Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56029

Summary

هذا نظام غذائي الدهون عالية التغذية البروتوكول للحث على السمنة في المورفولوجية، نموذجا لفهم الآليات الجزيئية الأساسية المتورطين في ليبوتوكسيسيتي. كما يوفر مقايسة ترياسيلجليسيريدي إنتاجية عالية لقياس تراكم الدهون في أخرى يحتمل أن تكون نماذج (الحشرات) تحت مختلف الظروف الغذائية أو البيئية أو الوراثية أو الفسيولوجية و المورفولوجية .

Abstract

أمراض القلب هي السبب الأول للوفيات البشرية في العالم. وأظهرت العديد من الدراسات اتصالات قوية بين السمنة وقصور القلب في البشر، ولكن المزيد من الأدوات وجهود البحوث ضرورية لتوضيح أفضل الآليات التي ينطوي عليها. لأكثر من قرن، كانت مفيدة في اكتشاف الجينات الرئيسية والمسارات الجزيئية التي ثبت أنها تكون حفظت عاليا عبر الأنواع نموذج المورفولوجية وراثيا على درجة عالية من المرونة. العديد من العمليات البيولوجية وآليات المرض هي المصانة وظيفيا في الطيران، مثل التنمية (مثلاً، خطة الجسم، القلب)، والسرطان، وأمراض الأعصاب. في الآونة الأخيرة، دراسة السمنة والأمراض الثانوية، مثل أمراض القلب في نموذج الكائنات، لعبت دوراً تنتقد بشدة في التعرف على المنظمين الرئيسيين المتورطين في المتلازمة الأيضية في البشر.

وهنا، نقترح استخدام هذا الكائن النموذج كأداة فعالة للحث على السمنة، أي، تراكم الدهون، ووضع بروتوكول فعال لرصد محتوى الدهون في شكل تراكم العلامات. بالإضافة إلى حفظت عاليا، ولكن أقل تعقيداً الجينوم، قد الطاير أيضا عمر قصيرة للتجريب السريع، جنبا إلى جنب مع الفعالية من حيث التكلفة. تقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلاً "الدهون في" النظام الغذائي (HFD) عالية التغذية في المورفولوجية للحث على السمنة ومقايسة ترياسيلجليسيريدي (العلامة) إنتاجية عالية لقياس الزيادة المرتبطة بها في محتوى الدهون، بهدف أن تكون الغاية استنساخه و كفاءة للفحص الوراثي أو الكيميائية على نطاق واسع. هذه البروتوكولات وتتيح فرصاً جديدة كفاءة التحقيق في الآليات التنظيمية المعنية بالسمنة، فضلا عن توفير منصة موحدة لبحوث اكتشاف المخدرات للاختبار السريع لتأثير المخدرات المرشحين على تطوير أو الوقاية من السمنة ومرض السكري والأمراض الأيضية.

Introduction

ونحن في زمن حيث السمنة، والأعباء الاقتصادية المرتبطة به، هي مشكلة في جميع أنحاء العالم1. اثنان من كل ثلاثة أميركيين هم يعانون من زيادة الوزن أو السمنة بأمراض القلب ذات الصلة، السبب الرئيسي للموت داخل السكان البالغين2. أساليب فعالة جديدة مطلوبة للتحقيق على نحو كاف المكونات الوراثية والجزيئية المتورطين في التنظيم لمتلازمة الأيض استخدام نموذج الكائنات الحية. ولهذا السبب، علينا اختيار نموذج المورفولوجية ذبابة الفاكهة نظراً لأنها تشترك في العمليات البيولوجية الأساسية مع الثدييات، بما في ذلك الفئران والبشر3،4،،من56. الجينوم المورفولوجيةالمصانة عاليا خلال تطور لكن عموما أصغر بكثير مع تقليل الازدواجية الجينات والأيضية التعقيد، مما يجعله مثاليا لفهم الآليات الأساسية التي تورط في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان4 , 7 , 8. أيضا، العمليات المميزة التي تقوم بها الأنسجة الدهنية، القناة الهضمية والبنكرياس وتتمثل في يطير والتوسط من أجل المهام التنظيمية في استقلاب السكر والدهون، على سبيل المثال، التي مماثلة للبشر9، 10،11. وعلاوة على ذلك، المسارات الجزيئية الأساسية المعنية بمكافحة السمنة ومقاومة الأنسولين ومرض السكري في البشر هي المصانة وظيفيا في melanogaster المورفولوجية12،،من1314 , 15 , 16-مثل الكائنات الحية العليا، المورفولوجية له قلب ضرب التي شكلتها عمليات مماثلة لل3،قلب الثدييات17أثناء التطوير. وهكذا، وضع HFD موثوقة تغذية البروتوكول والمقايسة علامة عالية الإنتاجية، تكييفها لأغراض فحص كفاءة استخدام مربع الأدوات الجينية من المورفولوجية، توفر وسيلة هامة دراسة وفهم الأساس الجيني الكامنة وراء الأمراض الأيضية المعقدة.

