Summary
Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.
Abstract
Keratinosit (KC), cildin en dış tabakası olan epidermisdeki baskın hücre türüdür. Epidermal KCler, UVB ışınlaması veya patojenler gibi çevresel hasarlara karşı bozulmamış bir cilt bariyeri oluşturarak cilt savunmasını sağlamada ve ayrıca bu hakaretlere karşı iltihaplı bir tepki başlatarak kritik bir rol oynamaktadır. Burada, yenidoğan fare derisinden ve erişkin fare kuyruğu derisinden KC'leri izole etme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca, tanımlanmış büyüme takviyeleri (dGS) kullanarak, çoğaltılmış fetüs sığır serumu (cFBS) ile kültür koşullarını tarif ederiz. İşlevsel olarak, hem yenidoğan hem de erişkin KC'lerin yüksek kalsiyumun indüklediği terminal farklılaşması, sıkı birleşim oluşumu ve tabakalaşmaya son derece tepkisel olduğunu göstermektedir. Ek olarak, kültürlenmiş yetişkin KC'ler UVB ile tetiklenen hücre ölümüne duyarlıdır ve UVB ışınlaması üzerine büyük miktarda TNF salabilirler. Birlikte, burada açıklanan yöntemler araştırmacılar için in vitro model kurulumu için yararlı olacaktırYenidoğan fare ve / veya yetişkin fare epidermal biyoloji incelemek için.
Introduction
Cilt, vücudun en büyük organıdır ve dış tabaka olarak epidermisdir. Epidermis, vücudu çevreden ayırmak için sağlam bir epidermal bariyer oluşturmada kritik bir rol oynar ve böylece su kaybını önler ve alerjen, patojen ve UVB maruziyeti gibi çevresel hasarlardan korunma sağlar. Epidermis, farklılaşmamış bazal keratinositlerden (KCs) oluşan tek bir katmandan, bazal tabaka, bunu takiben bir östrus tabakası, granüler tabaka ve stratum corneum'dan oluşan çok tabakalı bir tabakalı epitele dönüşür. Hem epidermal kök hücrelerden hem de transit amplifikatör hücrelerden oluşan bazal KC'ler proliferatif ve farklılaşmamıştır. Bazal KC'ler hücre döngüsünden çıkarken hücreler farklılaşmaya çalışırlar ve hücre-hücre kavşaklarının olgunlaşması ve bir epidermal geçirgenlik bariyeri (EPB) oluşumu eşliğinde epidermisin yüzeyine doğru giderek yer değiştirirler. Eğik tabakadaki KC'ler, erken diferansiyasyonu ifade ederIyon belirteçleri, örneğin Keratin 10 (K10); KC'ler granül tabakaya göç ederken, hücreler Filaggrin (FLG), Lorikrin (LOR) ve Involucrin (INV) gibi geç farklılaşma belirteçlerini ekspres eder. Stratum corneum'da, KC'ler terminal olarak diferensiye edilmiş korneositler haline gelir ve bunlar, sonunda yeni hücreler yerine geçtikten sonra süsleme yoluyla dökülür.
Kalsiyum, epidermisin en fizyolojik ajanı olarak düşünülür ve benzer şekilde in vitro ve in vivo farklılaşmaları tetikler. Normal deri epidermisinde, kalsiyum iyonları karakteristik bir "konsantrasyon gradyanı" oluşturur ve konsantrasyonda deri yüzeyine doğru artar 1 , 2 , 3 . Kalsiyum konsantrasyonu, en alttaki tabakalardan (bazal ve spinöz katmanlar) düşük seviyelerden üst granüler katmandaki bir tepeye yükselir ve en yüzeysel katmanda (stratum corneum) ihmal edilebilir seviyelere düşer. Kalsiyum degradasyonu, aynı zamanda, kalsiyum sinyallemesinin KC diferansiyasyonunda kritik bir rol oynadığını destekleyen bir bileşen geçirgenlik bariyerinin ortaya çıkması ile çakışarak gelişir. İn vitro düşük kalsiyum (0.02-0.1 mM) bazal KC'lerin tek tabaka halinde çoğalmasını sağlarken, yüksek kalsiyum (> 0.1 mM), hücrelerin terminal birleşimine hızlı ve geri döndürülemez bir taahhütte bulunur, bu da sıkı birleşim oluşumu ve indüksiyon ile gösterilir LOR ve INV'nin bazal KC 4 , 5'e yüksek kalsiyum muamelesi üzerine uygulanması.
