Summary
Эпидермальные кератиноциты образуют функциональный кожный барьер и расположены на передней линии защиты хозяина от внешних экологических оскорблений. Здесь мы описываем методы выделения и первичной культуры эпидермальных кератиноцитов из кожи новорожденных и взрослых мышей, а также индукцию терминальной дифференцировки и вызванного УВБ воспалительного ответа от кератиноцитов.
Abstract
Кератиноцит (KC) является преобладающим типом клеток в эпидермисе, внешнем слое кожи. Эпидермальные КС играют решающую роль в обеспечении защиты кожи путем формирования неповрежденного кожного барьера против экологических оскорблений, таких как облучение UVB или патогенов, а также путем инициирования воспалительного ответа на эти оскорбления. Здесь мы описываем методы выделения КС из неонатальной кожи мыши и кожи взрослого мышиного хвоста. Мы также описываем условия культивирования с использованием определенных добавок роста (dGS) по сравнению с челюстной фетальной бычьей сывороткой (cFBS). Функционально мы показываем, что как новорожденные, так и взрослые KC очень чувствительны к терминальной дифференцировке с высоким кальцием, плотному образованию соединения и расслоению. Кроме того, культивируемые взрослые КС чувствительны к гибели клеток, вызванной UVB, и могут выделять большие количества TNF при облучении UVB. Вместе описанные здесь методы будут полезны исследователям для установки модели in vitroС для изучения эпидермальной биологии у неонатальной мыши и / или взрослого мыши.
Introduction
Кожа - самый большой орган в организме с эпидермисом как внешний слой. Эпидермис играет важную роль в формировании неповрежденного эпидермального барьера для отделения организма от окружающей среды и, таким образом, предотвращает потерю воды и обеспечивает защиту от экологических оскорблений, таких как аллергены, патогены и воздействие UVB. Эпидермис развивается из одного слоя недифференцированных базальных кератиноцитов (КС) в многослойный стратифицированный эпителий, состоящий из базального слоя с последующим остистым слоем, гранулированным слоем и роговым слоем. Базальные КС, состоящие как из эпидермальных стволовых клеток, так и транзиторно-амплифицирующих клеток, являются пролиферативными и недифференцированными. Поскольку базальные КЦ выходят из клеточного цикла, клетки совершают дифференцировку и постепенно мигрируют к поверхности эпидермиса, сопровождаясь созреванием переходов клеток-клеток и образованием барьера эпидермальной проницаемости (EPB). KCs на остистом слое экспрессируют ранние дифференцированныеИонные маркеры, такие как кератин 10 (K10); Когда КЦ мигрируют в гранулированный слой, клетки выражают маркеры поздней дифференцировки, такие как Филагрин (ФЛГ), Лорикрин (ЛОР) и Involucrin (INV). На роговом слое КС становятся терминально дифференцированными корнеоцитами, которые в конечном итоге исчезают через десквамацию, когда новые клетки заменяют их.
Кальций считается наиболее физиологическим агентом в эпидермисе и вызывает дифференцировку in vitro и in vivo аналогичным образом. В нормальном эпидермисе кожи ионы кальция образуют характерный «градиент концентрации», увеличиваясь в концентрации до поверхности кожи 1 , 2 , 3 . Концентрация кальция повышается с низких уровней в нижних подслоях (базальные и остистые слои) до пика в верхнем зернистом слое, а затем падает до незначительных уровней в самом поверхностном слое (роговой слой). Градиент кальция также развивается по совпадению с возникновением барьера компонентной проницаемости, который подтверждает, что сигнализация кальция играет критически важную роль дифференциации КЦ. In vitro низкий уровень кальция (0,02-0,1 мМ) поддерживает пролиферацию базальных КС в виде монослоя, тогда как высокий кальций (> 0,1 мМ) индуцирует быстрое и необратимое обязательство клеток к терминальной дифференцировке, что подтверждается образованием плотных соединений и индукцией LOR и INV при высокой обработке кальцием к базальным KC 4 , 5 .
Помимо образования барьеров, эпидермальные КС также являются важным компонентом врожденной иммунной системы кожи. В ответ на патогены или связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP), высвобождаемые при облучении или повреждении UVB, KC могут продуцировать большое количество воспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL6 и IFNβ, что приводит к активации иммунной системы> 6 , 7 , 8 , 9 . Несмотря на то, собственно воспалительные сигнализации от KCS требуется для оформления патогена, неконтролируемая воспалительная реакция может вызвать развитие авто-воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз и розацеа 6, 8.