الطعام HFD نفسه مصنوع من طعام يطير مختبر قياسية وتستكمل مع زيت جوز الهند، التي يتكون معظمها من الأحماض الدهنية المشبعة التي من المعروف أن تترافق مع متلازمة الأيض18. في حين حمل السمنة في نماذج الثدييات، مثل القوارض، يمكن أن يستغرق أشهر19،20، HFD الأمثل لدينا تغذية البروتوكول في المورفولوجية فعالية وتكاثر يزيد المحتوى العضوي من الدهون في غضون 12،أيام14. يسمح هذا البروتوكول، بالاقتران مع مقايسة عالية إنتاجية العلامة، كفاءة الفحص الشامل لآثار العوامل الوراثية والتأثيرات البيئية والمرشحين المخدرات ليكتشف المغيرون جديدة للتمثيل الغذائي للدهون. ونتيجة لذلك، يرجح هذه البروتوكولات ذات الصلة فهم و/أو مكافحة السمنة والأمراض البشرية المرتبطة بالسمنة.

البروتوكول تغذية متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على دراسة الآثار الأيضية والوظيفية لواحد من الأحماض الدهنية المشبعة أو غير المشبعة. استخدام هذا الفحص علامة عالية الإنتاجية لا تقتصر على melanogaster دال، ولكن يمكن أن تتكيف مع مجموعة متنوعة من الكائنات نموذج صغير مع بشرة أو صعبة مصفوفات خارج الخلية (مثلاً، وغيرها من الأنواع المورفولوجية ، C. ايليجانس والأخرى الناشئة الكائنات اللافقارية النموذجي) لقياس الدهون تحت مختلف الظروف البيئية أو الوراثية أو الفسيولوجية، في أي مرحلة من مراحل التنمية، ومرحلة البلوغ أو مرحلة المرض الأيضي. فحص العلامة يستند إلى مقياس قياس ألوان لسلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تتحلل العلامات في الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين ووالغليسيرول 3-الفوسفات، وأخيراً ح2س2 أن يتفاعل مع 4-أمينوانتيبيريني (4-الوكالة الأسترالية) و 3، 5- ثنائي-2-هيدروكسيبينزيني المشبعة بالفلور أوكتين (المجالس 3.5) لإنتاج منتج ملونة حمراء التي يتم قياسها باستخدام جهاز المطياف الضوئي 96-جيدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-HFD تغذية بروتوكول

Table 1
الجدول 1. الوصفة الغذائية يطير.
يلخص هذا الجدول مختلف المكونات المستخدمة في إعداد التحكم بالغذاء. مرة واحدة، 10 مل الطعام هو سكب قنينة وتبريده والمخزنة في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.

