Summary
上皮ケラチノサイトは、機能的な皮膚バリアを形成し、外部環境傷害に対する宿主防御の最前線に位置付けられる。ここでは、新生児および成体マウスの皮膚からの表皮ケラチノサイトの単離および初代培養、およびケラチノサイトからの最終分化およびUVB誘発性炎症反応の誘導のための方法を記載する。
Abstract
ケラチノサイト（KC）は、皮膚の最外層である表皮の優勢な細胞型である。上皮KCは、UVB照射または病原体などの環境傷害に対するインタクトな皮膚バリアを形成することによって、またそれらの傷害に対して炎症反応を開始することによって、皮膚防御を提供する上で重要な役割を果たす。ここでは、新生児マウス皮膚および成体マウス尾皮膚からKCを単離する方法を説明する。本発明者らはまた、キレキシブウシ胎児血清（cFBS）と比較して規定された成長補助剤（dGS）を用いて培養条件を記載する。機能的には、新生児および成人の両方のKCが、高カルシウム誘発性の分化、タイトジャンクションの形成および層別化に対して高い応答性を有することを示す。さらに、培養された成体KCは、UVB誘発細胞死に感受性であり、UVB照射の際に大量のTNFを放出し得る。一緒に、ここに記載された方法は、インビトロモデルの設定のための研究者にとって有用であろう新生児マウスおよび/または成体マウスの表皮生物学を研究する。
Introduction
皮膚は体の最も大きな臓器であり、最も外側の層は表皮である。表皮は、身体を環境から分離する無傷の表皮障壁を形成する上で決定的に重要な役割を果たし、したがって水分喪失を防ぎ、アレルゲン、病原体およびUVB曝露などの環境傷害から防御する。表皮は、未分化基底ケラチノサイト（KC）の単一層から基底層、棘突起層、顆粒層および角質層からなる多層重層化上皮に発達する。表皮幹細胞および中継増幅細胞の両方からなる基底KCは、増殖性および未分化性である。基本的なKCが細胞周期を終了すると、細胞は分化に拘束され、細胞 - 細胞接合の成熟および表皮透過障壁（EPB）の形成を伴って、表皮の表面に向かって徐々に移動する。棘状層のKCは、早期の差異を示すケラチン10（K10）のようなイオンマーカー; KCが顆粒層に移動すると、細胞はフィラグリン（FLG）、ロリクリン（LOR）およびインボルクリン（INV）などの後期分化マーカーを発現する。角質層では、KCは最終的に分化した角質細胞になり、最終的に新しい細胞がそれらに取って代わると落屑から流出する。
カルシウムは、表皮において最も生理学的に作用する物質であると考えられ、 インビトロおよびインビボで同様の方法で分化を誘発する。正常な皮膚表皮において、カルシウムイオンは、皮膚表面1、2、3に向かって濃度が増加し、特徴的な「濃度勾配」を形成します。カルシウム濃度は、最も低い副層（基底および棘の層）の低レベルから上部の顆粒層のピークまで上昇し、次いで最も表面の層（角質層）において無視できるレベルまで低下する。カルシウム勾配は、カルシウム透過性がKC分化の重要な役割を果たすことを裏付ける成分透過性障壁の出現と同時に発生する。 インビトロでは 、低カルシウム（0.02-0.1mM）は単層としての基底KCの増殖を維持するが、高カルシウム（> 0.1mM）はタイトジャンクション形成および誘導によって示されるように細胞の最終分化への迅速かつ不可逆的なコミットメントを誘導する基底KCS 4、5〜高カルシウム処理時LOR及びINVの。
障壁形成に加えて、表皮KCも皮膚の先天性免疫系の重要な構成要素である。 UVB照射または傷害時に放出される病原体または損傷関連分子パターン（DAMP）に応答して、KCはTNFα、IL6およびIFNβのような大量の炎症性サイトカインを産生し、免疫系の活性化をもたらす> 6、7、8、9。 KCSから適切な炎症性シグナル伝達は、病原体のクリアランスに必要であるが、制御されない炎症性応答は、乾癬および酒6,8として自己炎症性皮膚疾患の発生をトリガすることができます。
全体として、KCは、無傷の皮膚バリアを維持し、病原体侵襲または環境傷害に対する免疫応答を開始する上で重要な役割を果たす。したがって、表皮KCの初代培養は、上皮生物学、KC分化、およびKC刺激による自然免疫応答を研究するための有用な技術である。主要マウス表皮KCの単離および培養は、KCの感受性および様々な外部刺激剤に対する感受性のために、困難なプロセスであり得る。ここでは、新生仔マウスの皮膚からKCを単離して培養する方法を説明します。成体マウスの尾の皮膚。成人のKC単離では、以下の理由により、この組織から十分な量の生存可能なKCを単離することが困難なため、マウス背側皮膚を使用しない：第1に、毛周期（休止期）の休止期における成人背側皮膚は、真皮からの表皮の非効率的な分離をもたらし、これは成功したKC単離のための重要なステップである。