В целом, КЦ играют жизненно важную роль в поддержании неповрежденного кожного барьера и инициировании иммунного ответа на инвазию патогенов или экологических оскорблений. Поэтому первичная культура эпидермальных КЦ является полезной методикой для изучения эпителиальной биологии, дифференцировки КЦ, а также стимулированных КК врожденных иммунных реакций. Изоляция и культура первичных эпидермальных КЦ мышей могут быть сложным процессом из-за восприимчивости KC и чувствительности к различным внешним стимуляторам. Здесь мы описываем метод выделения и культивирования КС из кожи неонатальной мыши илиВзрослая кожа хвоста мыши. Для изоляции взрослых KC мы не используем дорсальную кожу мышей, так как выделение достаточного количества жизнеспособных КС из этой ткани может быть затруднено по следующим причинам: во-первых, взрослая спинная кожа на фазе покоя цикла волос (telogen) состоит из Тонкий эпидермис с только 1-2 слоями клеток, что приводит к низкому выходу клеток и неэффективному отделению эпидермиса от дермы, что является критическим шагом для успешной изоляции KC. Во-вторых, высокая плотность фолликулов волоса, которая присутствует на дорсальной коже взрослого, также способствует затруднению отделения эпидермиса от дермы. Вместо этого мы обычно используем кожу хвоста как источник для взрослых мышей KC, так как этот эпителий толще с 3-5 слоями эпидермальных КС. Он также имеет меньшую плотность фолликула волоса, который не мешает эпидермальному разделению, тем самым позволяя изолировать KC от любой взрослого мышечного хвоста кожи независимо от стадии развития век и волос мыши. Изолированная неонаТаль KC высевают в чашки с культивированным желатином, тогда как чашки с коллагеновым покрытием используются для высевания изолированных взрослых KC из-за нарушения способности взрослых клеток к адгезии по сравнению с их неонатальными аналогами. В культуральную мышь KC низкую кальциевую среду дополняют dGS, которая содержит эпидермальный фактор роста (EGF), бычий трансферрин, инсулиноподобный фактор ростаc1 (IGF1), простагландин E2 (PGE2), бычий сывороточный альбумин (BSA) и гидрокортизон. Через 2-4 дня после первоначального осаждения большинство дифференцированных KC можно смыть при ежедневных изменениях среды, а оставшиеся адгезивные клетки показывают типичную морфологию 4 булыжника, размножаются и не экспрессируют ранний дифференцировочный маркер K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных одобрены Комитетом по удержанию и использованию животных UCSD.
1. Выделение и культура основной мышей KC из неонатальной кожи
- Жертвоприношение послеродового дня 0-2 новорожденных от штамма мыши C57B / 6 дикого типа путем обезглавливания с использованием ножниц. Отрежьте конечности чуть выше запястья и суставов голеностопного сустава, затем полностью отрежьте хвост, оставив небольшое отверстие.
- Чтобы очистить всю кожу, сначала вставьте острые ножницы через отверстие в хвост и разрежьте кожу вдоль спинной средней линии тела до отверстия на шее. Затем используйте один щипчик, чтобы схватить открытое тело и другие щипцы, чтобы схватить кожу, и аккуратно очистить всю кожу от тела и над ногами пнями одним непрерывным движением.
- Очистите кожу как одну неповрежденную кусочку и будьте осторожны, чтобы не сломать кожу на кусочки, так как это приведет к потере клеток во время этапа дозирования.
<Li> Промойте очищенную кожу 15 мл стерильного PBS в чашке Петри 10 см, затем поместите кожу от каждого щенка в 2-млную пробирку, заполненную буфером для вываривания ледяного холода, который содержит дозирование 4 мг / мл в среде для роста KC (Базальная среда KC имеет 0,06 мМ CaCl 2 , dGS и антибиотики / противогрибковые средства). - Удостоверьтесь, что кожа не сгибается в трубке, так как это приведет к недостаточному воздействию сложенной области на раствор для дозирования.
- На следующий день (после 12-18 часов в раздаче) переместите кожу вместе с раствором для дозирования в чашку Петри. Перенесите каждую кусочек ткани в новую чашку Петри с 15 мл стерильной PBS, чтобы смыть излишки.