  1. HFD إعداد
    1. لجعل 1 كغم من الأغذية عالية الدهون، تزن 700 غرام غذاء يطير العادية مسبقة الصنع (انظر الجدول 1) و 300 غرام زيت جوز الهند في حاويتين منفصلة باستخدام رصيد التحليلي.
    2. حرارة الحاوية كل على حدة في الميكروويف، حتى تذوب المحتويات تماما. صب زيت جوز الهند في وعاء الغذاء يطير. يحرك باستخدام خفقت حتى يخلط الزيت جيدا في الطعام يطير.
      ملاحظة: لا قطع من المواد الغذائية أو النفط يجب أن تكون مرئية. عندما يذوب الطعام يطير في الميكروويف، تتوقف على فترات من 1 دقيقة لخلط الطعام ومنع يغلي.
    3. إعادة وزن
    4. الدهون المرتفعة للمواد الغذائية. إذا كان إجمالي وزن أقل من 1 كجم (700 غ من المواد الغذائية + 300 غرام من زيت جوز الهند)، إضافة لتعويض التبخر أثناء التسخين ويعود الوزن إلى 1 كجم من الماء (حوالي 10 مل)
    5. من أجل حوالي 10 مل جيدا مختلطة عالية الدهون الغذائية كل قنينة (حوالي 25 في المائة حجم القنينة). وبعد ذلك، تغطي بالقماش القطني لمنع الذباب ' التلوث. بارد ح 1 في درجة حرارة الغرفة ثم نقل القوارير إلى 4 درجة مئوية لتخزين تصل إلى 4 أسابيع-
      ملاحظة: يتم استخدام الغذاء الطبيعي (NF) كغذاء تحكم. أيضا من أجل 10 مل (حوالي 25 في المائة حجم القنينة) من NF كل قنينة. للطعام HFD، يستعاض عن 30% من المواد الغذائية NF بزيت جوز الهند. للتحكم والظروف التجريبية، أعطيت الذباب على نفس القدر من NF و HFD (10 مل أغذية كل قنينة).

