Summary
Epidermal keratinocytter danner en funksjonell hudbarriere og er plassert på forsiden av vertsforsvaret mot eksterne miljøforstyrrelser. Her beskriver vi metoder for isolering og primærkultur av epidermale keratinocytter fra neonatal og voksen museskinn, og induksjon av terminal differensiering og UVB-utløst inflammatorisk respons fra keratinocytter.
Abstract
Keratinocytten (KC) er den dominerende celletypen i epidermis, det ytre laget av huden. Epidermal KCs spiller en kritisk rolle for å gi hudforsvar ved å danne en intakt hudbarriere mot miljøforstyrrelser, som UVB-bestråling eller patogener, og også ved å starte en inflammatorisk respons på disse fornærmelsene. Her beskriver vi metoder for å isolere KCs fra nyfødt museskinn og fra voksen mushale. Vi beskriver også dyrkningsbetingelser ved bruk av definerte veksttilskudd (dGS) sammenlignet med chelexed føtalt bovint serum (cFBS). Funksjonelt viser vi at både neonatal og voksne KCs er svært lydhør overfor høy kalsium-indusert terminal differensiering, stramt kryssformasjon og stratifisering. I tillegg er kultiverte voksne KCs utsatt for UVB-utløst celledød og kan frigjøre store mengder TNF ved UVB-bestråling. Sammen, vil metodene beskrevet her være nyttige for forskere for oppsett av in vitro- modellS for å studere epidermal biologi i nyfødt mus og / eller voksen mus.
Introduction
Huden er det største organet i kroppen med epidermis som det ytre mest lag. Den epidermis spiller en kritisk rolle i å danne en intakt epidermal barriere for å skille kroppen fra miljøet, og dermed forhindre vanntap og gir beskyttelse mot miljøskader, som allergener, patogener og UVB-eksponering. Den epidermis utvikler seg fra et enkelt lag av utifferentierte basal keratinocytter (KCs) til et flerskiktet stratifisert epitel som består av et basal lag, etterfulgt av et spinous lag, granulært lag og stratum corneum. Basal KCs, som består av både epidermale stamceller og transittforsterkende celler, er proliferative og utifferentierte. Etter hvert som basale KC'er forlater cellesyklusen, forplikter cellene seg til differensiering og gradvis migrere mot overflaten av epidermis, ledsaget av modning av cellekryssinger og dannelse av en epidermal permeabilitetsbarriere (EPB). KCs på spinous laget uttrykker tidlig differensiIonmarkører som Keratin 10 (K10); Når KCs migrerer til granulært lag, uttrykker cellene sen differensieringsmarkører som Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) og Involucrin (INV). På stratum corneum blir KC'ene terminalt differensierte corneocytter, som til slutt kaster av gjennom desquamation som nye celler erstatter dem.
Kalsium anses som det mest fysiologiske middel i epidermis og utløser differensiering in vitro og in vivo på en lignende måte. I normal hudepidermis danner kalsiumioner en karakteristisk "konsentrasjonsgradient", som øker i konsentrasjon mot hudoverflaten 1 , 2 , 3 . Kalsiumkonsentrasjonen stiger fra lave nivåer i de laveste underlagene (basale og spinøse lag) til en topp i det øvre granulære lag og faller deretter til ubetydelige nivåer i det mest overfladiske laget (stratum corneum). Kalsiumgradienten utvikler også tilfeldigvis med fremveksten av en komponentpermeabilitetsbarriere, som støtter at kalsiumsignaler spiller en kritisk rolle for KC-differensiering. In vitro opprettholder lavt kalsium (0,02-0,1 mM) proliferasjonen av basale KC som et monosjikt, mens høyt kalsium (> 0,1 mM) induserer en rask og irreversibel forpliktelse av cellene til terminal differensiering som demonstrert ved tett sammenkoblingsdannelse og induksjon Av LOR og INV på høy kalsiumbehandling til basale KCs 4 , 5 .
I tillegg til barriereformasjon er epidermal KC også en viktig komponent i hudens medfødte immunsystem. Som respons på patogener eller skadede assosierte molekylære mønstre (DAMP) som frigjøres ved UVB-bestråling eller skade, kan KCs produsere store mengder inflammatoriske cytokiner, slik som TNFa, IL6 og IFNβ, som fører til immunsystemaktivering> 6 , 7 , 8 , 9 . Selv om riktig inflammatorisk signalering fra KC er nødvendig for patogener, kan ukontrollert inflammatorisk respons utløse utviklingen av autoinflammatoriske hudsykdommer, som psoriasis og rosacea 6 , 8 .
