide) al piatto di Petri. Afferrare l'epidermide usando le pinze, e strofinare con forza l'epidermide avanti e indietro per rilasciare singole cellule dal foglio epidermico.
- Osservare il mezzo girare sempre più torbido come le cellule sono staccati dall'epidermide. Inclinare il piatto di Petri per raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo lasciando il foglio epidermico rimanente sul piatto.
- Ripetere ancora due volte lo sfregamento del foglio epidermico dopo aver aggiunto 2 ml di mezzo di crescita KC e combinare le sospensioni cellulari nello stesso tubo.
- Pipettare la soluzione cellulare sollevandola dolcemente e brevemente per rompere qualsiasi grumo cellulare utilizzando la pipetta serologica appropriata, quindi passare attraverso un filtro da 100 μm ad un nuovo tubo centrifuga da 50 ml.
- Centrifugare le cellule filtrate per 5 min a 180 x g.
- Aspirare il surnatante e riposizionare delicatamente il pellet di cellula in 1 ml di freddo medium di crescita KC / epidermide.
- Conte le cellule da un emocitometro.
- Seme le cellule ad una densità di 5 x 10 4 / cm 2 in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con un prodotto di matrice extracellulare (ECM) che promuove l'attaccamento cellulare.
NOTA: Utilizziamo un prodotto commerciale disponibile (ad es. Fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina (cfr. La tabella dei materiali per dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% CO 2 a 37 ° C Rifornito ogni altro giorno.- Per il rivestimento, rivestire i piatti di coltura con il materiale di rivestimento di fissaggio cellulare riscaldato a temperatura ambiente per 10 minuti fino a 2 ore prima della chiusura delle cellule. Rimuovere il fattore di attacco poco primaAggiungendo la sospensione cellulare.
- Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell'esperimento.
NOTA: Gli isolati di pelle multipli possono essere combinati e incubati in un tubo da 15 ml (fino a 5 pelli per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione. Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore.
2. Isolamento primario del mouse KC dalla pelle adulta della coda
- Sacrificare un adulto C57BL / 6 mouse (preferibilmente tra 6 e 15 settimane di età, sia maschile che femminile) secondo le norme sulla struttura degli animali. Tagliare la coda dal corpo dalla base della coda e tagliare ~ 2 mm della punta della coda in modo che vi sia un foro visibile alla punta.
- Per sbucciare la pelle della coda, utilizzare prima una lama tagliente per tagliare la pelle della coda dalla base alla punta della coda. Successivamente, utilizzare una pinza per afferrare l'osso della coda esposto e l'altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente la pelle della coda dall'osso con un movimento continuo. Tagliare la pelle pelata dalla linea mediana in modo che ogni pezzo sia inferiore a 2-3 cm.
- Sciacquare la pelle sbucciataH 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm, quindi posizionare la pelle da ciascuna coda in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a freddo di ghiaccio (4 mg / ml di dispersione nel mezzo di crescita KC).
NOTA: È possibile combinare più pezze di pelle e incubare in un tubo da 15 ml (fino a 5 code per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione.- Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore.
- Eseguire le operazioni da 1.4 a 1.13 per isolare la sospensione a singola cellula dall'epidermide della coda.
- Seed le cellule adulte ad una densità di 10 x 10 4 / cm 2 (contato da un ematocitometro) in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con collagene.
NOTA: Utilizziamo un kit di rivestimento a base collagene disponibile sul mercato (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C, e il mezzo fresco è stato rifornito ogni altro giorno. In generale, la cI piatti di ulture devono essere rivestiti con collageno per 30 minuti a 1 ora prima della semina delle cellule. Osserviamo che esiste un significativo aumento dell'adesione adulti KC al piatto quando ricoperto di collagene rispetto al fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina. - Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell'esperimento.
3. In vitro differenziazione di KC da High Calcium
- Per indurre il differenziamento terminale, aggiungere CaCl 2 a 0,2 mm nel terreno di coltura.
- In alternativa, affamati i KC coltivati durante la notte senza aggiunta di integratori di crescita in bassi bassi KC a basso contenuto di calcio prima dell'aggiunta di alto calcio.