Bariyer oluşumuna ek olarak, epidermal KCler de cildin doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. UVB ışınlaması veya yaralanması üzerine salınan patojenlere veya hasar görmüş moleküler kalıplara (DAMP'ler) yanıt olarak, KCs TNFa, IL6 ve IFNβ gibi inflamatuar sitokinleri büyük miktarda üreterek immün sistem aktivasyonuna yol açabilir> 6 , 7 , 8 , 9 . KC'lerden uygun iltihap sinyali patojen temizlemesi için gerekli olmakla birlikte, kontrol edilemeyen inflamatuar yanıt, sedef hastalığı ve rosacea 6 , 8 gibi oto-inflamatuar cilt hastalıklarının gelişimini tetikleyebilir.
Genel olarak, KCler bozulmamış cilt bariyerini korumada ve patojen istilasına veya çevresel hakaretlere karşı bir bağışıklık tepkisi başlatmada hayati bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, epidermal KC'lerin birincil kültürü, epitel biyolojisini, KC farklılaşmasını ve ayrıca KC uyarılı doğal immün yanıtları incelemek için yararlı bir tekniktir. Primer fare epidermal KC'lerin izolasyonu ve kültürü, KC'nin çeşitli harici uyarıcılara duyarlılığı ve hassasiyeti nedeniyle zor bir süreç olabilir. Burada, yenidoğan fare derisinden KC'leri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem anlatılmaktadır.Yetişkin fare kuyruğu cildi. Yetişkin KC izolasyonu için, fare dorsal deri kullanmıyoruz, çünkü bu dokudan yeterli miktarda canlı KC'lerin izole edilmesi aşağıdaki nedenlerle zor olabilir: Birincisi, saç döngüsünün (telogen) dinlenme fazındaki yetişkin dorsal deri, Sadece 1-2 kat hücreli ince epidermis, düşük hücre verimi ve epidermisin dermisden ayrılmasına neden olur ki bu başarılı KC izolasyon için kritik adımdır. İkincisi, yetişkin dorsal deri üzerinde bulunan yüksek kıl follikülü yoğunluğu, epidermisin dermisden ayrılma zorluğuna daha fazla katkıda bulunur. Bunun yerine, yetişkin fare KC'leri için kuyruk derisini rutin olarak kullanırız, çünkü bu epitel 3-5 epidermal KC tabakasıyla daha kalıntır. Ayrıca epidermal ayrılmaya müdahale etmeyen daha düşük bir saç follikülü yoğunluğu vardır, böylece fare yaşına ve saç döngüsüne bakılmaksızın yetişkin fare kuyruk derisinden KC izolasyonuna izin verir. İzole edilmiş neonaTal KC'ler, jelatin kaplı kültür bulaşıkları üzerine ekilirken kolajen kaplı bulaşıklar yetişkin hücrelerin yenidoğan muadillerine kıyasla zayıf kalma yeteneklerinden dolayı izole yetişkin KC'leri tohumlamak için kullanılır. Kültür fare KC'lerine düşük kalsiyum bazal ortam, epidermal büyüme faktörü (EGF), sığır transferini, insülin benzeri büyüme faktörü (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), sığır serum albümini (BSA) ve hidrokortizon içeren dGS ile takviye edilmiştir. İlk kaplamadan 2-4 gün sonra, farklılaşmış KC'lerin çoğu, günlük orta değişimler sırasında yıkanabilir ve kalan yapışık hücreler, tipik Arnavut kaldırımı morfolojisi 4 gösterir , çoğalmakta ve erken farklılaşma markörü K10'u ifade etmemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, UCSD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yenidoğan Cildinde Primer Fare KC İzolasyonu ve Kültürü
- C57B / 6 vahşi tipli fare suşundan post-doğum günündeki 0-2 yenidoğan makas kullanarak kesilerek kurban edin. Bilek ve ayak bileği eklemlerinin hemen üzerindeki kolları kesin, daha sonra kuyruk tamamen kesip küçük bir delik bırakın.