Samlet sett spiller KCs en viktig rolle i å opprettholde den intakte hudbarrieren og initierer en immunrespons ved patogen invasjon eller miljøkamp. Derfor er primærkultur av epidermale KCer en nyttig teknikk for å studere epitelbiologi, KC-differensiering, samt KC-stimulerte medfødte immunresponser. Isolering og kultur av primære musepidermuskulære KC kan være en utfordrende prosess på grunn av KCs følsomhet og følsomhet over for ulike eksterne stimulanser. Her beskriver vi en metode for å isolere og dyrke KCer fra enten neonatal museskinn ellerVoksen mus hale hud. For KC-isolasjon av voksne bruker vi ikke musens dorsale hud, fordi isolering av tilstrekkelige mengder levedyktige KCer fra dette vevet kan være vanskelig av følgende grunner: Først består den voksne dorsale huden i hvilepasen av hårsyklusen (telogen) av en Tynn epidermis med kun 1-2 lag celler, som fører til lav celleutbytte og ineffektiv separering av epidermis fra dermis, som er det kritiske trinnet for vellykket KC-isolasjon. For det andre bidrar den høye hårfollikeltettheten som er tilstede på voksen dorsal hud, ytterligere til vanskeligheten ved å separere epidermis fra dermis. I stedet bruker vi rygghud som kilden for voksne mus-KC, da dette epitelet er tykkere med 3-5 lag epidermal KCs. Det har også en lavere hårfollikkel tetthet, noe som ikke forstyrrer epidermiseparasjonen, slik at KC-isolasjon fra hvilken som helst voksen musestik hud, uavhengig av alder og hårsyklusstadiet av musen. Den isolerte neonaenTal-KCs blir podet til gelatin-belagte kulturretter, mens kollagenbelagte retter brukes til frø isolerte voksne KCs på grunn av den svekkede evne hos de voksne cellene til å kle seg i forhold til deres neonatale kolleger. For å dyrke mus-KC-er, blir lavt kalsiumbasalt medium tilsatt dGS, som inneholder epidermal vekstfaktor (EGF), bovint transferrin, insulinlignende vekstfaktor1 (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), bovint serumalbumin (BSA) og hydrokortison. Mellom 2-4 dager etter den første plating, kan de fleste differensierte KCs vaskes bort under daglige mediumendringer, og de resterende vedhengende celler viser typisk brostenmorfologi 4 , prolifererer og uttrykker ikke den tidlige differensieringsmarkør K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk er godkjent av UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Primær mus KC-isolasjon og kultur fra neonatal hud
- Offer de postnatala dagene 0-2 nyfødte fra C57B / 6 wildtype musestammen ved å avtappe med saks. Kutt av lemmer rett over håndleddet og ankelleddene, så kutt av halen helt, og la et lite hull.
- For å fjerne hele huden, sett først skarpe saks gjennom hullet på halen og kutt huden langs dorsal midtlinjen av kroppen til åpningen på nakken. Deretter bruker du en tang for å ta tak i den eksponerte kroppen og de andre tangene for å ta tak i huden, og skyll forsiktig hele huden av kroppen og over benstubene med en kontinuerlig bevegelse.
- Skal av huden som et intakt stykke, og vær forsiktig så du ikke brer huden i stykker, da dette vil resultere i cellefeil under dispash-trinnet.
<Li> Skyll den skrællede huden med 15 ml steril PBS i en 10 cm petriskål, og legg deretter huden fra hver pup i et 2 ml rør fylt med iskall dispenseringsfordøyer, som inneholder 4 mg / ml dispas i KC vekstmedium (KC basal medium har 0,06 mM CaCl2, DGS, og antibiotika / antimykotika). - Pass på at huden ikke brettes i røret, da dette vil resultere i utilstrekkelig eksponering av det brettede området til dispase-løsningen.
- På neste dag (etter 12-18 timer i dispase), overfør huden sammen med dispase-løsningen til en petriskål. Overfør hvert vevstykke til en ny petriskål med 15 ml sterilt PBS for å vaske bort overflødig dispensering.