NOTA: La fame di crescita del fattore di crescita migliorerà l'impegno delle cellule alla differenziazione precoce e l'induzione di marcatori di differenziazione precoce, come K10 5
4. Irradiazione UVB Morte cellulare mediata e rilascio TNFa da KC
- Coltivare il mouse KCs nel mezzo di crescita KC (in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C) con il cambio medio giornaliero fino a quando le cellule raggiungono confluenza. Immediatamente prima dell'irraggiamento UVB, rimuovere il mezzo di crescita e sostituire con 500 μL di PBS. Quindi sottoporre le cellule a 25 mJ / cm 2 UVB o controllo falso (no UVB).
NOTA: L'irraggiamento UVB viene eseguito utilizzando lampade UVB portatili con due lampadine da 8 W (312 nm) come descritto in precedenza 10 . Dopo l'irraggiamento UVB, PBS viene aspirato e viene aggiunto il mezzo fresco. - Misurare e quantificare la vitalità cellulare mediante il test di vitalità della cellula CCK-8 a 6, 8 e 24 h post-trattamento UVB seguendo l'istruzione del produttore 11 .
- Raccogliere il mezzo condizionato dai KC trattati con UVB nei punti di tempo desiderati e misurare la TNFa rilasciataNel mezzo condizionato dal kit Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA seguendo le istruzioni del produttore 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elevata differenziazione terminale indotta da calcio di KC neonatali e adulti. Epidermico principale del mouse KC placcato e mantenuta a 0,06 mM CaCl 2 cresciuto come un monostrato, e singole celle aveva una forma poligonale con spazio intercellulare distinto, che mostra un aspetto di ciottoli quando confluenti (Figura 1A e Figura 2A). Aumento del CaCl 2 a 0,2 mM ha indotto un rapido cambiamento morfologico delle cellule. Entro 8 ore dopo l'alto interruttore di calcio, le cellule sono diventate appiattite e il distinto spazio intercellulare è diventato meno evidente e per 24 h l'adesione delle cellule cellulari con snodi stretti è diventata evidente ( Figura 1A e Figura 2B ). La formazione della busta cornificata delle cellule e della stratificazione delle cellule verticali è iniziata circa 48-72 h dopo l'alto interruttore di calcio ( Figura 2B). Per analizzare il rimodellamento actina e formazione stretta giunzione cellula-cellula durante l'interruttore calcio alto, KC trattata con 0,2 mM CaCl 2 sono stati colorati con falloidina (Figura 1B) per misurare il rimodellamento actina durante KC differenziamento 13. La formazione delle proiezioni filopodiali ricche di fibre di actina tra le cellule adiacenti è stata individuata già da 3h dopo l'interruttore di calcio e la rimodellamento della fibra dell'attinamento ha continuato a progredire tra 6-24h e per 48h la stratificazione cellulare diventa prominente ( Figura 1B ).
Sessiccabilità del KC a toccare la morte cellulare e il rilascio di TNFa . I topi adulti coltivati KCs sono stati esposti a irradiazione UVB a 25 mJ / cm 2 e sono state analizzate la vitalità cellulare e la TNFa liberata nel terreno di coltura. Come mostrato dalle immagini di contrasto di fase ( FigRe 3A), così come il saggio di vitalità cellulare ( Figura 3B ), l'UVB ha innescato una morte dipendente dal tempo dei KC. Entro 24 h la maggior parte delle cellule sono state arrotondate e sono state staccate dal piatto ( Figura 3A ). Come quantificato dal saggio di vitabilità della cellula, il ~ 90% delle cellule era morto entro 24 ore dopo il trattamento UVB ( Figura 3B ; p <0,001 calcolato con un test di confronto multiplo ANOVA a senso unico). Infine, abbiamo mostrato che TNFα, una importante citochina indotta da UVB e che apre l'apoptosi KC dopo l'irradiazione UVB 14 , è stata abbondantemente secreta (~ 250 pg / mL entro 24 ore dall'irradiazione UVB, p <0,001) nel terreno di coltura KCs trattati con UVB in modo dipendente dal tempo ( Figura 3C ).