- Используя две пары щипцов, возьмите кожу из PBS,Поднять кожу и перенести на новую чашку Петри с эпидермальной стороной вниз и стороной дермы вверх. Осторожно растяните складки кожи так, чтобы она полностью растянулась на чашке Петри.
- Поместите 500 мкл раствора для расщепления на трипсине для каждой кожи в новой чашке Петри. Используя щипцы, медленно поднимайте дерму вверх и от эпидермиса, удерживая эпидермис. Утилизируйте дерму как биологически опасный материал. Перенесите отделенный эпидермис и поплавок на каждую каплю раствора трипсина с базальным слоем вниз.
- Если эпидермис складывается на раствор трипсина, удалите все складки с помощью щипцов, чтобы обеспечить эффективное переваривание базальных КС из эпителия.
- Инкубируйте кожу на чашке Петри в растворе трипсина при комнатной температуре (с закрытой крышкой) на горизонтальном шейкере с мягким перемешиванием в течение 20 мин.
- Добавьте 2 мл добавленной KC-среды для роста на один эпидермис (около 1 кв. ДюймЭпидермис) к чашке Петри. Возьмитесь за эпидермис с помощью щипцов и энергично втирайте эпидермис назад и вперед, чтобы освободить отдельные клетки из эпидермального листа.
- Следите за тем, чтобы средний оборот становился все более мутным, когда клетки были отделены от эпидермиса. Наклоните чашку Петри, чтобы собрать и перенести клеточную суспензию на новую трубку, оставляя оставшийся лист эпидермиса на блюде.
- Повторите еще два раза потирание эпидермального листа после добавления 2 мл среды для роста KC и объедините суспензии клеток в той же самой трубе.
- Регулярно пипетируйте раствор ячейки несколько раз, чтобы сломать любые клеточные глыбы, используя соответствующую серологическую пипетку, затем пропустите ее через фильтр 100 мкм к новой 50-миллиметровой центрифужной пробирке.
- Центрифугируют отфильтрованные клетки в течение 5 мин при 180 × g.
- Аспирируйте супернатант и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл холодной среды для роста KC / эпидермиса.
- Подсчитайте клетки гемоцитометром.
- Выделите клетки с плотностью 5 × 10 4 / см 2 в среде роста KC в чашках для культуры, предварительно покрытых продуктом внеклеточного матрикса (ECM), который способствует прикреплению клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем коммерчески доступный (например, коэффициент прикрепления, который представляет собой материал для покрытия на основе желатина (подробности см. В таблице материалов). Клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% СО 2 при 37 ° С, а свежую среду Пополняется через день.- Для покрытия нанесите культуральные чашки клеящим материалом для покрытия клеток, нагретым до комнатной температуры в течение 10 мин до 2 ч перед посевом клеток. Удалите коэффициент вложения непосредственно передДобавляя клеточную суспензию.
- Измените среду через 24 часа после первоначального нанесения покрытия, чтобы удалить неприкрепленные клетки, и ежедневно меняйте среду, пока клетки не достигнут желаемого слияния до эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ. Несколько изолятов кожи можно комбинировать и инкубировать в одной пробирке объемом 15 мл (до 5 шкур на пробирку), содержащей 12 мл раствора для дозирования. Инкубируйте кожуру в течение ночи в холодильнике 4 ° C на ротаторе.
2. Первичная мышь. Изоляция KC из кожи для взрослых.
- Пожертвуйте взрослую мышь C57BL / 6 (предпочтительно в возрасте от 6 до 15 недель, либо мужскую, либо женскую) в соответствии с правилами животного объекта. Отрежьте хвост от тела от хвостового основания и отрежьте ~ 2 мм хвостового наконечника так, чтобы на кончике было видимое отверстие.
- Чтобы очистить кожу хвоста, сначала используйте острое лезвие, чтобы срезать хвостовую оболочку от основания до хвостового наконечника. Затем используйте один щипчик, чтобы схватить открытую хвостовую кость и другие щипцы, чтобы схватить кожу, и осторожно очистить кожу хвоста от кости одним непрерывным движением. Отрежьте очищенную кожу от средней линии так, чтобы каждая часть была меньше 2-3 см в длину.
- Промойте очищенный кожуH 15 мл стерильного PBS в чашке Петри 10 см, затем поместите кожу из каждого хвоста в 2-млную пробирку, заполненную буфером для отваривания ледяным холодом (дозирование 4 мг / мл в среде для роста KC).