第2に、成人の背部皮膚上に存在する高い毛嚢密度は、真皮から表皮を分離することの困難さにさらに寄与する。その代わりに、我々は成体マウスKCsの供給源として尾皮膚を日常的に使用する。なぜなら、この上皮は表皮のKCの3〜5層でより厚いからである。それはまた、表皮の分離を妨げない、より低い毛嚢密度を有し、したがって、マウスの年齢および毛髪サイクリング段階に関係なく、成体マウス尾皮膚からのKC単離を可能にする。孤立した新生児タルKCをゼラチンコート培養皿に播種し、新生児対応細胞と比較して成体細胞が接着する能力が損なわれているため、コラーゲン被覆皿を用いて単離された成体KCを播種する。マウスKCを培養するために、低カルシウム基礎培地に、表皮成長因子（EGF）、ウシトランスフェリン、インスリン様増殖因子c1（IGF1）、プロスタグランジンE2（PGE2）、ウシ血清アルブミン（BSA）およびヒドロコルチゾンを含むdGSを補充する。最初の播種後2〜4日の間に、分化したKCの大部分は毎日の培地交換の間に洗い流すことができ、残りの接着細胞は典型的な敷石形態4を示し 、増殖し、早期分化マーカーK10を発現しない。
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Protocol
すべての動物実験は、UCSD機関動物管理および使用委員会の承認を受けています。
1.新生児皮膚由来の初代マウスKC単離および培養
- C57B / 6野生型マウス系統の生後0-2日の新生児をハサミを用いた断頭により犠牲にする。手首と足首の関節のすぐ上の手足を切断し、小さな穴を残して尻尾を完全に切断します。
- 皮膚全体を剥がすには、まず鋭いはさみを尾の穴に挿入し、身体の背中の中央線に沿って首の開口部に皮膚を切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した身体と他の鉗子で皮膚をつかみ、身体から皮膚全体を1つの連続した動きで脚の切り株に静かに引き剥がします。
- 損傷のない部分として皮膚を剥がし、皮膚を破片に分解しないように注意してください。これは、ディスパーゼ工程中に細胞が失われるためです。
<10cmのペトリ皿中の15mLの滅菌PBSで剥離した皮膚をすすぎ、次にKC増殖培地中に4mg / mLのディスパーゼを含む氷冷ディスパーゼ消化緩衝液を充填した2mLのチューブに各仔の皮膚を入れる（KC基礎培地は0.06mMのCaCl 2 、dGSおよび抗生物質/抗真菌薬を有する）。 - 皮膚が折り畳まれていないことを確認してください。折り畳まれた部分がディスパーゼ溶液に不十分に曝されることになります。
- 翌日（ディスパーゼで12〜18時間後）、ディスパーゼ溶液と共に皮膚をペトリ皿に移す。過剰のディスパーゼを洗い流すために、15mLの滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に各組織片を移す。
- 2対の鉗子を使用して、PBSから皮膚をつかみ、皮膚を持ち上げ、表側を下に、真皮側を上にして新しいペトリ皿に移す。肌のひだを注意深く引き伸ばし、ペトリ皿に完全に引き伸ばす。
- 新しいペトリ皿に各皮膚のためのトリプシンベースの消化溶液500μLを置きます。鉗子を使用して、表皮を下にして、表皮から真皮をゆっくり持ち上げます。生物を危険な物質として真皮を処分する。分離した表皮を移し、基底層を下にしてトリプシン溶液の各滴に浮遊させる。
- 表皮がトリプシン溶液で折りたたまれている場合は、上皮からの基底KCの効率的な消化を確実にするために、鉗子を使用して折り畳みを除去します。
- 穏やかに攪拌しながら水平シェーカー上で20分間室温（蓋を覆った状態）でトリプシン溶液中のペトリ皿上の皮膚をインキュベートする。
- 表皮あたり2mLの補充KC増殖培地（1平方インチあたり約1平方インチ表皮）をペトリ皿に加える。鉗子を使用して表皮を把握し、表皮を前後に激しくこすって表皮シートから単一細胞を放出させる。
- 細胞が表皮から分離するにつれて、中程度の濁りがますます激しくなるのを見てください。ペトリ皿を傾けて収集し、細胞懸濁液を新しいチューブに移し、残りの表皮シートを皿上に残す。
- 2mLのKC増殖培地を添加した後、表皮シートをこすって2回以上繰り返し、同じチューブ内の細胞懸濁液を合わせる。
- 適切な血清学的ピペットを使用して細胞塊を壊すために、細胞溶液を上下に穏やかに数回ピペットし、100μmフィルターに通して新しい50mL遠心チューブに移す。
- ろ過した細胞を180 x gで5分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの冷たいKC増殖培地/表皮に静かに再懸濁する。
- 血球計数器で細胞を数える。
- 細胞接着を促進する細胞外マトリックス（ECM）産物で予め被覆した培養皿中のKC増殖培地で5×10 4 / cm 2の密度で細胞を播種する。
