Summary
Îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire régule la distribution de sang îlot et maintient la fonction physiologique des cellules β des îlots. Ce protocole décrit en utilisant un moniteur Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo et d’évaluer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques de maladies liées au pancréas.
Abstract
Comme un état fonctionnel de la microcirculation, vasomotricité microvasculaire est importante pour la livraison de l’oxygène et les nutriments et l’élimination du dioxyde de carbone et les déchets produits. L’altération de la vasomotricité microvasculaire pourrait être une étape cruciale dans le développement de maladies liées à la microcirculation. En outre, les îlots pancréatiques fortement vascularisé est adapté pour soutenir la fonction endocrine. À cet égard, il semble possible d’en déduire que l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait affecter la fonction des îlots pancréatiques. Analyser les changements pathologiques de l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait être une stratégie possible pour déterminer les contributions que microcirculation îlots pancréatiques rend aux maladies connexes, telles que le diabète sucré, pancréatite, etc.. Par conséquent, le présent protocole décrit à l’aide d’un contrôleur de flux de sang Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire et d’établir des paramètres (y compris la perfusion sanguine moyenne, amplitude, fréquence et parent Vitesse de la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques) pour l’évaluation de l’état fonctionnel microcirculatoire. Dans un modèle de souris diabétiques streptozotocine, nous avons observé un état fonctionnel avec facultés affaiblies des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire. En conclusion, cette approche d’évaluation des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo peut révéler des mécanismes relatifs aux maladies d’îlots pancréatiques.
Introduction
En tant que paramètre de l’état fonctionnel de la microcirculation, vasomotricité microvasculaire assume la responsabilité de la livraison et l’échange d’oxygène, les nutriments et les hormones et est essentielle à l’élimination des produits métaboliques, tels que le dioxyde de carbone et les déchets cellulaires 1. la vasomotricité microvasculaire réglemente également la distribution du débit sanguin et la perfusion tissulaire, ce qui affecte locale artérielle microcirculatoire et réponses à l’inflammation, qui peut induire un oedème dans de nombreuses maladies. Par conséquent, vasomotricité microvasculaire est extrêmement importante de maintenir la fonction physiologique des organes2,3,4, tissus et cellules. L’altération de la vasomotricité microvasculaire pourrait être une des étapes clés dans le développement de maladies liées à la microcirculation5.
Laser Doppler a été initialement développé pour l’observation et la quantification dans le domaine de la microcirculation recherche6. Cette technique, ainsi que d’autres approches techniques (p. ex., laser speckle7, oxygène transcutanée, etc.), a été considérée comme la méthode de référence pour évaluer le débit sanguin dans la microcirculation. La raison d’être que la perfusion sanguine de la microcirculation locale (c.-à-d., capillaires, artérioles, veinules, etc.) peut être déterminée par les appareils équipés de laser Doppler, repose sur le principe de l’effet Doppler. La longueur d’onde et la fréquence de la lumière de l’émission stimulée changent lorsque les particules de lumière rencontrent émouvante globules dans les microvaisseaux, ou qu’ils restent inchangés. Par conséquent, dans la microcirculation, le nombre et la vitesse des globules sont les facteurs clés concernant l’ampleur et la distribution des fréquences de la lumière Doppler décalé, alors que la direction du flux sanguin microvasculaire n’est pas pertinente. À l’aide de différentes méthodes, une variété de tissus ont été utilisés pour des études microcirculatoires, y compris les mésentères et dorsale du pli cutané chambres de souris, rats, hamsters et même les humains8. Toutefois, dans le protocole actuel, nous nous concentrons sur le fonctionnel statut des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité, qui est évaluée à l’aide de laser Doppler et un système d’évaluation maison de paramètre.
Microcirculation îlots pancréatiques est principalement composée d’îlots pancréatiques microvaisseaux et présente des caractéristiques distinctives. Un réseau capillaire des îlots pancréatiques montre une densité cinq fois plus élevé que le réseau capillaire de son homologue exocrine9. Fournissant un conduit pour la livraison de l’entrée de glucose et d’insuline diffusion, des cellules endothéliales des îlots livrent l’oxygène aux cellules métaboliquement actives dans îlet cellules β. En outre, des preuves nouvelles démontre également que l’îlot microvaisseaux interviennent non seulement dans la régulation de l’expression des gènes d’insuline et survie des cellules β, mais aussi en affectant la fonction des cellules β ; promouvoir la prolifération des cellules β ; et en produisant un certain nombre d’angiogénique vasoactifs, substances et facteurs de croissance10. Par conséquent, à cet égard, nous en déduisons que l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire peut affectent la fonction des cellules β îlot et s’impliquer dans la pathogenèse des maladies comme la pancréatite aiguë/chronique, le diabète et autres maladies liées au pancréas.