Figure 1
رقم 1 . HFD تغذية في المورفولوجية.
المخطط يبين الخطوات التغذية المختلفة للذباب على مراقبة المواد الغذائية (النظام الغذائي العادي دون إضافة زيت جوز الهند-NF) أو HFD (بالإضافة إلى زيت جوز الهند). العملية برمتها تستغرق 10 أيام بعد المجموعة الأولى من الذباب الكبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. HFD تغذية melanogaster دال-
    ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول مراقبة الأغذية وتغذية الإجراءات التي تتوافق مع أي خط الطيران HFD. يتم وضع عنصر التحكم والذباب التجريبية في قارورة تحتوي على نفس كمية الطعام (NF أو HFD).
    1. CO استخدام 2 تخدير الذباب.
      ملاحظة: المبتدئون، الرجاء قراءة مرجع 21 لإلقاء نظرة عامة على رفع ومعالجه ميلانوجاستير د.
    2. جمع
    3. 0-5 الذباب يوم القديمة من قنينات ونقل (عن طريق التقليب) الذباب في قارورة جديدة تتضمن NF (سبق تسخينها في درجة حرارة الغرفة). اسمحوا أن الذباب لسن 5 أيام إضافية في 21 درجة مئوية.
    4. في نهاية 5 أيام، أخرج قارورة تحتوي على HFD و NF من 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: كما يمكن التشديد على درجات حرارة باردة الذباب المعيشة، اسمحوا قنينات الجلوس مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لالاحماء قبل الاستخدام.
    5. باستخدام مناديل، تنظيف وإزالة السوائل الزائدة من الجانبين من القنينات.
    6. إدراج قطعة صغيرة من ورق الترشيح، عن 1 سم × 3 سم، في الأغذية عالية الدهون ﻻستيعاب أي السائل الفائض.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لمنع الذباب من الالتصاق بالطعام HFD.
    7. وبعد ذلك، نقل
    8. الذباب على الأغذية عالية الدهون (بالتقليب). تكمن في قنينات أفقياً إلى جانبهم، (غير الدائمة) في 21-22 درجة مئوية لمدة 5 أيام-
      ملاحظة: تجنب ارتفاع درجات الحرارة كهذا يمكن أن تذوب جزئيا الطعام الدهون عالية، تسبب الذباب إلى التمسك بالغذاء ويموت.
    9. بعد 5 أيام، نقل (عن طريق التقليب) الذباب من NF و HFD في قارورة جديدة دون طعام للسماح بالشجاعة لفارغة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، انتقل إلى وزنها الذباب.
      ملاحظة: إحدى الخطوات الحاسمة في هذا HFD تغذية البروتوكول إعداد HFD جيدا مختلطة، خالية من أي قطع من الطعام يطير أو زيت مكثف. ينصح بخلط متجانس وتبريد HFD إلى 45-30 درجة مئوية، قبل سكب قنينة وتخزين المواد الغذائية في سن مناسبة ° C. 4 مطابقة للتحكم والذباب التجريبية مهم فضلا عن الأوضاع التغذوية والبيئية الخاضعة للرقابة المسبقة لتغذية HFD. أثناء مرحلة الرضاعة، يجب إعطاء عنصر التحكم والذباب التجريبية على نفس القدر من NF و HFD. ابدأ بجمع الذباب من قنينات مكتظة أو زجاجات (لتجنب آثار تخذها). دائماً وضع حد أقصى 25 الذباب كل قنينة خلال NF و HFD التغذية لتجنب القيود الغذائية أو غيرها من الآثار الازدحام. HFD يتكون من زيت جوز الهند 30%، وبالتالي درجات الحرارة 22 درجة مئوية قد تذوب جزئيا HFD، تسبب الذباب عصا على الأغذية الدهنية ويموت. قبل وضع الذباب HFD، تنظيف قنينات لإزالة أي بقايا النفط وإدراج ورقة تصفية ﻻستيعاب أي السوائل الزائدة في الطعام. أثناء الاحتضان الذباب على HFD، تزرع قارورة على الجانبين لتوفير سطح أفقي خال من الدهون للذباب.
  2. يزن الذباب
    1. لكل التركيب الوراثي والجنس لفحصها، استخدم مقياس حساس جداً لتسجيل أوزان أنابيب مل 1.7 المسمى مسبقاً، فارغة.
    2. استخدام مخدر يطير أو CO 2، تخدير وجمع الذباب 36 من نفس النمط الوراثي، نوع الجنس، وتغذي حالة مع فرشاة واحدة قبل وزنه 1.7 مل الأنبوبة.
    3. وزن الأنبوبة المحتوية على الذباب بنفس المقياس حساسة جداً-
    4. تحديد متوسط وزن الذبابة بعد هذه الصيغة:
      Equation 1
      ملاحظة: عدد الذباب في هذا البروتوكول هو 36-
    5. فلاش تجميد أنابيب 1.7 مل تحتوي على الذباب التي تغرق في النتروجين السائل للحد الأدنى 2 جمع ووضع الأنابيب في مربعات. بعد ذلك، نقل المربعات إلى-80 درجة مئوية (درجة الحرارة الأفضل) لتخزين حتى الاستخدام مع المقايسة العلامة.
      تنبيه: النتروجين السائل في درجة حرارة منخفضة للغاية. الرجاء استخدام معدات الحماية الشخصية الملائمة.