注：我々は、市販のものを使用しています（例：ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子（詳細については表を参照）。5％CO 2の加湿インキュベーターで37℃で細胞を培養し、一日おきに補充する。- コーティングのために、細胞播種前に10分〜2時間室温に加温された細胞付着コーティング材料で培養皿をコートする。直前のアタッチメント係数を削除する細胞懸濁液を添加する。
- 初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。
注：複数の皮膚分離株を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり最大5つのスキン）でインキュベートすることができます。ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。
2.成体テールスキンからの一次マウスKC単離
- 動物施設の規定に従って、成体C57BL / 6マウス（好ましくは、6〜15週齢、男性または女性）を屠殺する。テールベースから身体の尾を切り取り、先端に目に見える穴ができるように尾の先端を〜2 mmカットします。
- 尾の皮を剥がすには、まず鋭い刃を使って裾の皮を基部から尾の先端まで切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した尾骨と他の鉗子で皮膚をつかみ、穏やかに1つの連続した動きで骨から尾の皮膚を剥がします。ミッドラインから剥がした肌を切り取って、各部分の長さが2〜3cm未満になるようにします。
- 剥がした肌をすすいでください10cmのペトリ皿に15mLの滅菌PBSを入れ、次に氷冷ディスパーゼ消化緩衝液（KC増殖培地中の4mg / mLディスパーゼ）で満たした2mLチューブに各尾から皮膚を置く。
注：複数の皮膚片を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり5テールまで）でインキュベートすることもできます。- ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。
- 単一の細胞懸濁液を尾の表皮から単離するために、ステップ1.4からステップ1.13を実行する。
- コラーゲンでプレコートした培養皿中のKC増殖培地中で10×10 4 / cm 2 （血球計算盤で計数）の密度で成体細胞を播種する。
注：市販のコラーゲンベースのコーティングキットを使用しています（詳細については、 表を参照）。細胞を37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターで培養し、1日おきに新鮮な培地を補充した。一般に、c最終的な皿は、細胞播種の30分から1時間前にコラーゲンでコーティングされるべきである。本発明者らは、ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子と比較して、コラーゲンでコーティングした場合、皿に成人のKC付着が有意に増強することを観察する。 - 初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。
3.高カルシウムによるKCのin vitro分化
- 最終分化を誘導するために、培地中に0.2mMまでCaCl 2を添加する。
- あるいは、高カルシウムを添加する前に、低カルシウムKC基礎培地に増殖補助剤を添加せずに、一晩培養したKCを飢餓状態にする。
注：成長因子飢餓は早期分化への細胞のコミットメントを高め、早期分化マーカー、例えばK10 5
4.KBからのUVB照射細胞致死およびTNFα放出
- KC増殖培地（37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中）でマウスKCを培養し、細胞がコンフルエンシーに達するまで毎日培地を交換する。 UVB照射の直前に、増殖培地を除去し、500μLのPBSと交換する。次に、細胞を25mJ / cm 2 UVBまたはモックコントロール（UVBなし）に付す。
注：UVB照射は、以前10に記載されているように2個の8 W電球（312 nm）を有するハンドヘルドUVBランプを用いて行われます。 UVB照射後、PBSを吸引し、新鮮な培地を加える。 - 測定及び6,8でCCK-8細胞生存率アッセイによって細胞生存率を定量化し、製造業者の説明書11以下の24時間後UVB治療。
- 所望の時点でUVBで処理したKCから馴化培地を収集し、放出されたTNFαを測定する製造業者の指示7、12以下マウスTNF（モノ/モノ）ELISAキットによって馴化培地です。