ПРИМЕЧАНИЕ. Несколько кусочков кожи также можно комбинировать и инкубировать в одной пробирке объемом 15 мл (до 5 хвостов на пробирку), содержащей 12 мл раствора для дозирования.- Инкубируйте кожуру в течение ночи в холодильнике 4 ° C на ротаторе.
- Выполните шаги с 1.4 по 1.13, чтобы изолировать суспензию одной клетки от эпидермиса хвоста.
- Выделите взрослые клетки с плотностью 10 × 10 4 / см 2 (подсчитанные гематоцитометром) в среде роста KC в чашках культуры, предварительно покрытых коллагеном.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем коммерчески доступный набор для покрытия на основе коллагена (подробнее см. Таблицу материалов ). Клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% СО 2 при 37 ° С, и свежую среду пополняли через день. В общем случае cНаверху следует наносить коллаген на 30 минут до 1 часа перед посевом клеток. Мы наблюдаем, что существует значительное усиление прикрепления взрослых KC к тарелке при покрытии коллагеном по сравнению с коэффициентом прикрепления, который является материалом покрытия на основе желатина. - Измените среду через 24 часа после первоначального нанесения покрытия, чтобы удалить неприкрепленные клетки, и ежедневно меняйте среду, пока клетки не достигнут желаемого слияния до эксперимента.
3. Дифференцирование VC in vitro высоким содержанием кальция
- Чтобы вызвать терминальную дифференцировку, добавьте CaCl 2 до 0,2 мМ в культуральную среду.
- В качестве альтернативы, голодайте культивированные КС в течение ночи без добавления добавок роста в базальной среде с низким содержанием кальция до добавления высокого кальция.
ПРИМЕЧАНИЕ. Голодание фактора роста повышает приверженность клеток ранней дифференцировке и индукцию ранних маркеров дифференцировки, таких как K10 5
4. Облучение UVB-опосредованной клеточной смертью и высвобождение TNFα из KC
- Культуру мышь KC в среде роста KC (в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° C) с ежедневным изменением среды до тех пор, пока клетки не достигнут слияния. Непосредственно перед облучением UVB удалите среду для роста и замените 500 мкл PBS. Затем подвергайте клетки воздействию 25 мДж / см 2 UVB или макету контроля (без UVB).
ПРИМЕЧАНИЕ. Облучение UVB осуществляется с использованием карманных ламп UVB с двумя лампами мощностью 8 Вт (312 нм), как описано выше 10 . После облучения UVB PBS отсасывается и добавляется свежая среда. - Измерьте и количественно оценивайте жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности клеток CCK-8 через 6, 8 и 24 часа после УФ-луча по инструкции изготовителя 11 .
- Собирают кондиционированную среду из КЦ, обработанных UVB, в нужные моменты времени и измеряют высвобождаемую TNFαВ кондиционированной среде с помощью набора ELISA Mouse TNF (Mono / Mono) согласно инструкциям производителя 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высокое содержание кальция в терминальной дифференцировке новорожденных и взрослых КС. Первичные мышиные эпидермальные КЦ, покрытые и поддерживаемые при 0,06 мМ CaCl 2, росли как монослой, а отдельные клетки имели многоугольную форму с четким межклеточным пространством, демонстрируя появление булыжника при слиянии ( рис. 1А и рис. 2А ). Повышение CaCl 2 до 0,2 мМ вызвало быстрое изменение морфологии клеток. В течение 8 ч после высокого кальциевого переключателя клетки стали сплющиваться, а явное межклеточное пространство стало менее заметным, и через 24 часа стало очевидной адгезия клеточных клеток с плотными соединениями ( рис. 1А и рис. 2В ). Образование оболочки карбинированной клетки и вертикальной клеточной стратификации началось около 48-72 ч после высокого кальциевого переключателя ( рис. 2В). Для анализа ректификации актина и строения плотного соединения клеток в течение высокого кальциевого переключателя КЦ, обработанные 0,2 мМ CaCl 2, окрашивали фаллоидином ( рис. 1В ) для измерения ремоделирования актина во время дифференцировки КЦ 13 . Формирование волоконно-богатых филоподиальными проекциями актиновых волокон между соседними клетками было обнаружено уже через 3 часа после кальциевого переключателя, а ремоделирование актинового волокна продолжалось в течение 6-24 ч, а через 48 ч стала заметной стратификация клеток ( рисунок 1В ).