- Tüm cildin soyulması için önce kuyruktaki delikten keskin bir makas takın ve cildinizi vücudun dorsal orta çizgisi boyunca boyundaki açıklığa kadar kesin. Daha sonra, cildi tutunacak şekilde maruz kalan cesedi ve diğer forsepsleri kavrayabilmek için bir forseps kullanın ve vücudun tüm cildi hafifçe soyun ve bir sürekli hareketle bacak kütükleri üzerinden soyun.
- Ciltten dokunulmamış bir parça olarak soyun ve cildi parçalara ayırmamaya özen gösterin, çünkü cilt soyulurken hücre kaybına neden olur.
<Li> 10 cm'lik bir Petri kabında 15 mL'lik steril PBS ile soyulmuş cildi durulayın, daha sonra her bir yavrunun cildini, KC büyüme ortamında 4 mg / mL disperse içeren buz gibi soğuk sindirim tamponu ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin (KC bazal ortamı 0,06 mM CaCl2, DGS ve antibiyotikler / Antimikotiklerin vardır). - Katlanan bölgenin dispase solüsyonuna yeteri kadar maruz kalmayla sonuçlanacağı için tüpün içinde cildin katlanmadığından emin olun.
- Ertesi gün (disperse 12-18 saat sonra), cilt dispase solüsyonu ile bir Petri kabına aktarılır. Fazla disperi uzaklaştırmak için her doku parçasını 15 mL steril PBS ile yeni bir Petri kabına aktarın.
- İki çift forseps kullanarak deriyi PBS'den tutun,Cildi kaldırın ve yeni bir Petri kabına, epidermal tarafı aşağı ve dermis tarafı yukarı gelecek şekilde aktarın. Deri katlanmalarını dikkatli bir şekilde gerin böylece Petri kabında tamamen uzatın.
- Yeni bir Petri kabındaki her cilt için tripsin bazlı sindirim solüsyonundan 500 μL yerleştirin. Cımbızı kullanarak epidermisi tutarken yavaşça dermikleri yukarı kaldırın ve epidermiden uzaklaştırın. Dermizi biyolojik tehlikeli madde olarak atın. Ayrılan epidermisi aktarın ve her damla tripsin solüsyonunda bazal tabaka aşağıya doğru yüzdürün.
- Epidermis, tripsin solüsyonu üzerine katlanırsa, bazal KC'lerin epitelden etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için forseps kullanarak herhangi bir kat yeri çıkarın.
- Cildini 20 dakika hafifçe çalkalayarak yatay bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında (kapak kapalıyken) tripsin solüsyonundaki bir Petri kabında inkübe edin.
- Epidermis başına 2 mL eklenmiş KC büyüme ortamı ekleyin (başına yaklaşık 1 inç kare boyutuEpidermis) ekleyelim. Forseps kullanarak epidermis kavrayın ve epidermal sayfadan tek hücrelerin serbest bırakmak için şiddetle epidermis ileri ve geri sürtün.
- Hücreler epidermisden ayrıldıkça orta dönüşün giderek bulanık olduğunu izleyin. Kalan epidermal tabakayı çanakta bırakarak yeni bir tüpe hücre süspansiyonu toplamak ve aktarmak için Petri kabını eğin.
- 2 mL KC büyüme ortamı ilave edildikten sonra epidermal tabakanın sürtünmesini iki kat daha tekrarlayın ve hücre süspansiyonlarını aynı tüpe birleştirin.
- Uygun serum serumu pipetini kullanarak herhangi bir hücre yığını kırmak için hücre solüsyonunu birkaç kez hafifçe birkaç kez pipetleyin, sonra yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne 100 μm'lik bir filtreden geçirin.
- Filtrelenmiş hücreleri 5 dakika 180 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire edin ve yavaşça 1 mL soğuk KC büyüme ortamı / epidermis hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin.
- Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
- Kültür tabaklarında KC büyüme ortamı içinde, 5 x 10 4 / cm2 'lik bir yoğunlukta hücreler ana hücre eki teşvik eden bir hücre dışı matris (ECM) ürünü ile kaplı önceden.
NOT: Bir ticari mevcut (örn., Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörü kullanıyoruz (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler nemlendirilmiş inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kültüre edildi ve taze ortam Her geçen gün yenilendi.- Kaplama için kültür bulaşıkları, hücre tohumlamasından önce 10 dakika ila 2 saat süreyle oda sıcaklığına ısıtılmış hücre bağlama kaplama malzemesiyle kaplanır. Daha önce bağlanma faktörünü kaldırınHücre süspansiyonu ekleniyor.
- Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin.
NOT: Birden fazla deri izolatı kombine edilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir 15 mL tüp içinde (tüp başına 5 deriye kadar) inkübe edilebilir. Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C'lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin.
2. Yetişkin Kuyruk Cildinden Primer Fare KC İzolasyonu
- Yetişkin bir C57BL / 6 fare (tercihen 6-15 hafta arasında yaş; erkek ya da dişi) hayvan tesis yönetmeliklerine göre kurban edilir. Kuyruk gövdesindeki kuyruğu kuyruk tabanı üzerinden kesin ve ucunda görünür bir delik olması için ~ 2 mm kuyruk ucunu kesin.
- Kuyruk cildi soymak için öncelikle kuyruk derisini kaide ucundan kuyruk ucuna kesmek için keskin bir bıçak kullanın. Ardından, maruz kalan kuyruk kemiğini ve diğer forsepsleri kavramak için bir forseps kullanın ve hafifçe tek bir kesintisiz hareketle kemikten kuyruk cildi soyun. Soyulmuş cildi orta çizgiden kesin böylece her bir parça 2-3 cm'den daha kısa olacaktır.
- Soyulmuş deri zehirini yıkayınH 10 mL'lik bir Petri kabında steril PBS'nin 15 mL'si, daha sonra her bir kuyruktan cildi buz soğuğu sindirim tamponu (KC büyüme ortamında 4 mg / mL dispaz) ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin.
NOT: Birden fazla cilt parçası da birleştirilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir adet 15 mL'lik tüple (en fazla 5 kuyruk tüpü) inkübe edilebilir.- Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C'lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin.
- Tek hücre süspansiyonunu kuyruk epidermisinden izole etmek için 1.4 ila 1.13 arasındaki adımları uygulayın.
- 10 x 10 4 / cm2 yoğunluğunda yetişkin hücrelerinin tohum kültür tabaklarına kollajen ile önceden kaplanmış KC büyüme ortamı içinde (bir hematositometre ile sayılmıştır).
NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir kollajen bazlı kaplama kiti kullanırız (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler, 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör içinde kültürlenmiştir ve taze ortam her gün doldurulan. Genel olarak, cUltura yemekleri, hücre ekiminden önce 30 dakika ila 1 saat boyunca kollajen ile kaplanmalıdır. Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörüne kıyasla, kollajen ile kaplandığında kaba yetişkin KC bağlanmasının önemli bir artışının olduğunu gözlemliyoruz. - Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin.
3. Yüksek Kalsiyum ile KC'lerin İn Vitro Farklılaşması
- Nihai değişimi etkilemek için, kültür ortamı içinde 0.2 mM CaCl2 ilave edin.
- Alternatif olarak, yüksek kalsiyum ilavesinden önce düşük kalsiyum KC bazal ortamda eklenen büyüme takviyeleri olmadan kültürlü KC'leri bir gece aç bırakın.
NOT: Büyüme faktörü açlığı, erken farklılaşma için hücre taahhüdünü ve K10 gibi erken farklılaşma belirteçlerinin indüksiyonunu geliştirecektir 5
4. UVB Işınlaması Aracılı Hücre Ölümü ve KC'lerden TNFa salınımı
- Hücreler konfluansa ulaşıncaya kadar günlük orta değişim ile KC büyüme ortamında fare KC'leri (37 ° C'de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş inkübatörde) kültürleyin. UVB ışınlamasından hemen önce, büyüme ortamını çıkarın ve 500 μL PBS ile değiştirin. Daha sonra hücreleri 25 mJ / cm 2 UVB veya taklit kontrol uygulayın (UVB yok).
Not: UVB ışınlaması daha önce tarif edildiği gibi 10, iki 8 W ampuller (312 nm) ile el UVB lambalar kullanılarak gerçekleştirilir. UVB ışınlamasından sonra, PBS aspire edilir ve taze ortam ilave edilir. - Ölçün ve 6, 8, CCK-8, hücre canlılığı deneyi ile hücre canlılığını ölçmek ve üreticinin talimatlarına 11 takip eden 24 saat sonra UVB tedavisi.