- Bruk to par tapper, ta tak i huden fra PBS,Løft huden, og overfør til en ny petriskål med epidermal side ned og dermis side opp. Forsiktig strekke hudfoldene slik at den er fullt utstrakt på petriskålen.
- Plasser 500 μL av en trypsinbasert fordøyelsesløsning for hver hud i en ny petriskål. Ved hjelp av tapper, løft sakte dermis opp og bort fra epidermis, mens du holder epidermis nede. Kast dermis som biologisk skadelig materiale. Overfør den separerte epidermis og flyte på hver dråpe trypsinløsning med basallaget nedover.
- Hvis epidermis foldes på trypsinoppløsningen, fjern eventuell brett ved hjelp av pincet for å sikre effektiv fordøyelse av basale KCer fra epitelet.
- Inkuber huden på en petriskål i trypsinoppløsning ved romtemperatur (med lokket dekket) på en horisontal rister med mild omrøring i 20 minutter.
- Tilsett 2 ml supplert KC vekstmedium per epidermis (ca. 1 kvadrat i størrelse prEpidermis) til petriskålen. Ta tak i epidermisene ved hjelp av tau og kraftig gni epidermis frem og tilbake for å frigjøre enkeltceller fra epidermisk ark.
- Se på mediet blir stadig grumset som celler løsnes fra epidermisene. Kant opp petriskålen for å samle og overføre cellesuspensjonen til et nytt rør som forlater det gjenværende epidermiske arket på fatet.
- Gjenta to ganger ganger gnidningen av det epidermale arket etter tilsetning av 2 ml KC vekstmedium, og kombinere cellesuspensjonene i samme rør.
- Pip opp celleoppløsningen opp og ned forsiktig et par ganger for å bryte noen celleklemmer ved hjelp av riktig serologisk pipette, og send det gjennom et 100 μm filter til et nytt 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger de filtrerte cellene i 5 minutter ved 180 x g.
- Aspirer av supernatanten og forsiktig resuspender cellepellet i 1 ml kaldt KC vekstmedium / epidermis.
- Telle cellene med et hemocytometer.
- Sæd cellene ved en tetthet på 5 x 10 4 / cm 2 i KC-vekstmedium i kulturretter pre-belagt med et ekstracellulært matriks (ECM) produkt som fremmer cellefeste.
MERK: Vi bruker et kommersielt tilgjengelig (f.eks feste faktor, som er en gelatin-basert beleggmateriale (se tabell of Materials for detaljer) Celler ble dyrket i fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C, og friskt medium ble. Etterfylt hver annen dag.- For belegg, beleg kultiveringsrommene med cellefestebeleggmaterialet oppvarmet til romtemperatur i 10 minutter til 2 timer før cellesedningen. Fjern vedleggsfaktoren like førLegge til cellesuspensjonen.
- Bytt mediet 24 timer etter den første plating for å fjerne ukoblede celler, og bytt mediet daglig før cellene når ønsket konfluens før eksperimentet.
MERK: Flere hudisolater kan kombineres og inkuberes i ett 15 ml rør (opptil 5 skinn per rør) som inneholder 12 ml dispasløsning. Inkubér hudrøret over natten i et 4 ° C kjøleskap på en rotator.
2. Primær mus KC-isolasjon fra voksen halehud
- Oppdra en voksen C57BL / 6-mus (helst mellom 6-15 uker, enten mann eller kvinne) i henhold til dyreanleggsforskriften. Klipp av halen av kroppen fra halebunnen, og kutt av ~ 2 mm av halsspissen slik at det er et synlig hull på spissen.
- For å skille halen av huden må du først bruke et skarpt blad for å kutte langs halehuden fra bunnen til halen. Deretter bruker du en pincet til å ta tak i den eksponerte halebenet og de andre pinnene for å ta tak i huden, og forsiktig skal halen fra benet med en kontinuerlig bevegelse. Klipp avskalet hud fra midtlinjen slik at hvert stykke er mindre enn 2-3 cm langt.
- Skyll den avskallede hudenH 15 ml sterilt PBS i en 10 cm petriskål og legg deretter huden fra hver hale inn i et 2 ml rør fylt med iskall dispenseringsfordøyelsesbuffer (4 mg / ml dispas i KC vekstmedium).