Восприимчивость мышиных KC к гибели клеток, вызванной UVB, и высвобождению TNFα . Культурные взрослые мышиные KC подвергали облучению UVB 25 мДж / см 2 и анализировали жизнеспособность клеток и TNFα, высвобождаемые в культуральной среде. Как показано изображениями фазового контраста ( FiguRe 3A), а также анализ жизнеспособности клеток ( фиг. 3B ), UVB инициировал зависящую от времени смерть KC. Через 24 ч большую часть клеток округлили и отделили от тарелки ( рис. 3А ). Как подсчитано количественным анализом жизнеспособности клеток, ~ 90% клеток были мертвы в течение 24 часов после обработки УФБ ( Рисунок 3B ; p <0,001, рассчитанный односторонним сравнительным тестом ANOVA). Наконец, мы показали, что TNFα, важный цитокин, который индуцируется UVB и приводит к апоптозу KC после облучения UVB 14 , был в значительной степени секретирован (~ 250 мкг / мл в течение 24 часов после УФ-облучения, p <0,001) в культуральной среде УФ-обработанные КС в зависимости от времени ( рис. 3С ).
фигура 1: первичная культура неонатальных мышей KC, а также высокая дифференцировка дифференцированного кальция и строгая клеточная клеточная структура. ( А ). Первичные неонатальные мышиные КС были обработаны высоким кальцием (0,2 мМ CaCl 2 ), а фазовые контрастные изображения при 4-кратном увеличении были взяты через 0 ч (ctrl) и через 8 ч после лечения. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ). Неонатальные КЦ были дифференцированы в присутствии 0,2 мМ CaCl 2 , и клетки окрашивали фаллоидином (красным), чтобы визуализировать образование богатых актином волоконных филоподиальных проекций между соседними клетками во время дифференцировки. Ядра были контрастированы с DAPI, а актиновые волокна окрашивались родамин-фаллоидином. Шкала шкалы = 25 мкм. Изображения были сделаны при 20-кратном увеличении с использованием флуоресцентного микроскопа, установленного на канал DAPI (для окрашивания ядер) и RFP-канала (для окрашивания актином). Lank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Первичная культура и индуцированная кальцием дифференцировка дифференцировки взрослых KC взрослых мышц. ( А ). Фазовые контрастные изображения при 10-кратном увеличении первичных взрослых мышей KC через 8 ч, 1 день, 2 дня и 3 дня после первоначального нанесения покрытия. Верхняя панель представляет собой клетки, выращенные в dGS, а нижняя панель представляет собой клетки, выращенные в 10% -ном chelexed FBS (cFBS) с 8 нг / мл рекомбинантного мышиного EGF. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ). Конфулированные взрослые мышиные KC были дифференцированы в присутствии 0,2 мМ CaCl 2 , а изображения фазового контраста при 10-кратном увеличении были взяты при 0 (ctrl), 8, 24, 48 и 72 ч после высокого кальциевого переключателя. Шкала шкалы = 100 мкм.Nk "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Первичная культура KC взрослых мышц и восприимчивость взрослых KC к УФ-индуцированной гибели клеток и высвобождению TNFα. Первичные взрослые мышиные KC культивировали до слияния, затем подвергали облучению UVB 25 мДж / см 2 . ( A ) Фазовые контрастные изображения при 10-кратном увеличении, проведенные через 12 и 24 часа после воздействия UVB, показали зависящую от времени UVB-индуцированную гибель клеток. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Жизнеспособность клеток определяли количественно с помощью анализа жизнеспособности клеток CCK-8 через 6, 8 и 24 часа после УФ-лучевой терапии. ( C ) УФ-индуцированное высвобождение TNFα в среду в указанные моменты времени измеряли с помощью ELISA. Все полосы ошибок показывают среднее значение ± SEM. P-значения вычисляли путем однократного сравнения ANOVATest (***, p <0.001) Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эпидермис кожи функционирует как критический барьер для отделения и защиты организма от внешней среды и повреждения от потери воды, патогенов, тепла и ультрафиолетового излучения. КЦ являются преобладающей клеточной линией эпидермиса, а первичная культура эпидермальных КС является полезным инструментом для изучения и понимания биологических процессов формирования барьеров и ответа КЦ на экологические оскорбления in vitro .