- İstenilen zaman noktalarında UVB ile muamele edilen KC'lerden şartlandırılmış ortamı toplayın ve salınan TNFa'yı ölçünÜreticinin talimatına göre 7 , 12 numaralı fare TNF (Mono / Mono) ELISA kiti ile klimatize edilmiş ortamda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yenidoğanın ve erişkin KC'lerin yüksek kalsiyum indükte terminal farklılaşması. KCs kaplanmıştır ve 0.06 mM CaCl2 muhafaza primer fare, epidermal bir tek tabaka olarak büyüdü ve tek tek hücreler bir kaldırım taşı görünümünü gösteren, farklı hücre içi alana sahip çok kenarlı bir şekle sahiptir zaman konfluent (Şekil 1A ve Şekil 2A). CaCl2 0.2 mm kaldırma hücrelerinin hızlı morfoloji değişikliği neden olmuştur. Yüksek kalsiyum değişiminden 8 saat sonra hücreler düzleşti ve belirgin hücre içi boşluk daha belirginleşti ve 24 saat boyunca sıkı kavşaklarla hücre-hücre yapışması belirginleşti ( Şekil 1A ve Şekil 2B ). Kornifiye hücre zarfının oluşumu ve dikey hücre tabakalaşımı, yüksek kalsiyum geçişinden yaklaşık 48-72 saat sonra başlamıştır ( Şekil 2B). Yüksek kalsiyum geçişi sırasında aktin biçimlenme ve hücre-hücre sıkı bir bağlantı oluşumu analiz etmek için, KCs 0.2 mM CaCl2 ile muamele KC farklılaşma 13 boyunca aktin biçimlenme ölçmek için phalloidin (Şekil 1B) ile boyanmıştır. Bitişik hücreler arasında aktin lifi bakımından zengin filopodial projeksiyon oluşumu, kalsiyum geçişinden yaklaşık 3 saat sonra tespit edildi ve aktin fiber yeniden modellenmesi 6-24 saat arasında daha da ilerledi ve 48 saat boyunca hücre tabakalaşması ön plana çıktı ( Şekil 1B ).
Fare KC'lerin UVB ile tetiklenen hücre ölümüne ve TNFa salınımına duyarlılığı . Kültürlenmiş yetişkin fare KCs 25 mJ / cm2, UVB irradyasyonunun maruz bırakılır ve kültür ortamı içinde serbest hücre canlılığı ve TNFa analiz edilmiştir. Faz kontrast görüntüleri ( FiguYeniden 3A) yanı sıra hücre canlılığı testi ( Şekil 3B ), UVB zaman bağımlı ölüm KCs tetikledi. 24 saat boyunca, hücrelerin çoğunluğu yuvarlatılmış ve çanaktan ayrılmıştır ( Şekil 3A ). Hücre canlılığı tahlili ile niceleştirildiğinde, ~% 90 hücre, UVB tedavisinden 24 saat sonra öldü ( Şekil 3B ; tek yönlü ANOVA çoklu karşılaştırma testi ile hesaplanan p <0.001). Son olarak, UVB tarafından indüklenen ve UVB ışınlama 14'ten sonra KC apoptozunu yönlendiren önemli bir sitokinin TNFa'nın UVB ışınlamadan 24 saat sonra ~ 250 pg / mL, p <0.001) kültür ortamında bol miktarda salındığını gösterdik UVB ile işlemden geçirilmiş KC'leri zamana bağlı bir tarzda ( Şekil 3C ) izler.