MERK: Flere hudstykker kan også kombineres og inkuberes i ett 15 ml rør (opptil 5 haler per rør) som inneholder 12 ml dispasløsning.- Inkubér hudrøret over natten i et 4 ° C kjøleskap på en rotator.
- Utfør trinnene 1.4 til 1.13 for å isolere enkeltcellesuspensjonen fra hale-epidermis.
- Seed de voksne celler ved en tetthet på 10 x 10 4 / cm2 (telt ved hjelp av en hematocytometer) i KC medium for vekst i kulturskåler på forhånd belagt med kollagen.
MERK: Vi bruker et kommersielt tilgjengelig kollagenbasert beleggssett (se Materialebordet for detaljer). Celler ble dyrket i fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C, og friskt medium ble etterfylles annenhver dag. Generelt er cUlture retter skal være belagt med kollagen i 30 minutter til 1 time før cellesedningen. Vi observerer at det er en betydelig forbedring av voksen KC-vedlegg til parabolen når de er belagt med kollagen sammenlignet med vedleggsfaktoren, som er et gelatinebasert beleggmateriale. - Bytt mediet 24 timer etter den første plating for å fjerne ukoblede celler, og bytt mediet daglig før cellene når ønsket konfluens før eksperimentet.
3. In Vitro Differensiering av KCs med høyt kalsium
- For å indusere terminal differensiering, tilsett CaCl 2 til 0,2 mM i kulturmediet.
- Alternativt sulter de dyrkede KCs over natten uten tilsatt veksttilskudd i lavt Kalsium KC basalt medium før tilsetning av høyt kalsium.
MERK: Vekstfaktorsulting vil øke celleforpliktelsen til tidlig differensiering og induksjon av tidlige differensieringsmarkører, for eksempel K10 5
4. UVB-bestrålingsmediert celledød og TNFa-frigjøring fra KCs
- Culture musen KCs i KC vekstmedium (i fuktig inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C) med daglig medium endring før cellene når konfluens. Umiddelbart før UVB-bestrålingen, fjern vekstmediet og erstatt med 500 μl PBS. Deretter utsetter cellene for 25 mJ / cm 2 UVB eller mock kontroll (ingen UVB).
MERK: UVB-bestråling utføres ved bruk av håndholdt UVB-lamper med to 8 W pærer (312 nm) som tidligere beskrevet 10 . Etter UVB-bestråling suges PBS og frisk medium tilsettes. - Mål og kvantifiser cellens levedyktighet ved CCK-8-celledyrbarhetsanalysen ved 6, 8 og 24 timer etter UVB-behandling etter produsentens instruksjon 11 .
- Samle det betingede mediet fra KCs behandlet med UVB ved ønskede tidspunkter og måle TNFa frigjortI det kondisjonerte mediet av Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA kit etter produsentens instruksjon 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalsium indusert terminal differensiering av neonatal og voksen KCs. Den primære mus epidermale KCs belagt og holdt ved 0,06 mM CaCl2 vokste som et monolag, og individuelle celler hadde en polygonal form med forskjellig mellomrom mellom, som viser en brostein utseende når sammenflytende (figur 1A og figur 2A). Heve CaCl 2 til 0,2 mM induserte en hurtig morfologi endring av cellene. Innen 8 timer etter den høye kalsiumbryteren ble cellene flatet og det distinkte intercellulære rommet ble mindre tydelig, og ved 24 timer ble cellelagens adhesjon med stramme kryssinger åpenbare ( figur 1A og figur 2B ). Dannelsen av cornified cell-konvolutt og vertikal cellestratifisering startet rundt 48-72 timer etter den høye kalsiumbryteren ( figur 2B). For å analysere den aktin ombygging og celle-celle-tight junction dannelse under høyt kalsium-bryteren, KCs behandlet med 0,2 mM CaCl2 ble farget med phalloidin (figur 1B) for å måle den aktin-remodellering under KC differensiering 13. Dannelsen av de aktin-fiberrike filopodiale fremspringene mellom de tilstøtende celler ble detektert så tidlig som 3 timer etter kalsiumbryteren, og aktinfiberreformeringen videreutviklet mellom 6-24 timer og ved 48 timer ble cellestratifiseringen fremtredende ( figur 1B ).