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Representative Results
高カルシウムは、新生児および成人のKCの最終分化を誘導した。 0.06mM CaCl 2で平板培養し維持した初代マウス表皮KCは、単層として増殖し、個々の細胞は、明確な細胞間空間を有する多角形を有し、コンフルエントになると、石畳の外観を示した（ 図1Aおよび図2A ）。 CaCl 2を0.2mMまで上昇させると、細胞の急速な形態変化が誘導された。高カルシウム交換後8時間以内に、細胞は平らになり、明確な細胞間スペースはほとんど見られなくなり、24時間までにタイトジャンクションによる細胞 - 細胞接着が明らかになった（ 図1Aおよび図2B ）。角化細胞エンベロープの形成および垂直細胞層別化は、高カルシウムスイッチ後約48〜72時間に開始した（ 図2B）。高カルシウムスイッチ中のアクチンリモデリングおよび細胞 - 細胞密着結合形成を分析するために、0.2mM CaCl 2で処理したKCをファロイジンで染色し（ 図1B ）、KC分化中のアクチンリモデリングを測定した13 。隣接する細胞間のアクチン繊維に富む糸状突起突起の形成は、カルシウムスイッチの3時間後に早期に検出され、アクチン繊維のリモデリングはさらに6〜24時間進行し、48時間で細胞層別化が顕著になった（ 図1B ）。
UVB誘発細胞死およびTNFα放出に対するマウスKCの感受性 。培養した成体マウスKCを25mJ / cm 2の UVB照射に曝露し、培地中に放出された細胞生存率およびTNFαを分析した。位相コントラスト画像（ Figure 3A）ならびに細胞生存率アッセイ（ 図3B ）では、UVBはKCの時間依存性死を引き起こした。 24時間までに、細胞の大部分が丸められ、ディッシュから分離された（ 図3A ）。細胞生存率アッセイにより定量したところ、約90％の細胞がUVB処理後24時間以内に死亡した（ 図3B ;一方向性ANOVA多重比較試験によって計算してp <0.001）。最後に、我々は、TNFα、UVB照射14以下UVBにより誘発されるとKCアポトーシスを駆動する重要なサイトカインは、豊富に分泌されたことを示した（〜24時間後UVB照射以内250 pg / mlで、p <0.001）の培養培地中UVB処理したKCを時間依存的様式で検出した（ 図3C ）。
図 【図1】新生仔マウスKCの初代培養および高カルシウム誘導性の分化および緊密な細胞 - 細胞接合形成。 （ A ）。初代新生児マウスKCを高カルシウム（0.2mM CaCl 2 ）で処理し、0時間（ctrl）および処置後8時間で4倍の位相差画像を撮影した。スケールバー=100μm。 （ B ）。新生児KCを0.2mM CaCl 2の存在下で分化させ、細胞をファロイジン（赤色）で染色して、分化中の隣接細胞間のアクチン繊維に富む糸状突起突起の形成を視覚化した。核をDAPIで対比染色し、アクチン繊維をローダミンファロイジンで染色した。スケールバー=25μm。 DAPIチャンネル（核染色用）およびRFPチャンネル（アクチン染色用）に設定された蛍光顕微鏡を用いて、20倍の倍率で画像を撮影した。 lank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
【図2】成体マウスKCの初代培養および高カルシウム誘導性のターミナル分化。 （ A ）。最初のプレーティングの8時間後、1日後、2日後および3日後の、初代成体マウスKCの10倍の倍率での位相差画像。上部パネルはdGSで増殖した細胞を示し、下部パネルは8ng / mL組換えマウスEGFを含む10％キレックスFBS（cFBS）で増殖した細胞を示す。スケールバー=100μm。 （ B ）。コンフルエントな成体マウスKCを0.2mM CaCl 2の存在下で分化させ、高カルシウムスイッチの0、ctrl、8時間後、24時間後、48時間後および72時間後に10倍の位相差画像を撮影した。スケールバー=100μm。nk ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：成体マウスKCの一次培養、およびUVB誘導性細胞死および成熟KCsのTNFα放出に対する感受性。初代成体マウスKCをコンフルエントになるまで培養し、次いで25mJ / cm 2の UVB照射に曝露した。 （ A ）UVB曝露12時間後および24時間後に撮影した10倍の倍率での位相差画像は、時間依存性のUVB誘発細胞死を示した。スケールバー=100μm。 （ B ）細胞生存率は、UVB処理の6,8および24時間後のCCK-8細胞生存率アッセイによって定量した。 （ C ）指示された時点で培地へのUVB誘発TNFαの放出をELISAによって測定した。すべての誤差バーは平均±SEMを示す。 p値は、一方向ANOVA多重比較によって計算したテスト（***、p <0.001） この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