Analyser les changements pathologiques de l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait être une stratégie possible pour déterminer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques pour les maladies mentionnées ci-dessus. Une procédure pas à pas détaillée décrivant l’approche afin de déterminer la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques en vivo fournir ici. Mesures typiques apparaissent alors dans les Résultats de représentant. Enfin, les avantages et les limites de la méthode sont mises en évidence dans la Discussion, ainsi que de nouvelles demandes.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été exécutés dans le respect de toutes les directives, de règlements et les organismes de réglementation. Le présent protocole en démonstration a été réalisé sous la direction et l’approbation de l’Institut de Microcirculation Animal éthique Comité (IMAEC) à la Peking Union Medical College (PUMC).
1. les animaux
- Avant le début de l’expérience, garder trois souris BALB/c par cage, à température contrôlée (24 ± 1 ° C) et humidité (55 ± 5 %), selon un cycle lumière-obscurité de 12 h. Laissez les souris libre accès à la nourriture et l’eau.
- Au hasard de diviser les souris dans un groupe témoin non diabétiques et un groupe de diabétique. Peser chaque souris individuels et calculer le volume d’injection à l’aide de la masse corporelle de chaque souris.
- Rapide des souris pendant 4 h avant l’injection de streptozotocine (STZ) et fournir de l’eau ordinaire comme d’habitude le jour expérimentale 1.
- Préparer un tampon citrate de sodium 0,1 M à pH 4,3. Mettre 1 mL de la solution dans un tube de microtubes de 1,5 mL et envelopper le tube de microcentrifuge en papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
- Dissoudre la STZ dans un tampon citrate de sodium (pH 4.3) à une concentration finale de travail de 5 mg/mL avant utilisation.
- Donner les souris des groupe diabétique des injections intrapéritonéales de STZ à une dose de 40 mg/kg à l’aide d’une seringue de 1 mL et une aiguille 25 G. Injecter les souris du contrôle non diabétiques avec le même volume de tampon citrate de sodium (pH 4,3).
- Remettre les souris dans les cages et leur fournir nourriture et eau à 10 % de sucrose.
- Répétez les étapes 1,3-1,7 expérimental jours 2 à 5 (c.-à-d., les 4 prochains jours consécutifs).
- Remplacer l’eau de 10 % de saccharose eau ordinaire après la dernière injection de STZ.
- Vite les souris pendant 6 h, mais leur donner libre accès à l’eau et mesurer leur glycémie neuf jours plus tard (experimental jour 14). Prélever un échantillon de sang de la veine caudale pour confirmer l’hyperglycémie en utilisant un système de surveillance glycémie.
Remarque : Les souris avec le glucose de sang niveaux > 200 mg / dL sont considérés comme diabétiques.
2. préparation de l’Instrument
- Nettoyer les surfaces optiques de pointe de la sonde et le connecteur de la sonde de l’appareil Doppler laser avec un chiffon doux et non abrasif pour enlever la poussière et les particules. Branchez le câble dans le port de l’instrument (Figure 1 a).
- Monter le support de calibrage en permettant le flux standard d’être en équilibre thermique avec un cadre expérimental (température de la pièce, généralement pendant 30 min). Secouer le flux standard doucement pendant 10 s et laissez reposer pendant 2 min.
- Placer le conteneur standard de flux dans le milieu de la base de l’étalonnage. Ajuster le collier à la hauteur maximale et fixer la sonde dans la pince tels qu’il pointe vers le bas vers le conteneur. Veillez à ce que la norme de flux est correctement positionnée sous la sonde.
- Abaissez lentement la sonde jusqu'à ce que la pointe soit correctement immergée dans la norme de flux. Sélectionnez et appuyez sur « calibration » sur le laser Doppler appareil et choisir le canal de travail relié à la sonde. Exécutez le programme d’étalonnage jusqu'à ce qu’un avis « Calibration réussie » s’affiche sur l’écran du laser appareil Doppler.