figura 1: La cultura primaria di KC neonatali e High Calcium Induced Terminal Differentiation e la formazione di giunzione cellulare-cellula. ( A ). KC topo neonatale primari sono stati trattati con alto contenuto di calcio (0.2 mM CaCl 2), e le immagini a contrasto di fase 4X sono stati presi a 0 ora (Ctrl) e 8 ore dopo il trattamento. Barra di scala = 100 μm. ( B ). KC neonatali sono state differenziate in presenza di 0,2 mM CaCl 2, e le cellule sono state colorate con falloidina (rosso) per visualizzare la formazione di risalti filopodial ricche di fibre di actina tra le celle adiacenti durante la differenziazione. I nuclei sono stati contratti con DAPI e le fibre di actina sono state macchiate con rodamina falloidina. Barra di scala = 25 μm. Le immagini sono state prese a ingrandimento 20X utilizzando un microscopio a fluorescenza impostato sul canale DAPI (per la colorazione dei nuclei) e sul canale RFP (per la colorazione di actina). Lank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La cultura primaria e la differenziazione del terminale altamente calcio indotta da KCs adulti. ( A ). Immagini a contrasto di fase a 10x ingrandimento di KC adulti primari per 8 ore, 1 giorno, 2 giorni e 3 giorni dopo la placcatura iniziale. Il pannello superiore rappresenta le cellule coltivate in dGS e il pannello inferiore rappresenta le cellule coltivate in 10% di chelexed FBS (cFBS) con 8 ng / mL mouse EGF ricombinante. Barra di scala = 100 μm. ( B ). Confluenti adulto KCs topo sono state differenziate in presenza di 0,2 mM CaCl 2, e immagini a contrasto di fase con ingrandimento 10x sono stati prelevati a 0 (Ctrl), 8, 24, 48, e l'interruttore 72 h dopo calcio alto. Barra di scala = 100 μm.Nk "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La cultura primaria di KCs adulti e la suscettibilità di KC adulti a morte cellulare e rilascio di TNFα indotta da UVB. I topi adulti primari KCs sono stati coltivati alla confluenza, quindi esposti a irradiamento UVB a 25 mJ / cm 2 . ( A ) Le immagini a contrasto di fase con ingrandimento 10 volte prese a 12 e 24 ore dall'esposizione post-UVB hanno mostrato una morte cellulare indotta da UVB. Barra di scala = 100 μm. ( B ) La vitalità cellulare è stata quantificata dal saggio di vitabilità della cellula CCK-8 a 6, 8 e 24 h post-UVB trattamento. ( C ) Il rilascio indotto da UVB di TNFα ai media nei punti indicati è stato misurato mediante ELISA. Tutte le barre di errore indicano la media ± SEM. I valori p sono stati calcolati con un confronto multiplo ANOVA multiploTest (***, p <0.001) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'epidermide della pelle funziona come una barriera critica per separare e proteggere il corpo dall'ambiente esterno e danneggiare la perdita di acqua, gli agenti patogeni, il calore e l'irradiazione UV. I KC sono la linea di cellule predominante dell'epidermide e la coltura primaria dei KC epidermici è uno strumento utile per studiare e comprendere i processi biologici della formazione delle barriere e la risposta di KC a insulti ambientali in vitro .
Qui descriviamo metodi per isolare e coltivare primari KC epidermici dalla pelle del neonato e adulti. Mentre i KC primari del mouse possono essere comodamente isolati dalla cute del neonato, l'isolamento e la coltura di successo dei KC adulti sono considerati difficili a causa del tonificamento dell'epidermide e dell'elevata densità del follicolo dei capelli della pelle dorsale del mouse adulto. Il metodo qui descritto usa la pelle adulta di coda del mouse come una fonte conveniente e abbondante di KC basali. A causa della presenza di una folta epidermide e di bassa La densità del follicolo dei capelli nella pelle della coda, la fase critica di isolamento di KC separando l'epidermide dal derma diventa fattibile dopo la dispersione di overnight dispersione della pelle della coda. Al contrario, il nostro tentativo di isolare KC dalla pelle dorsale adulta usando questo protocollo non ha avuto successo, con conseguente bassa resa cellulare dopo l'isolamento e l'attacco a cellule basse dopo la placcatura. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di KC da parte della pelle dorsale adulta è stato riportato dopo la digestione di trysina durante la notte della pelle priva di peli 15 , suggerendo che la dispaziosa da sola non può essere sufficiente per estrarre KC follicolari dal derma della pelle dorsale adulta.