Følsomhet av mus-KC'er til UVB-utløst celledød og TNFa-frigivelse . De dyrkede voksne mus KCs ble eksponert for 25 mJ / cm 2 UVB-stråling og cellelevedyktigheten og TNFa frigis i kulturmediet ble analysert. Som vist av fasekontrastbilder ( figRe 3A), så vel som cellelevbarhetsanalysen ( Figur 3B ) utløste UVB en tidsavhengig død av KCs. Ved 24 timer ble flertallet av cellene avrundet og løsnet fra parabolen ( figur 3A ). Som kvantifisert ved cellelevabilitetsanalysen, var 90% av cellene døde innen 24 timer etter UVB-behandling ( Figur 3B ; p <0,001 som beregnet ved enveiskontroll ANOVA-multiplikasjonstest). Endelig viste vi at TNFa, et viktig cytokin som er indusert av UVB og driver KC-apoptose etter UVB-bestråling 14 , ble rikelig utskilt (~ 250 pg / ml innen 24 timer etter UVB-bestråling, p <0,001) i dyrkningsmediet av UVB-behandlede KCs på en tidsavhengig måte ( figur 3C ).
Figur 1: Primærkultur av neonatalmus-KCs, og høykalsiuminducerte terminale differensiering og stramt celle-junksdannelse. ( A ). Primære neonatale mus KCs ble behandlet med høyt kalsium (0,2 mM CaCl2), og fasekontrastbilder med 4X forstørrelse ble tatt ved 0 timer (ctrl) og ved 8 timer etter behandling. Skalbjelke = 100 μm. ( B ). Neonatale KCs ble differensiert i nærvær av 0,2 mM CaCl2, og cellene ble farget med phalloidin (rød) for å visualisere dannelsen av aktin fiberrike filopodial fremspring mellom de tilstøtende cellene under differensiering. Kjerner ble motstilt med DAPI, og aktinfibrer ble farget med rhodaminfalloidin. Skalbjelke = 25 μm. Bilder ble tatt ved 20X forstørrelse ved hjelp av et fluorescensmikroskop satt til DAPI-kanalen (for kjernefarging) og RFP-kanalen (for actin-farging). Lank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Primærkultur og høykalsiuminducert Terminal Differensiering av Voksne Mus KCs. ( A ). Fasekontrastbilder ved 10x forstørrelse av primære voksen mus KCs på 8 timer, 1 dag, 2 dager og 3 dager etter den første plating. Øvre panel representerer celler dyrket i dGS, og det nedre panel representerer celler dyrket i 10% chelexed FBS (cFBS) med 8 ng / mL rekombinant mus EGF. Skalbjelke = 100 μm. ( B ). Sammenflytende voksne mus KCs ble differensiert i nærvær av 0,2 mM CaCl2, og fasekontrastbilder ved 10X forstørrelse ble tatt ved 0 (ctrl), 8, 24, 48, og 72 timer etter høy kalsium bryteren. Skalbjelke = 100 μm.Nk "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Primærkultur av voksne mus-KC'er, og følsomhet for voksne KC'er til UVB-indusert celledød og frigjøring av TNFa. Primære voksen mus KCs ble dyrket til konfluens, deretter eksponert for 25 mJ / cm 2 UVB bestråling. ( A ) Fasekontrastbilder ved 10X forstørrelse tatt ved 12 og 24 timer etter UVB-eksponering viste en tidsavhengig UVB-indusert celledød. Skalbjelke = 100 μm. ( B ) Celle-levedyktigheten ble kvantifisert ved CCK-8-celledyrbarhetsanalysen ved 6, 8 og 24 timer etter UVB-behandling. ( C ) UVB-indusert frigjøring av TNFa til mediet ved angitte tidspunkter ble målt ved ELISA. Alle feilstavene angir gjennomsnittlig ± SEM. P-verdiene ble beregnet ved enveis ANOVA-multiple sammenligningTest (***, p <0.001) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hudens epidermis fungerer som en kritisk barriere for å skille og beskytte kroppen mot utemiljøet og skade fra vanntap, patogener, varme og UV-bestråling. KC er den dominerende cellelinjen til epidermis, og primærkultur av epidermale KC er et nyttig verktøy for å studere og forstå de biologiske prosessene for barriereformasjon og KCs respons på miljøbelastninger in vitro .