- Fixer la sonde à l’aide de porteurs de sonde. Manuellement fixer la sonde pour éviter tout mouvement.
- Maintenir la chambre expérimentale à température constante (24 ± 1 ° C) et humidité (~ 50-60 %).
- Éteindre toute lumière extérieure (tels que les lampes fluorescentes et spots) avant d’effectuer l’expérience afin d’éviter le changement induit par la lumière externe.
3. préparation des animaux
- Autoclave le surgical instruments et laissez-les refroidir à température ambiante avant utilisation.
- Donner les souris 10 min pour s’acclimater à l’environnement expérimental avant détection des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire par laser Doppler.
- Remplissez une seringue de 1 mL avec 1 mL de sodium pentobarbital à 3 %. Injecter la solution de pentobarbital sodique (75 mg/kg i.p.) pour anesthésier les souris.
- Couvrir les yeux de la souris avec une lingette gaze médicale pour prévenir le dessèchement.
- Veiller à ce que la souris complètement perd conscience et ne répond plus aux queue ou arrière-pied pince avec une pince. Surveiller l’anesthésie tout au long de l’événement anesthésique et peropératoire chaque 15 min. maintenir l’anesthésie en la complétant avec 10 % du volume initial d’injection de la solution de pentobarbital lorsque cela est nécessaire.
- Placez un coussin chauffant avec une couche semi-isolant au-dessous de l’animal et mettre l’animal en décubitus dorsal et transférer dans la station de travail du laser appareil Doppler. Fixer la souris vers la plate-forme de travail avec du ruban chirurgical.
- Écouvillon de la peau abdominale de la souris avec la bétadine, puis 75 % d’éthanol est utilisé pour tamponner la zone abdominale propre.
- Injecter par voie sous-cutanée à 2 % lidocaine/0.5% bupivacaïne mélange (50/50). Couper un ~ 3 cm-trou de diamètre au centre d’un tampon de gaze. Couvrir la région abdominale avec le tampon de gaze.
- Soulever la peau abdominale avec une pince et faire une incision verticale initiale le long de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’une paire de ciseaux scalpel ou peau.
- Saisir le muscle sous-jacent avec une pince et inciser pour entrer dans la cavité abdominale. Ne pas blesser un quelconque des organes. Pliez la peau et le muscle sous-jacent au-dessus de la poitrine pour révéler la cavité abdominale. Doucement, exposer le corps du pancréas et la rate à l’aide d’une paire de pince nez émoussé.
4. données Acquisition pour analyse
- Lancez le logiciel de l’appareil Doppler laser en cliquant sur « Fichier » → « Nouveau » pour créer un nouveau fichier de mesure. Pour configurer les moniteurs connectés, sous l’onglet « Général », mis en place la surveillance durée « Gratuite courir. » Utilisez la valeur par défaut de l’usine pour l’onglet « LDF Monitor » cliquez sur « Suivant ».
- Configurer l’affichage graphique dans la « boîte de dialogue Configuration affichage ». Sélectionner les canaux de la « Vitesse de Flux, Conc, » en cochant les cases respectives. Sélectionnez les paramètres suivants : « Source de données pour le canal » et « Label, unités et couleur. » Cliquez sur « Suivant ».
- Entrez les informations sur le sujet et la mesure (par exemple, nom et numéro de l’objet, opérateur, suivi des temps, commentaires, etc.) dans la « boîte de dialogue des informations des fichier » et cliquez sur « Suivant » pour terminer la configuration de la mesure.
NOTE : Une fenêtre de mesure est créée automatiquement par le logiciel (Figure 1 b). - Manuellement, faire progresser l’électrode au pancréas. Assurez-vous que la distance entre les sonde et le pancréas tissus ne dépasse pas 1 mm. Une distance inappropriée donne une lecture de flux de sang artificiellement augmenté ou diminué.
- Cliquez sur l’icône de barre d’outils « Start » pour commencer à enregistrer les données d’unités (PU) de perfusion sanguine microvasculaire. Collecter les données de l’unité centrale en continu pendant 1 min chaque course. Cliquez sur « Stop » pour arrêter la mesure. Sélectionnez « Fichier » → « Enregistrer sous » au nom et enregistrez le fichier de la fin.