Здесь мы описываем методы выделения и культивирования первичных эпидермальных КС из кожи новорожденных и взрослых. В то время как первичные мышиные KC можно удобно изолировать от кожи новорожденных мышей, изоляция и успешная культура взрослых KC считаются трудными из-за истончения эпидермиса и высокой плотности фолликулов волоса дорсальной кожи у взрослых мышей. Описанный здесь метод использует кожу взрослого мышиного мышей как удобный и обильный источник базальных КЦ. Из-за наличия толстого эпидермиса и низкого Плотность волосяного фолликула в хвостовой оболочке, критическая стадия выделения KC путем отделения эпидермиса от дермы становится возможной после того, как в течение ночи прекратить переваривание кожи хвоста. Напротив, наша попытка изолировать КС у взрослых дорсальной кожи с использованием этого протокола не увенчалась успехом, что привело к снижению выхода клеток после выделения и прикреплению клеток к клетке после нанесения покрытия. Тем не менее, успешная изоляция и культура КЦ с дорсальной кожи взрослого человека сообщается после однократного переваривания трипсина без кожи без кожи 15 , что указывает на то, что одних одноклеточных может быть недостаточно для извлечения фолликулярных КС из дермы дорзальной кожи взрослого человека.
В этом протоколе первичные KC выращивали в среде с низким содержанием кальция, дополненной dGS, вместо обедненной кальцием chelexed-FBS, которая широко использовалась в нескольких ранее опубликованных методах культивирования мыши KC 4 , 15 , »> 16 , 17 , 18. В этом исследовании мы наблюдали, что dGS превосходит chelexed FBS для культивирования взрослых мышей KC и для поддержания карцевой базальной клетки KC ( рис. 2A ). Однако вполне вероятно, что эффективность chelexed-FBS Для поддержания базальной морфологии KC может зависеть от партии FBS, используемой в каждом исследовании.
Используя представленные здесь методы, мы продемонстрировали, что как неонатальные, так и взрослые мышиные эпидермальные КС реагировали на терминальную дифференцировку с высоким кальцием, плотное образование и стратификацию сочленения клеток ( рис. 1 И рис. 2 ). Как правило, повышение уровня внеклеточного кальция до более чем 0,1 мМ вызывает терминальную дифференцировку базальных КС 4 , 5 , 17 ,Ass = "xref"> 19. Сообщалось, что промежуточный уровень кальция (0,1-0,16 мМ) по существу индуцировал экспрессию ранних маркеров дифференцировки, таких как K1 и K10, в течение первых 24 ч на кальциевом переключателе, тогда как K1 и K10 индуцировали только в небольшом Фракции клеток при обработке более высокой кальциевой средой (1 мМ) 19 , 20 . Однако более высокая кальциевая среда (≥1 мМ) широко используется во многих других исследованиях для быстрого и надежного индуцирования стратификации KC и экспрессии генов поздней дифференцировки, таких как INV и LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Исходя из нашего опыта, средний уровень кальция, такой как 0,2 мМ CaCl 2 , приводит к постепенному и медленному началу терминальной дифференцировки, тогда как более высокие уровни кальция (≥1 мМ) резко ускоряют начало KC teДифференцирование rminal, приводящее к более короткому временному окну для изучения клеточных изменений во время дифференцировки. Поэтому мы использовали 0,2 мМ CaCl 2 для индуцирования терминальной дифференцировки KC, и мы показали, что этот промежуточный уровень кальция привел к постепенному изменению морфологии базальных клеток до стратифицированной морфологии корнеоцитов в течение 72 часов после переключения кальция ( рис. 2B ).
Наша группа ранее продемонстрировала, что эпидермальные КЦ также играют важную роль для инициирования воспалительных реакций на патогены или ДАМП, высвобождаемые во время травмы и / или УФ-облучения 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . В соответствии с данными наблюдений in vivo здесь мы показали, что культивируемые взрослые мышиные KC были очень восприимчивы к гибели клеток, вызванной UVB, и KC, обработанным UVB, выпустили большойКоличество TNFα, которое является ключевым воспалительным цитокином, который активирует иммунную систему.
Таким образом, первичная культура клеток эпидермального КК мыши обеспечивает полезную модель in vitro для изучения формирования эпидермального барьера и врожденного иммунного ответа КС, и описанные здесь методы будут представлять интерес для исследователей, проводящих исследования в области кожной биологии у новорожденной мыши, Как и у взрослых мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом НАЦИОНАЛЬНОГО ИНСТИТУТА АРТРИТА И МУСКУЛОСКЕЛЕЛЛА И КОЖИ (R01AR069653 Чжан ЛЖ) и Национальными институтами здравоохранения (5T32AR062496-03 - CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