Her beskriver vi metoder for å isolere og dyrke primære epidermale KCer fra neonatal og voksen museskinn. Selv om primære mus-KCer enkelt kan isoleres fra nyfødt museskinn, anses isoleringen og vellykket kultur av voksne KCs vanskelig på grunn av tynningen av epidermis og den høye hårfollikkeldensiteten til den voksne musens dorsale hud. Metoden beskrevet her bruker voksen mus hale hud som en praktisk og rikelig kilde til basale KCs. På grunn av tilstedeværelsen av en tykk epidermis og lav Hårfollikkeltetthet i halehuden, blir det kritiske trinnet for å isolere KCs ved å separere epidermis fra dermis mulig etter overlegen dispensering av halehuden. I motsetning til dette var vårt forsøk på å isolere KCs fra voksen dorsal hud ved hjelp av denne protokollen ikke vellykket, noe som resulterte i lav celleutbytte etter isolasjon og lav cellefeste etter plating. Imidlertid er vellykket isolasjon og kultur av KCs fra voksen dorsal hud blitt rapportert etter over natten trypsin fordøyelse av den pelsfrie huden 15 , hvilket tyder på at dispase alene ikke kan være tilstrekkelig til å trekke ut follikulære KCs fra dermis av den voksne dorsale huden.
I denne protokollen ble de primære KCs dyrket i lavt kalsiummedium tilsatt dGS i stedet for kalsiumutarmet chelexed-FBS, som ble mye brukt i flere tidligere publiserte mus KC-kulturprotokoller 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. I denne studien observert vi at dGS er overlegen for chelexed FBS for å dyrke voksne mus-KC'er og for å opprettholde KCs basalcellemorfologi ( Figur 2A ). Det er imidlertid sannsynlig at effektiviteten av chelexed-FBS For å opprettholde KCs basalmorfologi kan avhenge av FBS-mye brukt i hver studie.
Ved å bruke metodene som presenteres her, viste vi at både de epidermal KCs med neonatal og voksen mus responderte på høy kalsium utløst terminal differensiering, stramt celleforbindelsesformasjon og lagdeling ( Figur 1 Og figur 2 ). Generelt øker det ekstracellulære kalsiumnivået til større enn 0,1 mM utløser terminal differensiering av basale KCs 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Det har blitt rapportert at et mellomliggende nivå av kalsium (0,1-0,16 mM) hovedsakelig induserte ekspresjonen av tidlige differensieringsmarkører, slik som K1 og K10, i løpet av de første 24 timer på kalsiumbryteren, mens K1 og K10 kun ble indusert i en liten Brøkdel av celler når de behandles med høyere kalsiummedium (1 mM) 19 , 20 . Imidlertid er det høyere kalsiummedium (≥1 mM) blitt mye brukt i mange andre studier for raskt og robust å indusere KC-stratifisering og ekspresjonen av sen differensieringsgener, som INV og LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Basert på vår erfaring, et mellomliggende nivå av kalsium, slik som 0,2 mM CaCl2, fører til en gradvis og langsommere start av terminal differensiering, mens en høyere nivåer av kalsium (≥1 mM) drastisk øke hastigheten på utbruddet av KC teRminal differensiering, som fører til et kortere tidsvindu for å studere de cellulære endringene under differensiering. Derfor brukte vi 0,2 mM CaCl2 for å indusere KC terminal differensiering, og vi har vist at dette mellomproduktet kalsiumnivå førte til en gradvis endring av basalcelle morfologi til en lagdelt corneocyte morfologi i løpet av 72 timer etter at kalsium-bryteren (figur 2B).
Vår gruppe har tidligere vist at epidermale KCs også spiller en viktig rolle for å initiere betennelsesreaksjoner på patogener eller DAMP som frigjøres under skade og / eller UVB-bestråling 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . I samsvar med disse in vivo observasjonene viste vi at kulturer med voksne mus-KCs var svært utsatt for UVB-utløst celledød, og UVB-behandlede KCs frigjort en storMengde TNFa, som er et nøkkel inflammatorisk cytokin som aktiverer immunsystemet.
Sammendrag, gir den primære musepidermisk KC-cellekultur en nyttig in vitro- modell for å studere epidermalbarriereformasjonen og medfødt immunrespons av KCs, og metodene beskrevet her vil være av interesse for forskere som forfyller studier i kutan biologi i nyfødtmusen som Så vel som i den voksne musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NATIONAL INSTITUT OF ARTHRITIS AND MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 til Zhang LJ), og National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 til CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