şekil 1: Yenidoğan Fare KC'lerinin Primer Kültürü ve Yüksek Kalsiyum İndüklenmiş Terminal Farklılaşması ve Sıkı Hücre-Hücre Bağlantısı Oluşumu. ( A ). Primer neonatal fare KCs yüksek kalsiyum (0.2 mM CaCl2) ile muamele edildi ve 4X büyütmede faz kontrast görüntüleri 0 saat (kontrol) ve tedaviden sonra 8 saate alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ). Yenidoğan KCs 0.2 mM CaCl2 varlığında farklılaştırılmıştır ve hücreler, farklılaşma sırasında komşu hücreler arasındaki aktin lif açısından zengin filopodial çıkıntıların oluşumunu görselleştirmek phalloidin (kırmızı) ile boyanmıştır. Çekirdeklere DAPI ile karşıt boyama yapıldı ve aktin elyafları rodamin falloidin ile boyandı. Ölçek çubuğu = 25 μm. Görüntüler, DAPI kanalına (çekirdek boyama için) ve RFP kanalına (aktin boyama için) ayarlanmış bir floresan mikroskop kullanılarak 20X büyütme ile çekilmiştir. Lank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Yetişkin fare KC'lerinin Primer Kültürü ve Yüksek Kalsiyum İndüklü Terminal Farklılaşması. ( A ). Başlangıç kaplamasından 8 saat, 1 gün, 2 gün ve 3 gün sonra primer erişkin fare KC'lerinin 10x büyütülmesiyle faz kontrastlı görüntüler. Üst panel, dGS'de yetiştirilen hücreleri temsil eder ve alt panel, 8 ng / mL rekombinant fare EGF'si ile% 10'luk çapraz bağlı FBS'de (cFBS) yetiştirilen hücreleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ). Karışmış yetişkin fare KCs 0.2 mM varlığında CaCl2 içerisinde ayrıştırıldı ve 10 kat büyütmede faz kontrast görüntüleri 0 (strok), 8, 24, 48 alındı ve 72 saat sonra, yüksek kalsiyum düğmesi. Ölçek çubuğu = 100 μm.Nk "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Yetişkin fare KC'lerin Primer Kültürü ve Erişkin KC'lerin UVB'nin neden olduğu Hücre Ölümüne Duyarlılığı ve TNFa'nın Salınımı. Birincil yetişkin fare KCs daha sonra 25 mJ / cm2, UVB irradyasyonunun maruz konflüansa, kültürlendi. ( A ) UVB maruziyetinden 12 ve 24 saat sonra alınan 10X büyütmede faz kontrastlı görüntüler UVB'nin yol açtığı bir hücre ölümüne bağlı olduğunu gösterdi. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) Hücre yaşayabilirliği, UVB tedavisinden 6, 8 ve 24 saat sonra CCK-8 hücre canlılığı testi ile nicelleştirildi. ( C ) Belirtilen zaman noktalarında UVB'nin ortamda TNFa'nın salınması ELISA ile ölçülmüştür. Tüm hata çubukları ortalama ± SEM gösterir. P-değerleri, tek yönlü ANOVA çoklu karşılaştırma yöntemi ile hesaplandıTest (***, p <0.001) Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cilt epidermisi vücudu dış ortamdan ayırmak ve korumak, su kaybı, patojenler, ısı ve UV ışınlarından hasar oluşturmak için kritik bir bariyer olarak işlev görür. KC'ler epidermisin baskın hücre soylarıdır ve epidermal KC'lerin birincil kültürü, bariyer oluşumunun biyolojik süreçlerini ve KC'lerin in vitro ortamda hakaretlere tepkisini incelemek ve anlamak için yararlı bir araçtır.
Burada neonatal ve erişkin fare derisinden birincil epidermal KC'leri izole etme ve kültür yöntemlerini açıklıyoruz. Birincil fare KC'leri yenidoğan fare derisinden kolayca izole edilebilse de, erişkin KC'lerin izolasyonu ve başarılı kültürü, epidermisin inceltilmesi ve erişkin fare dorsal dölünün yüksek kıl folikül yoğunluğundan dolayı zor kabul edilir. Burada açıklanan yöntem, yetişkin fare kuyruğu cildi temel KC'lerin uygun ve bol kaynağı olarak kullanmaktadır. Kalın bir epidermisin varlığı ve düşük olması nedeniyle Kuyruk cildindeki kıl follikülü yoğunluğu, kuyruk cildinin geceleme sindiriminden sonra dermisden epidermisi ayırarak KC'lerin izole edilmesi için kritik adım olur. Bunun aksine, bu protokolü kullanarak KC'leri yetişkin dorsal cilden izole etme girişimimiz başarısız olmuş, izolasyondan sonra düşük hücre verimi ve kaplamadan sonra düşük hücre eklemesi ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, kürk içermeyen deri 15'in gece tripsin sindiriminden sonra erişkin dorsal deriden KC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi ve kültürü bildirilmiştir; bu da, dispazın tek başına yetişkin dorsal cildin dermisinden foliküler KC'leri çıkarmak için yeterli olmayabileceğini düşündürmektedir.