- Repositionner manuellement la sonde après chaque course pour éviter les effets additifs et l’épuisement localisé des contractile et capacité de relaxation. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour récolter des données de PU microvasculaires multipoint (c'est-à-dire trois choisis au hasard points de tissu pancréatique) pour chaque souris. Mesurer les données d’unité centrale d’une plaque non réfléchissantes comme un contrôle de base.
- Fermer la couche musculaire abdominal et la couche de la peau avec une suture. Placer les animaux dans des cages propres après les expériences.
- Garder la chaleur animale en plaçant la cage de récupération moitié-sur le coussin chauffant.
Remarque : Faites attention à la chaleur, hygiène, fluide et la prise alimentaire et l’infection. Administrer les souris à 2 mg/kg carprofène pendant 48 h comme la gestion de la douleur postopératoire. Effectuer l’euthanasie par injection i.p. de pentobarbital sodique de 150 mg/kg lorsque les souris sont observés pour être dans un état de douleur ou de détresse qui ne peuvent pas être soulagée.
5. calculer les paramètres de la vasomotricité microvasculaire
- Utiliser la commande « Export » du laser Doppler logiciel pour exporter l’heure et les données brutes d’unité centrale sous forme de fichier *.xlsx et ouvrez le fichier dans une feuille de calcul.
- Calculer l’appareil de perfusion de base moyen (PUb) (voir étape 4.6).
- Calculer la moyenne la perfusion sanguine (PUun) pendant 1 min d’une mesure comme suit : la perfusion sanguine (PUun) en moyenne = PU - PUb (équation 1).
- Calculer la fréquence (cycles/min) pour chaque 1 min de mesure.
Remarque : La fréquence de la vasomotricité microvasculaire est définie comme le nombre de pics qui s’est produite dans une vague de la vasomotricité microvasculaire par minute. - Calculer l’amplitude (ΔPU) pour chaque 1 min de mesure.
- Calculer l’amplitude de la vasomotricité microvasculaire comme la différence entre (PUmax) maximale et minimale (minde PU) : Amplitude (ΔPU) = PUmax - PUmin (équation 2).
- Calculer la vitesse relative (PU) pour chaque 1 min de mesure.
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Representative Results
Une photo du laser mesure microvasculaire vasomotricité Doppler appareil équipé d’une diode laser de semi-conducteur est montrée dans la Figure 1 a. Logiciel d’interface utilisateur est présenté dans la Figure 1 b. À l’aide de la méthode susmentionnée, les paramètres hémodynamiques des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire ont été détectées chez les souris diabétiques et non diabétiques témoins. Une variété de techniques, y compris la débitmétrie Doppler laser, reflète et dispersés léger, infrarouge spectroscopie et techniques, d’imagerie ont été utilisée pour étudier la vasomotricité microvasculaire puisqu’il a été tout d’abord défini. Le tableau 1 résume les groupes de recherche et publié des articles qui utilisent le laser technologie Doppler pour déterminer le rôle de la microcirculation dans le diabète et les maladies apparentées.
En général, les conditions microcirculatoires de l’îlot pancréatique sont représentées par l’état fonctionnel des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité en utilisant les paramètres microvasculaires, y compris la perfusion sanguine moyenne, fréquence, amplitude, parent Vitesse (Figure 2). Le schéma représentatif de la vasomotricité microvasculaire se compose principalement des phases de contraction et la relaxation périodiques (Figure 2 a). Les phénomènes hémodynamiques présentent un modèle de la perfusion de circulation sanguine dans les réseaux microvasculaires. Données d’unité centrale recueillies par laser Doppler appareils étaient employées de diagrammes de dispersion de graphique et de montrer le mode de répartition de la perfusion sanguine microvasculaire. Dans le protocole actuel, les modes de répartition de la perfusion sanguine microvasculaire îlots pancréatiques chez les souris diabétiques et non diabétiques ont été totalement différente (Figure 2 b). Une échelle inférieure de la perfusion sanguine des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité a été observée chez des souris diabétiques par rapport au contrôle non diabétiques. Le rythme des contractions et relâchements des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire étaient chaotique et irrégulier chez des souris diabétiques par STZ, tandis que les non diabétiques contrôles présentait des oscillations rythmiques (Figure 2 et Figure 2D). Nous avons extrait les données de 5 s de la perfusion sanguine microvasculaire îlots pancréatiques dans les lignes en pointillé dans la Figure 2 et Figure 2D et démontré que les fluctuations chaotiques des îlots pancréatiques microvasculaire sang perfusion chez des souris diabétiques perdu la capacité de réguler l’état fonctionnel des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité, qui devrait avoir lieu en réponse au sang glucose fluctuation (Figure 2E).