In questo protocollo, i KC primari sono stati coltivati in mezzo a basso contenuto di calcio integrato con dGS anziché il chelexed-FBS, esaurito dal calcio, che è stato ampiamente utilizzato in diversi protocolli di coltura del mouse KC precedentemente pubblicati 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. In questo studio abbiamo osservato che dGS è superiore al FBS chelexed per coltivare KCs del mouse adulto e per mantenere la morfologia cellulare basale di KC ( Figura 2A ), ma è probabile che l'efficacia di chelexed-FBS Per mantenere la morfologia basale del KC può dipendere dal lotto FBS usato in ogni studio.
Utilizzando i metodi qui presentati, abbiamo dimostrato che sia il KC epidermico neonatale che adulto hanno risposto all'elevata differenziazione del terminale innescato dal calcio, alla formazione di strisce e alla giunzione delle cellule strette ( Figura 1 E la figura 2 ). In generale, l'elevazione del livello di calcio extracellulare a più di 0,1 mM innesca la differenziazione terminale di KC basali 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. È stato riportato che un livello intermedio di calcio (0,1 - 0,16 mM) ha indotto sostanzialmente l'espressione di marcatori di differenziazione precoce, quali K1 e K10, durante i primi 24 h sull'interruttore di calcio, mentre K1 e K10 sono stati indotti solo in un piccolo Frazione di cellule trattate con un mezzo di calcio superiore (1 mM) 19 , 20 . Tuttavia, il più alto medium di calcio (≥1 mM) è stato ampiamente utilizzato in molti altri studi per indurre rapidamente e robustamente la stratificazione del KC e l'espressione di geni di differenziazione tardiva, come INV e LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Sulla base della nostra esperienza, un livello intermedio di calcio, come 0.2 mM CaCl 2, porta ad un inizio graduale e lento della differenziazione terminale, mentre un livello di calcio elevati (≥1 mm) Velocità drasticamente l'insorgenza di KC TERminal, portando ad una finestra di tempo più breve per studiare i cambiamenti cellulari durante la differenziazione. Pertanto, abbiamo utilizzato 0.2 mM CaCl 2 per indurre la differenziazione terminale KC, e abbiamo dimostrato che questo livello di calcio intermedio ha portato ad una graduale variazione della morfologia delle cellule basali ad una morfologia corneociti stratificato entro 72 ore dopo che l'interruttore di calcio (Figura 2B).
Il nostro gruppo ha dimostrato in precedenza che i KC epidermici svolgono anche un ruolo importante per avviare risposte infiammatorie a patogeni o DAMP rilasciati durante l'infortunio e / o l'irradiazione UVB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . In coerenza con quelle osservazioni in vivo , qui abbiamo mostrato che i topi coltivati KC adulti erano altamente suscettibili a morte cellulare innescata da UVB e KCs trattati con UVB hanno rilasciato un ampioQuantità di TNFα, che è una chiave citotina infiammatoria che attiva il sistema immunitario.
In sintesi, la coltura primaria di cellule KC epidermica del mouse fornisce un utile modello in vitro per studiare la formazione della barriera epidermica e la risposta immunitaria innata di KC e i metodi qui descritti saranno di interesse per i ricercatori che perseguono studi in biologia cutanea nel topo neonatale Così come nel mouse per adulti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'UNITATIVO NAZIONALE DI ARTHRITIS e MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 a Zhang LJ) e presso gli Istituti Nazionali di Sostegno alla Salute (5T32AR062496-03 a CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