Bu protokolde, birincil KC'ler, daha önce yayınlanmış birkaç fare KC kültür protokolünde yaygın olarak kullanılan kalsiyum tükenmiş chelexed-FBS yerine dGS ile takviye edilen düşük kalsiyum ortamında yetiştirildi. 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. Bu çalışmada, dGS'nin yetişkin fare KC'lerini kültürlemek ve KC'nin bazal hücre morfolojisini korumak için ( Şekil 2A ) chelexed FBS'den daha üstün olduğunu gözlemledik.Ancak, muhtemelen chelexed-FBS'nin etkinliği KC'nin bazal morfolojisini korumak her çalışmada kullanılan FBS lotuna bağlı olabilir.
Burada sunulan yöntemleri kullanarak, hem yenidoğan hem de erişkin fare epidermal KC'lerinin, yüksek kalsiyum tetiklemeli terminal farklılaşmasına, sıkı hücre birleşim oluşumuna ve tabakalaşmaya yanıt verdiğini gösterdik ( Şekil 1 Ve Şekil 2 ). Genel olarak, hücre dışı kalsiyum seviyesinin 0.1 mM'den daha yüksek bir seviyeye çıkarılması bazal KC'lerin terminal farklılaşmasını tetikler 4 , 5 , 17 ,Eşek = "xref"> 19. Orta düzey bir kalsiyumun (0.1-0.16 mM), kalsiyum geçişinden sonraki ilk 24 saat boyunca, K1 ve K10 gibi erken farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonunu büyük oranda indüklediği, buna karşılık K1 ve K10'un sadece küçük bir seviyede indüklendiği bildirilmiştir Yüksek kalsiyum ortamı (1 mM) ile muamele edildiğinde hücrelerin fraksiyonu 19 , 20 . Bununla birlikte, daha yüksek kalsiyum ortamı (≥1 mM), KC tabakalaşma ve INV ve LOR 4 , 21 , 22 , 23 gibi geç farklılaşma genlerinin ekspresyonunu hızla ve sağlam bir şekilde pek çok çalışmada yaygın şekilde kullanılmıştır. Deneyimlerimize dayanarak, 0,2 mM CaCl 2 gibi orta düzeyde bir kalsiyum, kademeli ve yavaş bir şekilde terminal diferansiyasyonun başlamasına neden olurken, daha yüksek bir kalsiyum seviyesi (≥1 mM), KC te'nin başlamasını hızlandırırRminal farklılaşma, farklılaşma sırasında hücresel değişiklikleri incelemek için daha kısa bir zaman penceresi sağlar. Bu nedenle, KC, nihai değişimi etkilemek için 0.2 mM CaCl2 kullanıldı, ve bu ara ürün, kalsiyum seviyesi Kalsiyum anahtarı (Şekil 2B) sonra 72 saat içinde, bir tabakalı korneosit morfolojisine bazal hücre morfolojisi aşamalı bir değişime neden olduğunu göstermiştir.
Grubumuz daha önce epidermal KC'lerin yaralanma ve / veya UVB ışınlaması sırasında salınan patojenlere veya DAMPlere iltihaplanma tepkilerini başlatmada önemli bir rol oynadığını daha önce göstermişlerdir 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Bu in vivo gözlemlerle tutarlı olarak, burada, yetişkin fare KC'lerinin, UVB ile tetiklenen hücre ölümüne karşı oldukça hassastır ve UVB ile muamele edilmiş KC'ler,Bağışıklık sistemini aktive eden önemli bir enflamasyonlu sitokin olan TNFa'nın miktarı.
Özetle, birincil fare epidermal KC hücre kültürü, KC'lerin epidermal bariyer oluşumunu ve doğal immün yanıtını incelemek için yararlı in vitro bir model sağlar ve burada açıklanan yöntemler yenidoğan fareinde kutanöz biyolojide araştırmalar yapan araştırmacılar için ilgi çekici olacaktır Yetişkin fare gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma ULUSAL ARTRİT, MİSKÜLOKELETAL VE CİLT HASTALIKLARI ENSTİTÜSÜ (R01AR069653 - Zhang LJ) ve Ulusal Sağlık Destek Enstitüleri (5T32AR062496-03 - CA) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