皮膚の表皮は、身体を外部環境から分離し保護し、水分喪失、病原体、熱およびUV照射からの損傷に対する重大な障壁として機能する。 KCは表皮の優勢な細胞系統であり、表皮KCの初代培養は、インビトロでの障壁形成の生物学的プロセスおよび環境傷害に対するKCの応答を研究および理解するのに有用なツールである。
ここでは、初代表皮KCを新生児および成体マウス皮膚から単離および培養する方法を説明する。初代マウスKCは、新生仔マウス皮膚から好都合に単離することができるが、成体KCの単離および成功した培養は、表皮の薄層化および成体マウス背側皮膚の高い毛嚢密度のために困難であると考えられる。本明細書に記載の方法は、成体マウス尾皮膚を基礎KCの便利で豊富な供給源として使用する。厚い表皮の存在と低いため尾皮膚の毛包密度を高めるために、表皮を真皮から分離することによってKCを単離する重要な工程は、一晩の尾皮膚の消化後に実現可能となる。対照的に、このプロトコールを用いて成人の背部皮膚からKCを単離する試みは成功せず、単離後の細胞収率が低くなり、プレーティング後の細胞付着が低くなった。しかし、成人の背部皮膚からKCSの成功の分離と文化は、それだけでディスパーゼは、成人の背部皮膚の真皮から濾胞KCSを抽出するのに十分ではないかもしれない示唆、毛皮フリーの皮膚15の一晩のトリプシン消化した後に報告されています。
このプロトコルでは、一次KCSは、代わりに広くいくつかの以前に公開されたマウスKC培養プロトコル4、15で使用したカルシウム枯渇chelexed-FBSのDGSを補充した低カルシウム培地中で増殖させました 「> 16、17、18は、本研究では、DGSが培養成体マウスKCSにFBSをchelexedするとKCの基底細胞の形態（ 図2A）を維持するために優れていることが観察された。しかし、それはchelexed-FBSの有効性と思われますKCの基底形態を維持することは、各研究で使用されるFBSロットに依存し得る。
ここに示された方法を用いて、新生児および成人のマウス表皮KCの両方が、高カルシウム誘発性の終末分化、緊密な細胞接合形成および層別化に応答することを示した（ 図1 図2 ）。一般的に、0.1mm以下の外カルシウムレベルを上昇する基底KCS 4、5、17の最終分化をトリガし、ass = "xref"> 19。中程度のレベルのカルシウム（0.1〜0.16mM）は、カルシウムスイッチの最初の24時間の間に、K1およびK10のような早期分化マーカーの発現を実質的に誘導したが、K1およびK10は、より高いカルシウム培地（1 mM）の19、20で処理した細胞の割合。しかし、より高いカルシウム培地（≥1mM）を広く迅速かつロバストKC層化や、INVとLOR 4、21、22、23などの後期分化遺伝子の発現を誘導するために、多くの他の研究で使用されてきました。私たちの経験に基づいて、0.2mM CaCl 2のような中間レベルのカルシウムは、徐々に緩徐に末梢分化を開始しますが、より高いカルシウムレベル（1mM以上）はKC teの発症を劇的に加速します分化の間に細胞の変化を研究するための時間ウィンドウを短くする。したがって、我々はKC終末分化を誘導するために0.2mMのCaCl 2を使用し、我々はこの中間的なカルシウムレベルが、カルシウムスイッチ後72時間以内に基底細胞の形態を層状の角質細胞の形態に徐々に変化させることを示した（ 図2B ）。
当社グループは、以前表皮KCSも傷害および/またはUVB照射6、7、8、9、10中に放出された病原体または減衰に対する炎症反応を開始するために重要な役割を果たしていることを実証しました。これらのインビボ観察と一致して、ここで、培養した成体マウスKCはUVB誘発細胞死に非常に感受性であり、UVB処理KCは大きな免疫系を活性化する重要な炎症性サイトカインであるTNFαの量。
要約すると、初代マウス表皮KC細胞培養は、KCの表皮障壁形成および先天的免疫応答を研究するための有用なインビトロモデルを提供し、ここに記載された方法は、新生仔マウスの皮膚生物学における研究を追求する研究者にとって興味深い。大人のマウスと同様に。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、潰瘍性大腸炎（R01AR069653〜Zhang LJ）および国立衛生研究所（5T32AR062496-03〜CA）によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
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