Par ailleurs, pour répondre à l’hyperglycémie, les îlots pancréatiques doivent suffisante et perfusion de flux de sang biorhythmic pour le transport de l’insuline. La vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques (y compris la perfusion sanguine moyenne, amplitude, fréquence et vitesse relative) ont été ensuite calculées et une analyse quantitative basée sur les profils d’unité centrale. Comme illustré à la Figure 3, par rapport aux témoins non diabétiques, la perfusion sanguine moyenne de la microcirculation des îlots pancréatiques a diminué chez les souris diabétiques par STZ (Figure 3 a). Pendant ce temps, il y a diminution significative a noté dans l’amplitude (Figure 3 b) et la fréquence (Figure 3) des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire chez les souris diabétiques par STZ. La vitesse relative de la perfusion sanguine îlots pancréatiques a considérablement diminué dans le groupe de diabétique par STZ comparé au contrôle non diabétiques (Figure 3D). Comme mentionné ci-dessus, l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire était altérée chez les souris diabétiques. Nous émettons l’hypothèse que des anomalies de rythme, avec une diminution de fréquence, l’amplitude et la vitesse relative des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité, pourraient entraîner un déficit de perfusion sanguine microvasculaire, ce qui peut endommager les cellules β des îlots et réduire sécrétion d’insuline.
La figure 1. Appareil servi à déterminer les îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo. A. photo de l’appareil de mesure servi à déterminer la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques de souris. Les douilles de la sonde et interrupteur de laser sont dans le panneau de gauche. L’affichage à cristaux liquides est dans le panneau central. Les boutons du menu (c'est-à-dire le haut, le bas et entrez les boutons) et la puissance diode électroluminescente sont dans le panneau de droite. Les périphériques (p. ex., ordinateurs et câbles) n’apparaissent pas. B. capture d’écran illustrant les éléments typiques et les canaux de graphique du logiciel de l’appareil Doppler laser. « Flux », « Conc », « DC », et les relevés de mesure « Speed » sont affichés dans les canaux de graphique. « Flux » représente la perfusion sanguine microvasculaire tissulaire, « Conc » représente la concentration de globules microvasculaire tissulaire, « DC » représente l’intensité moyenne de réfléchissant la lumière, et « Speed » représente la vitesse relative du flux sanguin microvasculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. L’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire chez les souris. La perfusion sanguine des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité a été évaluée par un laser appareil Doppler, et l’état fonctionnel a été analysée. A. schéma de paramètres relatifs à la vasomotricité microvasculaire. Ca représente l’amplitude de la contraction de la vasomotricité microvasculaire, Ar représente l’amplitude d’une relaxation de la vasomotricité microvasculaire, Tc représente la longueur du temps d’une contraction de la vasomotricité microvasculaire et Tr représente la longueur du temps d’une relaxation de la vasomotricité microvasculaires. B. mode de répartition de la perfusion sanguine microvasculaire îlots pancréatiques chez les souris diabétiques et non diabétiques. Points rouges : souris non diabétiques. Blue dots : souris diabétiques. La ligne verte pointillée représente la démarcation entre le modèle de la perfusion de sang microvasculaires diabétiques et non diabétiques. C. la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques dans le groupe témoin a été évaluée en fonction de la perfusion microvasculaire dynamique de la circulation sanguine. D. îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire chez les souris diabétiques a été évaluée en fonction de la perfusion microvasculaire dynamique de la circulation sanguine. E. schéma du représentant (gamme 5-s) îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité entre le contrôle non diabétiques et les souris diabétiques. Ligne rouge : contrôle non diabétiques. Ligne bleue : souris diabétiques. LOT : unités de perfusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Quantification des paramètres d’îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire. Paramètres de la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques, y compris la perfusion sanguine moyenne, amplitude, fréquence et vitesse relative ont été analysés et comparés entre contrôle non diabétiques et souris diabétiques. A. dosage de la perfusion sanguine moyenne (PU/min) des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire chez les souris diabétiques et non diabétiques. L’amplitude de B. (ΔPU), C. fréquence (cycles/min) et D. vitesse relative (PU) des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaires étaient plus faibles chez les souris diabétiques que chez les souris témoins non diabétiques. L’amplitude de la vasomotricité microvasculaire a été calculé comme la différence entre (PUmax) maximale et minimale (minde PU). La fréquence de la vasomotricité microvasculaire a été définie comme le nombre de pics et les vallées qui se sont produites dans une vague de la vasomotricité microvasculaire par minute. Les données ont été présentées comme la moyenne ± écart-type (n = 6 dans chaque groupe). P < 0,05, **P < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Maladies | Objet | Appareil | N° de Réf. |
| Fonction endothéliale | H | LDF, LSCI | 11, 12, etc. |
| DN | H, R | LDF | 13, 14, 15, etc. |
| DR | H | LDF | 16, 17, 18, etc. |
| Microcirculation cutanée/peau | H | LDF | 11, 19, 20, etc. |
| Microcirculation cardiaque | R | LDF | 21 |
| Déficience auditive | M | LDF | 22 |
| DN, neuropathie diabétique. DR, la rétinopathie diabétique. LDF, laser débitmétrie Doppler. | |||
| LSCI, laser speckle imagerie de contraste. R, rat. H, humain, M, souris. | |||
Tableau 1. Le rôle de la microcirculation dans le diabète et ses complications. Groupes de recherche ont utilisé le laser Doppler pour déterminer le rôle de la microcirculation dans le diabète et ses complications pendant des décennies. Articles connexes au cours des dernières années sont répertoriés ici. Ces articles publiés portent principalement sur la dysfonction endothéliale, la neuropathie diabétique (DN), rétinopathie diabétique (RD), peau et cutanée atteinte microvasculaire et relativement rares complications telles que la dysfonction cardiaque microcirculation et audience déficience. DN : neuropathie diabétique. DR : la rétinopathie diabétique. LDF : laser débitmétrie Doppler. LSCI : imagerie de contraste laser speckle. R : rat. H: humaine. M: souris.
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Discussion
Dans les cas qui impliquent la dysfonction microvasculaire (p. ex., diabète, pancréatite aiguë, les affections périphériques microvasculaires, etc.), certaines maladies conduisent à une diminution du débit sanguin. Outre les changements dans la circulation sanguine, il y a des indicateurs importants, tels que la vasomotricité microvasculaire, qui reflètent l’état fonctionnel de la microcirculation. L’indicateur spécifique, la vasomotricité microvasculaire, est généralement défini comme l’oscillation de la tonalité microvasculaire dans lits microvasculaires. Dans le protocole actuel, une système de surveillance de la perfusion sanguine microvasculaire permet la visualisation directe et l’analyse quantitative de l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire. Notre approche de l’évaluation microcirculatoire peut être appliqué sélectivement aux organes et tissus ciblés en identifiant les variations dynamiques de la perfusion sanguine. Les rapports publiés par d’autres groupes sur l’utilisation de laser Doppler pour déterminer le rôle de la perfusion sanguine microvasculaire dans le diabète et ses complications ont été résumées dans le tableau 1. Dans la présente étude, afin de démontrer notre approche, l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques de souris diabétiques a été évaluée.
La vasomotricité microvasculaire est reconnue comme un paramètre de l’état fonctionnel de la microcirculation et est capable de réguler la perfusion sanguine flux en ajustant la distribution tissulaire locale23. La microcirculation du pancréas, qui peut être divisé en îlots, acini et canaux, a été étudiée pendant des décennies. Fondamentalement, cette séparation du pancréas en différentes parties est par souci de commodité seulement parce que la microcirculation est effectivement interconnectées et homogène comme une entité organique24. Ce réseau de capillaires prend en charge la régulation du débit sanguin îlots pancréatiques. Donc, nous avons utilisé des paramètres de l’état fonctionnel, déterminée par laser Doppler, pour représenter la vasomotricité microcirculation îlots pancréatiques. Toutefois, en raison des caractéristiques de l’architecture du pancréas, nous avons toujours pas de porter un jugement après avoir appliqué la méthode actuelle pour vérifier si la perfusion de sang provient de la partie endocrine ou de la partie exocrine du pancréas. Avec îlot spécifiques d’étiquetage des colorants, tels que dithizone et du rouge neutre, peut devenir l’un des moyens possibles de comprendre cette question, au moins dans une certaine mesure.
Un aspect important de l’étape de mesure est la distance entre la sonde et le tissu du pancréas. Une distance inappropriée donne un flux de sang accru artificiellement la lecture. La force physique sur les tissus et organes par une extrémité de la sonde réduira le flux sanguin microvasculaire. Par conséquent, une pression minimale doit être appliquée lors de la prise de mesures. Un autre point à noter est la puissance des lasers. Lasers haute puissance généralement facilement blessent les microvaisseaux dans les îlots pancréatiques, donc la fréquence du faisceau laser doit être contrôlée, dans les limites. Pour les mesures générales et temporelles, une fréquence de 1 Hz ou moins est recommandée. Pour éviter l’épuisement localisée de la capacité de la vasomotricité microvasculaire (y compris contractile et relaxation) et l’effet additif, détermination multipoint et repositionnement site après chaque mesure sont conseillés dans toutes les expériences.
Dans la méthode actuelle, les données d’unité centrale sont utilisées pour représenter le flux sanguin du flux sanguin microvasculaire. En raison des caractéristiques du flux sanguin microvasculaire dans la microcirculation, il n’est pas possible de déterminer les unités de circulation absolue (par exemple, mL/min/100 g de certains organes ou tissus). Par conséquent, le système de paramètre d’évaluation utilisé ici repose sur les unités de perfusion de flux de sang relative. L’analyse par ondelettes, transformation de Fourier rapide et autres algorithmes d’analyse spectrale sont des méthodes courantes qui effectuent des signaux Doppler laser. Dans le présent protocole, nous avons mis en place une approche qui utilise des paramètres hémodynamiques (c.-à-d., la perfusion sanguine, amplitude, fréquence et vitesse relative) pour montrer l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire. En outre, la précision de la mesure est liée à la profondeur de la cible et la conception de la sonde, qui est généralement d’environ 1 mm. Ainsi, tissus et organes plus épais ou compacts peut-être pas nécessaires pour l’application du laser Doppler, ainsi que pour la méthode actuelle. En outre, parce que les données provenant de la perfusion sanguine débit pourraient être affectées par d’autres conditions qui provoque des changements notables, y compris la température, humidité, lumière extérieure et les modifications dans la position des souris, certaines règles doivent être obéis au cours de la procédure expérimentale. Le laboratoire doit maintenir l’humidité et température constante, et éclairage extérieur doit être protégé. Il est recommandé de fixer les souris pour éviter les changements de position. On croit que ces stratégies peuvent surmonter les limitations mentionnées ci-dessus et augmenteront la précision des données de perfusion pour le flux sanguin.
L’avantage du présent protocole en comparant avec d’autres rapportés dans la littérature, c’est qu’il est sensible et réceptif à la vasomotricité microvasculaire locale des tissus et organes. Cela facilitera l’application plus large de la méthode pour l’évaluation ou enquête de la microcirculation, en particulier l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire, en recherche clinique et laboratoire. Les applications incluent mais ne se limitent pas à : visualisation de l’ischémie, évaluation de la perfusion sanguine et l’évaluation de l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire. En conclusion, notre procédé peut être utilisé pour examiner et évaluer l’état fonctionnel de la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques de souris in vivo et peut être en mesure de répondre aux besoins cliniques pour évaluer la fonction de la microcirculation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Peking Union Medical College Youth Fund et le Fonds de recherche fondamentale pour les universités de centrale (Grant no 3332015200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data |
| MoorVMS-PC Software | Moor Instruments | GI80-1 | Software of MoorVMS-LDF2 |
| Calibration stand | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration base | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration flux standard | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| One Touch UltraEasy glucometer | Johnson and Johnson | #1955685 | Confirm hyperglycemia |
| One Touch UltraEasy strips | Johnson and Johnson | #1297006 | Confirm hyperglycemia |
| Streptozotocin | Sigma-Aldrich | S0130 | Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3) |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Working concentration 3 % |
| Ethanol | Sinopharm Inc. | 200121 | Working concentration 75 % |
| Sucrose | Amresco | 335 | Working concentration 10 % |
| Medical gauze | China Health Materials Co. | S-7112 | Surgical |
| Blunt-nose forceps | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Surgical |
| Surgical tapes | 3M Company | 3664CU | Surgical |
| Gauze sponge | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Surgical |
| Scalpel | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Surgical |
| Skin scissor | Carent | 255-17 | Surgical |
| Suture | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Surgical |
| Syringe and 25-G needle | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Scale: 1 ml |
References
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