2. العلامة بالانزيم

  1. إعداد تركيزات القياسية العلامة
    1. إعداد 500 مل PBT (PBS 1 X، 0.05% تريتون).
    2. استخدام أنابيب 0.5 مل والحل العلامة (جدول المواد)، إعداد 100 ميليلتر من فارغة (PBT فقط) و 100 ميليلتر من ستة تركيزات العلامة القياسية (2 ميكروغرام/ميليلتر؛ 1 ميكروغرام/ميليلتر؛ 0.5 ميكروغرام/ميليلتر؛ 0.25 ميكروغرام/ميليلتر؛ 0.125 ميكروغرام/ميليلتر؛ 0.0625 ميكروغرام/ميليلتر) مع PBT.
    3. وضع الأنابيب في الجليد، والمضي قدما في طحن الذباب.
  2. طحن الذباب
    1. إخراج الذباب المجمدة من-80 درجة مئوية (الخطوة 1، 3). نقل الأنابيب التي تحتوي على الذباب في مدت
    2. أولاً، مكان المعدن 2 مم طحن كرات في موزع كرة 96-جيدا، واستخدام الرسام صغيرة لإزالة كرات إضافية.
    3. لوحة
    4. مكان الطحن جيدا 96 رأسا على رأس موزع الكرة وانعكاس لنقل الكرات المعدنية مباشرة إلى لوحة طحن. يجب أن يكون هناك كرة واحدة كل بئر-
    5. ماصة متعددة القنوات، باستخدام إضافة 600 ميليلتر من PBT في كل صف من لوحة طحن 96-جيدا-
    6. مع الملقط، إضافة 3 رحلات كل بئر. تشير إلى حالة التركيب الوراثي والجنس والغذاء الذباب في كل صف/بئر لصفيحة الطحن 96-جيدا-
    7. مكان محكم قبعات على لوح طحن 96-جيدا. يمكن وضع الشريط في الأعلى التأكد من أنه لا يوجد أي تسرب.
    8. بشكل صحيح وضع لوحات طحن 96-جيدا في آلة طحن. تعيين الجهاز إلى أعلى سرعة واضغط " تشغيل " لطحن الذباب للحد الأدنى 3
    9. بعد 3 دقائق، تتوقف طحن والمضي قدما في لوحة الطرد المركزي: سينتريفوجنرال الكتريك لمدة 15 دقيقة في 4,000 س ز، 4 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، إدارة لوحة طحن بعناية لتجنب خلط المادة طافية مع بيليه.
  3. تحميل عينة وتحديد محتويات العلامة
    1. تأخذ لوحة جهاز المطياف الضوئي 96-بئر جديدة. استخدام ماصة متعددة القنوات، تحميل 200 ميليلتر من الكاشف العلامة في كل صف من اللوحة.
    2. تحميل 20 ميليلتر من PBT في البئر الأولى من الصف الأول، لإنشاء قرص فارغ. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تجنب تشكيل فقاعات.
    3. آبار
    4. حمولة 20 ميليلتر من كل تمييع القياسية (من الخطوة 2.1.2) إلى ما تبقى من الصف الأول ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تجنب تشكيل فقاعات.
    5. ماصة متعددة القنوات، باستخدام نقل 20 ميليلتر من المادة طافية من كل صف لصفيحة الطحن إلى الصف المطابق في لوحة جهاز المطياف الضوئي 96-جيدا. "الماصة؛" صعودا ونزولاً مزيج جيد. تجنب تشكيل فقاعات.
    6. بعد ذلك، ضع إحباط غاز نفاذية عبر الجزء العلوي من لوحة 96-جيدا-
    7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10
      ملاحظة: إذا كان هناك فقاعات في الآبار، الطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 2,000 ز x لإزالة جميع الفقاعات. وجود فقاعات سوف تتدخل امتصاص القراءة.
    8. القراءة امتصاص لكل بئر من اللوحة في 550 نانومتر استخدام قارئ ميكروسكوبية متوافقة. المقبل، وتتبع المنحنى القياسي وتحديد التركيز [ميكروغرام/ميليلتر] للعينات غير معروف.
    9. لتحديد كمية المحتوى العلامة الواحدة ومتوسط وزن الذبابة، استخدم الصيغة التالية:
      Equation 2
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، وقد مفروم 3 الذباب في 600 ميليلتر من PBT؛ ونتيجة لذلك، هو حجم يعني الواحد يطير 200 ميليلتر.
  4. المقايسة برادفورد والتطبيع لتمييز المحتوى مع المحتوى البروتيني
    1. إعداد سبعة 100 ميليلتر من ألبومين المصل البقري (BSA) تخفيف القياسية (75 ميكروغرام/مل؛ 100 ميكروغرام/مل؛ 150 ميكروغرام/مل 200 ميكروغرام/مل؛ 250 ميكروغرام/مل؛ 500 ميكروغرام/مل؛ 1,000 ميكروغرام/مل) مع PBT.
    2. تأخذ لوحة 96-بئر جديدة وتحميل 200 ميليلتر من 1 X برادفورد الكاشف في كل صف من اللوحة.
    3. في البئر الأولى من الصف الأول، إضافة 10 ميليلتر من PBT لإنشاء قرص فارغ. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تجنب تشكيل فقاعات.
    4. آبار
    5. إضافة 10 ميليلتر من كل تمييع القياسية في ما تبقى من الصف الأول ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تجنب تشكيل فقاعات.
    6. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 10 ميليلتر ذبابة طافية من كل صف لصفيحة الطحن في الصف المطابق في لوحة 96-جيدا. "الماصة؛" صعودا ونزولاً مزيج جيد. تجنب تشكيل فقاعات.
    7. مكان إحباط غاز نفاذية عبر الجزء العلوي من لوحة 96-جيدا-
    8. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إذا كان هناك فقاعات في الآبار، الطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 2,000 س ز لإزالتها.
      ملاحظة: وجود فقاعات سوف تتدخل امتصاص القراءة.
    9. استخدام جهاز المطياف الضوئي للقراءة امتصاص الفراغ والمعايير وعينات غير معروف ب 595 نانومتر. استخدام المنحنى القياسي لتحديد التركيزات [ميكروغرام/ميليلتر] من العينات في كل صف-
    10. تطبيع العلامة المحتوى مع مستوى البروتين باستخدام الصيغة التالية:
      Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في ميلانوجاستير د، هناك كما الحال بالنسبة للأنواع الأخرى، مظهري الجنسي بين الذكور والإناث22. من المعروف أن النساء هن أكبر، مع المزيد من الدهون في البطن بهم، من الذكور22. لاختبار فعالية البروتوكول لدينا، نحن إجراء فحوصات العلامة لتحديد الاختلافات في تمييز المحتوى بين الذكور والإناث في المختبر القياسية wildtype (w1118) الذباب. البيانات تبين أن الإناث أكثر من الدهون الجسم كله من نظرائهن من الذكور (الشكل 2أ، ب). وأظهرت البيانات أيضا أن الإنزيم مستقر، مع لا اختلاف في تقدير العلامة على مر الزمن (تصل إلى 50 دقيقة بعد الحضانة)، والاختلاف ليس تبعاً لحجم العينة البيولوجية (الذباب 3 أو 5).

لقد ثبت استهلاك HFD تسبب السمنة في الإنسان والفأر19،،من2023. لاختبار فعالية البروتوكول التغذية لدينا، نحن إجراء فحوصات العلامة مع HFD ومراقبة تغذية الذباب الإناث. ووجدنا أن استهلاك HFD في المورفولوجية يسبب زيادة محتوى الدهون التي تتراكم تدريجيا على مر الزمن (الشكل 3أ-ج). آخر على أهمية إيجاد هو أنه بعد سوى 18 ح HFD التغذية (الشكل 3ج)، كنا قادرين على الحث على زيادة كبيرة في الدهون في هذه الذباب. هذه النتائج تشير إلى أن هذا النظام النموذجي الوراثية أداة مثالية للتعجيل بإجراء أبحاث في إيجاد رواية المنظمين من السمنة التي يسببها HFD.

Figure 2
الشكل 2 . العلامة فحوصات في الذباب الذكور والإناث-
2-الأسبوع القديمة كانت تجمع الذباب على اتباع نظام غذائي عادي ومصنفة حسب نوع الجنس (الذكور والإناث) ووزنه والأرض حتى (الذباب 3 أو 5 كل بئر) لتحليل العلامة. وأجريت فحوصات العلامة وفقا للإجراءات المبينة في هذه الورقة. امتصاص كل عينة في 550 نانومتر وتليت في نقاط زمنية مختلفة (0 دقيقة، 5 دقيقة، 20 دقيقة و 50 دقيقة) لتحديد التقلبات في نهاية المطاف في علامة التحديد الكمي على مر الوقت، الدهون الاختلاف المحتوى في أحجام مختلفة من السكان (الذباب 3 و 5) من ث1118 الذباب، والفروق بين الذكور والإناث من محتويات العلامة. وأظهرت النتائج أن الإناث تتراكم الدهون أكثر من نظرائهن الذكور (Aب)، والقياسات العلامة لا تتقلب تصل إلى 50 دقيقة بعد الاحتضان رد فعل على 37 درجة مئوية (Aب). أيضا، يعني لم تتغير مستويات العلامة بين فحوصات العلامة باستخدام الذباب 3 أو 5 (Aب). وترد البيانات يعني ± sem. الإحصاءات: لا يوجد فرق كبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . آثار HFD على تراكم الدهون.
ألف-باء: الذباب الإناث 2-الأسبوع القديمة التي أثيرت بشأن عادي أو HFD لمدة 5 أيام وجمعت وأجريت فحوصات العلامة لتحديد مستويات الدهون. وكان تطبيع محتوى العلامة أما مع الوزن (أ) أو (ب) مستويات البروتين. وأظهرت البيانات أن استهلاك HFD يؤدي إلى زيادة محتوى الدهون مع كلا الأسلوبين لتطبيع العلاقات. هي جزيئي c: الذباب الإناث 2-الأسبوع القديم عادي/مراقبة الأغذية (NF) وح 18، يوم 1 أو 2 يوما في HFD لتمييز المحتوى. وتبين النتائج زيادة كبيرة ومطردة من مستويات العلامة من ح 18 إلى 2 يوما تعرض إلى HFD. وترد البيانات يعني ± sem. الإحصاءات: اختبار t الطالب. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التعريفي السمنة في الفئران يمكن أن يستغرق أشهر19،20. في الذباب، يسمح هذا HFD تغذية البروتوكول لتحريض تراكم الدهون الزائدة في غضون أيام أو أقل، مما تسبب في زيادة في تراكم الدهون إلا بعد 18 ساعة (انظر الشكل 2). HFD تغذية مع بروتوكول وصف يزيد محتوى الجلوكوز 12 ويقلل بم lipase و التعبير PGC-124. وهذا على عكس الصيام للكبار المورفولوجية الذي يتسبب في انخفاض سريع في كل من الدهون والسكر محتويات25،26 و التعبير بم زيادة24. أيضا، لرفع مستويات بم أو PGC-1 يحمي ضد السمنة التي يسببها HFD14،24. بينما 30% HFD قد استخدمت في هذا البروتوكول، تغذية الذباب مع 3% أو 7% أو 15% من الدهون حمية السمنة المستحث في تعتمد على جرعة أزياء12، كما يفعل زيادة مدة HFD التغذية (الشكل 3). كما وجدنا أن تغذية الأحماض الدهنية واحدة من المكونات الرئيسية لزيت جوز الهند، و أي، وحمض اللوريك 14% أو 5% حمض myristic، الأسباب إلى حد كبير ارتفاع تراكم الدهون12.

الاستجابة الأيضية المعجل مع هذه الذباب على نظام HFD يرتبط ب انخفاض عمر27 كما هو ملاحظ في28من الثدييات، ولكن > 80% الذباب البقاء على قيد الحياة في الماضي 20 يوما في HFD27. بالعمليات الخلوية والجزيئية يحافظ التحكم في المحتوى الدهني وساطة الاستقراء السريع لتراكم الدهون واستقلاب الجلوكوز مفيد للعديد من الدراسات المتعلقة بالسمنة، مثل السكري أو ليبوتوكسيك اعتلال عضلة القلب10، 12،،من1314،،من1516. المرجح أن تسمح الاستنتاجات الرئيسية في عواقب الاختلالات الأيضية والاختلالات المتصلة القلب الدراسات المقارنة المتعدية في البشر.

HFD تغذية بروتوكول متوافق للاستخدام مع المورفولوجية الأنواع والحشرات النماذج الأخرى التي تتقاسم حمية مماثلة مع ميلانوجاستير د. يمكن تكييف هذا HFD تغذية البروتوكولات على نحو مناسب للكائن الحي مثل C. ايليجانس أو الحشرات الأخرى التي تتطلب الغذاء 'العادية' مختلف وسائل الإعلام أيضا. 30% HFD ليست مناسبة لاستخدامها في التجارب التي تتطلب درجات حرارة عالية؛ غير أنه يمكن خفض تركيزات من زيت جوز الهند أو الأحماض الدهنية واحد البدائل الكافية12.

يستند هذا البروتوكول علامة على برنامج تلفزيوني، المخزن مؤقت غير سامة مما يتيح سهولة التعامل والتجريب دون غطاء دخان، خلافا للسابق استخدام المذيبات العضوية (الميثانول/كلوروفورم أو إثيل الاثير) في دهن الاستخراج وتقدير حجم15 , 29 , 30-وهناك ميزة أخرى لهذا المخزن المؤقت أنه يمكن تطبيع مستويات العلامة للبروتين محتوى استناداً إلى هوموجيناتي الأولى نفسها، مما يجعل تحديد الدهون في عينات الأنسجة صغيرة يمكن تحقيقها بسهولة ويوفر فرصاً جديدة لدراسة الجهاز عبر الحديث في التوازن الأيضي العضوي. أيضا، يمكن استخدام هوموجيناتي يطير الأولية نفسها التي تم الحصول عليها بعد الطحن، لإجراء فحوصات الجلوكوز والجليكوجين الموازية، مما يتيح دراسة التغيرات في استقلاب الدهون والسكر من العينات البيولوجية نفسها. هذا البروتوكول علامة أقل مشقة أو تستغرق وقتاً طويلاً من البروتوكولات السابقة15،،من2930، وهو بدلاً من ذلك عالية الإنتاجية، باستخدام شكل 96-جيدا أن يسمح للاختبار السريع لما يقرب من 100 عينة في غضون ساعة. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول التحديد الكمي لمحتوى الدهون تحت الظروف الغذائية الأخرى، بما في ذلك ارتفاع نسبة السكر في النظام الغذائي13،31وتقييد الغذائية والمجاعة، وكذلك لدراسات الشيخوخة فهم التغيرات المرتبطة بالعمر في التمثيل الغذائي للدهون.

السمنة والمتلازمة الأيضية والأمراض المتصلة بها في أعلى ارتفاع لها عواقب وخيمة على صحة الإنسان1،2. بروتوكول HFD مجتمعة والإنتاجية العالية العلامة عرض المقايسة منبرا فريداً لاستخدام نموذج الكائنات، مثل المورفولوجية، للحث على سرعة السمنة وشاشة للعوامل الوراثية، أو فهم المركبات الكيميائية الطبيعية والاصطناعية، بشكل أفضل الخلل الأيضي. وفي نهاية المطاف هذا قد تسهم إسهاما كبيرا في النهوض بالاكتشافات العلمية لتطوير علاجات جديدة أو علاجات للأمراض الأيضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر تايلور إريكا لتحرير هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من المنح التي تقدمها "المعاهد الوطنية للصحة" (P01 HL098053، P01 AG033561 و R01 HL054732) إلى سنغ، الملحق أبحاث ما بعد الدكتوراه (R01 HL085481) والزمالة (أوو) إلى S.B.D.، والمنح المقدمة من "جمعية القلب الأمريكية" إلى S.B.D. و R.T.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 - 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  2. Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
  3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
  4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
  5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
  6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
  7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
  10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
  11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
  12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
  13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
  14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
  15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
  16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
  17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
  19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
  20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
  21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
  22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
  23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
  24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
  25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
  26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
  27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
  28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
  29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
  30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
  31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

Tags

علم الوراثة، 127 قضية، والسمنة، والمتلازمة الأيضية، الفرز، علم الوراثة، الدهون، ليبوتوكسيسيتي
تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في <em>Melanogaster المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer,More

Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter