Summary
Análise cinemática da marcha no plano sagital produz informações altamente precisas sobre como o movimento é executado. Descrevemos a aplicação destas técnicas para identificar déficits da marcha de ratos submetidos a desmielinização mediada por doença auto-imune. Esses métodos também podem ser usados para caracterizar os déficits da marcha para outros modelos de rato com locomoção prejudicada.
Abstract
Análise cinemática da marcha no plano sagital frequentemente tem sido usado para caracterizar o déficit motor em esclerose múltipla (MS). Descrevemos a aplicação destas técnicas para identificar déficits da marcha em um modelo do rato do MS, conhecido como encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Défices de paralisia e motor em ratos submetidos a EAE normalmente são avaliados usando uma escala de Pontuação clínica. No entanto, esta escala produz somente dados ordinais que fornece pouca informação acerca da natureza exacta dos défices motor. Severidade da doença EAE também tenha sido avaliada por desempenho rotarod, que fornece uma medida de coordenação motora geral. Por outro lado, análise cinemática da marcha do membro posterior no plano sagital gera informações altamente precisas sobre como o movimento é prejudicado. Para executar este procedimento, marcadores reflexivos são colocados em um membro posterior para detectar movimento comum, enquanto que um rato está caminhando em uma esteira. Software de análise de movimento é usado para medir o movimento dos marcadores durante a caminhada. Parâmetros cinemáticos da marcha em seguida são derivados de dados resultantes. Mostramos como esses parâmetros da marcha podem ser usados para quantificar movimentos prejudicados das articulações do tornozelo, joelho e quadril na EAE. Estas técnicas podem ser usadas para melhor compreender os mecanismos da doença e identificar potenciais tratamentos para MS e outras doenças neurodegenerativas que afectar a mobilidade.
Introduction
Marcha é uma série de movimentos repetitivos dos membros utilizados para alcançar a locomoção. Marcha é composta por ciclos de passo, que são divididos em duas fases: a fase de postura, que é quando o pé está se movendo para trás no chão para impulsionar o corpo para a frente; e a fase de balanço, onde o pé está fora o chão e se movendo para a frente. Distúrbios da marcha são características da marca registrada de muitas doenças neurodegenerativas, tais como a lesão da medula espinhal (SCI), esclerose múltipla (em), esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Parkinson (PD) e acidente vascular cerebral; modelos pré-clínicos de roedores destes transtornos frequentemente recapitular sua marcha respectivas imparidades1. Os mecanismos de controle básico de locomoção em camundongos têm sido intensamente estudados2,3. Além disso, existem modelos de rato de muitos distúrbios neurológicos humana4. Análise de marcha em ratos é, portanto, uma abordagem atraente para medir vários aspectos dos défices de motor que tem conhecido correlações anatômicas. O estudo da marcha em modelos do rato pode fornecer insights sobre as bases neuropatológicas dos défices locomotoras em doenças neurodegenerativas e possibilitam a identificação de potenciais tratamentos.
Algumas técnicas que foram usadas para medir a marcha em roedores incluem inspeção visual (por exemplo, o Basso rato escala5 e teste de campo aberto6) e análise da marcha da ventral avião7. Mais recentemente, métodos para medir sagital cinemática dos movimentos do membro posterior ganharam popularidade, porque eles fornecem mais informações sobre a execução do movimento e, consequentemente, são mais sensíveis às mudanças sutis em marcha8, 9 , 10 , 11. cinemáticas técnicas desenvolvidas para estudar o movimento do membro posterior no plano sagital durante a caminhada em uma esteira,9,12 têm sido muito estudadas no contexto da SCI, ALS, lesões traumáticas corticais, acidente vascular cerebral, e A doença de Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Em contraste, estas técnicas têm visto o uso limitado no estudo do aparelho locomotoras défices para modelos de rato de esclerose múltipla17.
Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é o modelo do MS18rato mais comumente usados. Os dois principais métodos de induzir EAE é através de inoculação de ativa ou passiva. Em EAE ativo, os ratos são imunizados com antígenos da mielina, causando neuroinflammation de mediada por células T auto-reativas e desmielinização na medula espinhal e cerebelo. EAE passiva, por outro lado, é induzida pela transferência de células auto-reativas T de um mouse com EAE ativo para um ingênuo rato19. Conforme descrito em outro lugar, o curso da doença e neuropatologia são influenciados por antígenos do sistema nervoso central (SNC) e rato Coe20,21,22,23,24 ,25. Em experimentos EAE, controle de ratos são injetados com completa adjutor de Freund (CFA) sem o antígeno de mielina. EAE é caracterizada pela crescente paralisia que começa com fraqueza de cauda e potencialmente pode envolver os membros dianteiros, resultando em ataxia e paralisia20. Nós recentemente têm caracterizado as mudanças de marcha em camundongos C57Bl/6 sujeitados a glicoproteína de mielina oligodendrocyte 35-55 (MOG35-55)-induzido EAE. Estes estudos mostraram-se análise de marcha ser superior do que a clássica análise comportamental porque desvios do movimento normal do tornozelo são altamente correlacionados com o grau de perda de substância branca na medula espinhal lombar de EAE ratos26. Por outro lado, a força da correlação entre perda de substância branca e duas outras medidas comportamentais tradicionais (marcando clínicos e rotarod) foi muito mais fraco26.
Descrevemos aqui a utilização da análise cinemática da marcha para detectar déficits de movimento no plano sagital de ratos EAE andando em uma esteira. Cinco marcadores reflexivos foram colocados em um membro posterior para identificar o movimento de quadril, joelho e articulações do tornozelo em gravações de vídeo de alta velocidade. Software de análise de movimento foi usado para extrair dados cinemáticos sobre excursões conjuntas. A utilidade destas técnicas para quantificar os défices de movimento para o modelo de35-55 MOG da EAE são discutidos. Essas técnicas também são aplicáveis para o estudo de déficits da marcha em outros modelos de rato de doenças neurodegenerativas.
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Protocol
este protocolo está de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal e foi aprovado pelo Comitê de Universidade de Dalhousie, em animais de laboratório.
1. construir marcadores reflexivos:
- usando um furador Hand-Held, socar o número desejado de pequenos círculos de uma folha de papel reflexivo. Cada animal requer 5 marcadores para uma única gravação; dois grandes e três pequenos marcadores.
- Com uma tesoura bem, fazer um corte reto, estendendo-se desde o perímetro ao centro do círculo.
- Remover a película protectora do marcador para revelar a superfície adesiva. Usando a pinça fina, segure o marcador firmemente e enrolar--em si mesma usando o dedo para formar uma forma de cone. Para que um pequeno marcador, enrolar o cone firmemente. Para que um grande marcador, enrolar o cone vagamente.
- Usando uma pistola de cola à mão, preencher o interior do marcador em forma de cone com cola enquanto segurando a ponta do cone com fórceps e aderir o marcador de um simples pedaço de papelão. A cola irá impedir que o marcador de colapso e dobra durante a gravação para garantir ótima reflexão de luz. Quando é a cola secar (aproximadamente 10 min), remover o marcador de papelão com um bisturi ( figura 1A).
2. Preparar o Animal para a gravação
- Anesthetize o mouse com gás de isoflurano (2,5%; 2 litros/min O 2), colocando o mouse em uma câmara de indução. Quando o mouse estiver inconsciente, coloque-o em um cone de nariz posicionado em cima de uma manta de aquecimento de água de recirculação. O objetivo da anesthetization é imobilizar o mouse para a colocação do marcador; o procedimento não é doloroso. Portanto, a profundidade da anestesia não precisa ser avaliado.
- Aplicar um lubrificante tópico olho para ambos os olhos.
- Raspar o membro desejado posterior usando tosquiadeiras elétricas. Começar no tornozelo e estender a coluna vertebral e a parte inferior das costelas; Certifique-se de nenhuma pele é deixada como isto prejudicará a adesão de marcador.
Nota: Aqui, o membro posterior direito foi gravado; no entanto, que pode ser usado de qualquer membro posterior. - Usando um marcador permanente, indicar a localização da crista ilíaca e a articulação do quadril. A crista ilíaca é logo abaixo da parte inferior das costelas e é facilmente palpável, reunindo os joelhos sob o mouse ' corpo de s.
Nota: A articulação do quadril pode ser encontrada por flexionando e estendendo a perna para encontrar o ponto de articulação entre o fêmur e pelve. - Usando a pinça fina, segure a ponta afiada de um pequeno marcador e mergulhe a base de cola de adesivo de ação rápida, ou uma alternativa equivalente. Coloque o marcador na ponta do quarto dígito e segurar no lugar para 2-3 s permitir que a cola secar. Coloque os outros dois pequenos marcadores na articulação metatarsofalângica e tornozelo da mesma maneira ( figura 1B).
- Coloque marcadores grandes sobre a crista ilíaca e a articulação do quadril ( figura 1B), da mesma forma como os pequenos marcadores.
- Remover o mouse do cone do nariz e transferir imediatamente para a sala de gravação utilizando uma gaiola de transferência. Posicione o mouse na escada rolante estacionária e permitir a recuperação completa da anestesia.
3. Gravação de marcha
- antes de gravar o mouse ' marcha s, tire uma foto de um bloco de calibração com dimensões conhecidas na esteira.
Nota: Isto permitirá que os pixels do vídeo a ser convertido em medições reais. A câmera deve ser colocada a cerca de 120 cm da esteira.- Posição da câmera na mesma altura e nível, como a esteira. Manter a mesma posição da câmera para as gravações a seguir a imagem de calibração.
- Uma vez que o mouse se recuperou totalmente de anestesia, transformar a esteira de baixa velocidade (5 cm/s) para deixar o rato começar a andar. Certifique-se de que a direção de correia de esteira é tal que os marcadores do mouse estão virada para a câmera.
- Aumento da esteira velocidade gradualmente até 20 cm/s; isto é a velocidade ideal para uma marcha consistente em camundongos mais saudáveis.
Nota: Embora o ideal é ter todos os ratos andando na mesma velocidade, alguns podem ser consistentemente cheguem a esta velocidade.- Se o mouse é incapaz de andar a 20 cm/s, reduz a velocidade conforme necessário e não se esqueça de tomar nota disto. Reduzir a velocidade da esteira até passo consistente ciclos são alcançados.
Nota: Análise de dados posterior pode ajustar para diferenças de velocidades.
- Se o mouse é incapaz de andar a 20 cm/s, reduz a velocidade conforme necessário e não se esqueça de tomar nota disto. Reduzir a velocidade da esteira até passo consistente ciclos são alcançados.
- Begin, gravar o vídeo, uma vez que o mouse é andar constantemente (ou seja, andando em um ritmo consistente, não criação ou tecelagem para os lados). Continue gravando até 8 a 12 ciclos de passo consecutivos foram registrados. Para cada vídeo, registro da velocidade da esteira e do lado do mouse gravado.
- , Uma vez que a gravação estiver concluída, desligar a esteira e retornar o mouse para sua gaiola. Limpe a esteira completamente entre gravações como perfumes deixados para trás por outros ratos podem alterar o comportamento dos ratos de entrada. Para reduzir o stress e danos de pele, não remova os marcadores; permitir que os ratos para removê-los por conta própria.
4. Análise
- processar os vídeos usando o software de análise de movimento.
Nota: Em nossas experiências, usamos scripts personalizados projetados para software da imagem latente e estatístico (ver Tabela de materiais) que foram escritas pelo Dr. Nicolas Stifani. As seguintes etapas são executadas usando o software de análise de movimento selecionado.- Extrair as coordenadas de pixel dos marcadores de vídeos e usando o vídeo de calibração, transformar os valores de pixel para centímetros e calcular os ângulos articulares em cada frame.
- Identificar o início e fim de cada ciclo de passo, obtendo assim, informações sobre a etapa duração e.
- Normalizar a etapa duração de ciclo para 200 quadros normalizados, tal que o balanço e a postura são representados por 100 frames, respectivamente.
- Usando os quadros normalizados, calcular Parâmetros cinemáticos para análise de dados usando o software de planilha (ver Tabela de materiais).
- Para estabelecer o ângulo médio de uma determinada articulação, tomar a média de todos os ângulos, dentro de um quadro normalizado como:
Nota: aqui o x representa o valor do ângulo em uma dada normalizado frame e n representa o número de quadro normalizado. - Para estabelecer a amplitude de movimento de uma articulação específica para um determinado mouse, subtrair o menor ângulo entre o maior ângulo em um conjunto de quadros normalizados da seguinte forma:
Amplitude de movimento = ângulo máximo - ângulo mínimo.
Nota: Aqui o ângulo máximo e mínimo ângulo são os ângulos maiores e menores, alcançados no âmbito do ciclo de passo normalizado, respectivamente. - Para estabelecer a diferença de RMS, primeiro subtrair o ângulo médio de cada tempo experimental-ponto da gravação de base. Em seguida, quadrado cada diferença, tomar a média dos valores tudo quadrado e a raiz quadrada da média. A equação é a seguinte:
Nota: aqui
representa o ângulo médio da linha de base de gravação; y representa o ângulo médio de cada ponto de tempo experimental; n e representa o número de quadros normalizados. Raiz significa a diferença de quadrados (RMS) é uma medida utilizada para avaliar o desvio em marcha de gravações de base.
- Para estabelecer o ângulo médio de uma determinada articulação, tomar a média de todos os ângulos, dentro de um quadro normalizado como:
- Usar gráficos científicos e software de estatísticas para analisar e apresentar os dados (ver Tabela de materiais).
representa o ângulo médio da linha de base de gravação; y representa o ângulo médio de cada ponto de tempo experimental; n e representa o número de quadros normalizados. Raiz significa a diferença de quadrados (RMS) é uma medida utilizada para avaliar o desvio em marcha de gravações de base.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 é uma representação esquemática do procedimento utilizado para a análise cinemática da marcha. Primeiros, reflexivos marcadores são feitos e colocados em um mouse em 5 pontos anatômicos. Marcha é então gravada enquanto o mouse está caminhando em uma esteira. Software de análise de movimento é usado para extrair dados cinemáticos para análise posterior.
Figura 2A C representar o ciclo do passo de um rato CFA de controle para os quadril, joelho e tornozelo ângulos articulares, gravado em três sessões consecutivas de gravação espaçadas uma semana de intervalo. A sobreposição entre as formas de onda mostra desvio mínimo nos ciclos de passo das sessões 1-3. Figura 2D -F representam o ciclo de passo de um rato CFA segundo controle exibido maior variabilidade curta de 1-3 de sessões de gravação. Embora os ciclos de passo são deslocados ao longo do eixo y, a forma das formas de onda permanece consistente entre as gravações. Este nível de variabilidade é típico para rato andando.
Figura 3A C representar o ciclo do passo de um rato com EAE gravado em três sessões consecutivas de gravação. Existem alterações mínimas na marcha da primeira para a segunda sessão de gravação, mas pela terceira sessão, a marcha foi profundamente alterada nos três articulações. Para o quadril, um significativo achatamento ao longo do ciclo de passo ocorreu, indicando uma perda substancial de movimento. O joelho tornou-se peso mais flexionado e menos capaz de ampliar e apoiar o corpo do animal. Movimentos na articulação do tornozelo também substancialmente foram alterados. Flexão plantar e dorsiflexão do pé estão atrasadas durante o balanço (branca) e postura (painel verde) fases, respectivamente. Estes défices são indicativos de fraqueza muscular nesta junta como o animal é prejudicado em sua capacidade para gerar seu pé durante a fase de balanço e impulsionar o corpo para frente durante a fase de postura.
Os dados a seguir apresentados na Figura 4 foram republicados de Fiander et al . (2017) 26 com permissão. Os dados foram analisados usando unidirecionais medidas repetidas ANOVA com Holm-Sidak teste de comparações múltiplas para comparar todos os pontos de tempo, a linha de base26. A gama (Figura 4A e Figura 4), o ângulo médio de movimento (Figura 4B e Figura 4E) e diferença de RMS (Figura 4 e Figura 4F) foram calculadas em cada ponto de tempo para quantificar a marcha déficits (n = 8 por grupo). No presente experimento EAE, o aparecimento dos escores clínicos foi 14 de DPI, que é depois da segunda semana de gravação. Ratos CFA não mostrou nenhuma mudança no ângulo médio do joelho (Figura 4A) ou joelho diferença RMS (Figura 4), mas exibem um pequeno aumento na amplitude do joelho de movimento [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], em ambos os DPI 16 e 30 em relação à linha de base ( Figura 4B). Esta pequena alteração pode refletir a dor resultante da injecção de CFA. Em contraste com os animais do CFA, houve grandes mudanças no joelho comum para animais EAE para o ângulo médio [F(6,7) = 11,08, p < 0,0001] (Figura 4), amplitude de movimento [F(6,7) = 14,42, p < 0,0001] (Figura 4E) e RMS diferença (Figura 4F). O ângulo médio foi significativamente reduzido, indicando que os ratos EAE tiveram seus joelhos mais flexionados durante a caminhada. Isto pode ser indicativo de fraqueza muscular, como os animais eram incapazes de estender suas articulações de joelho para suportar o seu peso corporal. A amplitude de movimento foi também diminuiu, mais uma vez como devido a uma incapacidade dos animais para estender a articulação do joelho. O aumento significativo no joelho diferença RMS indica que os movimentos da articulação do joelho em camundongos EAE eram substancialmente diferentes de sua gravação de linha de base.
Analisaram-se os dados na Figura 5 usando unidirecionais medidas repetidas ANOVA com o Holm-Sidak teste de comparações múltiplas que comparados valores de parâmetros da marcha em escores clínicos de 0,5 - 3,5 àqueles detectados em um escore clínico de 0. Análise de busca também foi executada usando rho de Spearman (ρ). O ângulo médio do joelho (Figura 5A), amplitude de movimento (Figura 5B) e a diferença de RMS (Figura 5) foram fortemente correlacionados com resultados clínicos (p < 0.001). Essas correlações entre movimentos conjuntos e marcando clínica clássica fundamentaram a validade da análise cinemática da marcha para avaliar déficits motor para ratos EAE. Faixa de joelho de movimento (Figura 5A) e diferença de RMS (Figura 5) foram significativamente menores começando em um escore clínico de 2.0 (p< 0,05). Estes achados sugerem que os movimentos do joelho prejudicada não contribuem para o déficit motor detectado pelo clínica pontuação inferior a 2,0. No entanto, ângulo médio do joelho (Figura 5B) foi diminuído, começando em um escore clínico de 1.0 (p< 0,05). Isto sugere que, para o movimento do joelho, o ângulo médio é o mais sensível das três medidas.
Figura 1 : Esquemático para cinemática da marcha de gravação com ratos. Uma vez que os marcadores reflexivos são feitos, eles são colocados na crista ilíaca, articulação do quadril, tornozelo, articulação metatarsofalângica e a ponta do quarto dígito. Marcha é gravada por uma câmera de alta velocidade, enquanto o mouse está caminhando em uma esteira. Software de análise de movimento é usado para extrair os parâmetros da marcha para análise posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Exemplo de ondas de ciclo passo em dois ratos de controle que receberam CFA
Fundo verde e branco representa a fase de balanço e posição, respectivamente. Para mouse 1, o (A) de quadril, joelho (B) e ciclo de formas de onda de tornozelo (C) passo se sobreponham em 3 sessões de gravação consecutivos espaçadas uma semana de intervalo. Para mouse 2, o quadril (D), joelho (E) e passo de tornozelo (F) ciclo se desviar de formas de onda ligeiramente uns dos outros devido à variabilidade inerente no comportamento de andar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Formas de onda de ciclo de passo em camundongos com EAE. Fundo verde e branco representa a fase de balanço e postura, respectivamente, para três sessões consecutivas de gravação espaçadas uma semana distante. A sessão de gravação derd 3, o quadril (A), joelho (B) e tornozelo (C) forma de onda é mudou muito devido a progressão da doença EAE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Ângulo médio, amplitude de movimento e a raiz quadrada da média são usados para analisar os dados cinemáticos. Ângulo médio, amplitude de movimento e as diferenças de RMS foram calculados para quantificar o déficit motor em camundongos EAE. O ângulo do joelho média (A), a amplitude de movimento (B) e RMS (C) para ratos CFA permaneceu relativamente constante. Ratos com EAE mostraram ângulo médio prejudicada de joelho (D), amplitude de movimento (E) e RMS (F). Dados são expressos como média ± desvio-padrão; p< 0.05, * * p< 0,01, * * * p< 0.001, diferença de imunização de post do dia (DPI) -2; # p < 0.05, diferença de défice de pico. Reproduzido da referência 26 com permissão dos editores originais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Ângulo do joelho médio, amplitude de movimento e diferença de RMS correlacionar com escore clínico
Análise de correlação foi realizada entre três medidas cinemáticas dos movimentos do joelho e escores clínicos para comparar os dois métodos. A média de joelho ângulo (A), a amplitude de movimento (B) e a diferença de RMS (C) foram fortemente correlacionados com resultados clínicos. Faixa de joelho de movimento e RMS diferença diminuiu começando em um escore clínico de 2.0, enquanto a média de joelho ângulo foi reduzido mais cedo a um escore clínico de 1.0. Dados são expressos como média ± desvio-padrão; p< 0.05 diferença da clínica marcar 0,0. Para rho de Spearman (ρ), * * * p< 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em camundongos com EAE, os dois métodos mais comuns de medir o déficit motor estão marcando clínicos em cair a latência de um rotarod27,28. Estas técnicas têm várias limitações. Apesar de conveniente e amplamente utilizado, marcando clínica é limitada pela rendendo apenas ordinais dados nível, significando que a magnitude das diferenças entre os escores clínicos não são conhecidos. Clínica de Pontuação também sofre de ser incapaz de fornecer informações precisas sobre a natureza dos défices motor. O teste de rotarod melhora em algumas limitações de Pontuação clínica, mas apenas medidas de coordenação motora geral e não mede aspectos específicos de andar.
Em comparação, a análise cinemática da marcha fornece medidas sensíveis sobre aspectos específicos de locomoção, incluindo o intervalo de ângulos de movimento e média nas diversas articulações. Déficits sutis no quadril e joelho movimentos conjuntos para ratos EAE MOG35-55 foram detectados em DPI9, cerca de 5-9 dias antes do início dos sintomas clínicos ou rotarod défices26. Estes défices persistiram apesar de uma remissão completa dos sinais clínicos e foram observados na ausência de déficits de rotarod26. Importante, prejudicada a movimentos do tornozelo como medido pela diferença de RMS correlacionada extremamente bem com perda de substância branca na medula espinhal26.
Vários pontos metodológicos merecem menção específica: 1) colocação exata e consistente dos marcadores conjuntas é crucial - a articulação do quadril e a crista ilíaca devem ser cuidadosamente identificados por palpitação; 2) é necessário obter gravações de 8 a 12 ciclos de passo. Em média esses ciclos de etapa produz um ciclo de passo médio representativo que pode ainda ser analisado; 3) condições de iluminação ideal devem ser estabelecidas para assegurar que os marcadores são claramente visíveis nas gravações. Se marcadores não são iluminados corretamente, isso pode fazer a digitalização os vídeos de um processo laborioso, como muitos programas de análise de movimento será incapazes de controlar os marcadores, necessitando de controle manual.
Uma limitação adicional dessa técnica é que é trabalho intensivo. Por exemplo, para registrar e analisar dados de um grupo de 10 ratos, estimamos que o processo total leva cerca de 7.0-9.0 horas (h). Fazer 50 marcadores (5 por rato) leva cerca de 2,0 h. rato de gravação andando de comportamento pode ser feito sozinho ou em um par. Trabalhando sozinho, demora cerca de 25 min por rato, enquanto trabalham em um par leva cerca de 10 min por rato; Portanto, gravação 10 ratos pode demorar de 1,5 h (par) a 4,0 h (solo). Por último, a análise de dados e gráficos tomam aproximadamente 3,5 h. Embora esta técnica é trabalhoso, nós sentimos que o potenciais insights oferecidos pela análise cinemática da marcha de mecanismos de doença justifica este investimento. Ter boas correlações comportamentais da patologia da doença é útil como medições seriais podem ser extraídas um rato vivo não invasiva. Dada a correlação perfeita perto entre cinemática de tornozelo e lombar da medula espinhal de perda de substância branca26, este método pode ser usado para determinar o perfil temporal de desmielinização e como nos ratos EAE ao longo de uma experiência, permitindo que recuperação para ser avaliado.
Análise da marcha é complicada pela paralisia severa que restringe o movimento parte dos membros posteriores. No entanto, mesmo severamente paralítico ratos (escore clínico > 3.0) são capazes de deambular até certo ponto. Nestes casos, os membros dianteiros são usados para puxar o animal para a frente, e algum movimento de membro posterior ocorre que pode ser medido por análise cinemática da marcha. Mesmo em casos graves, é ainda possível medir a recuperação da função de membro posterior ao longo do tempo. Só em casos muito graves (20% dos animais com resultados clínicos > 3.5 na doença de pico, DPI, 16-23) foram incapazes de obter a útil gravações de movimento do membro posterior. No entanto, esses animais geralmente recuperam alguma função de membro posterior por 30 DPI, permitindo gravações significativas obtidos naquele ponto do tempo.
Uma futura aplicação desta técnica é acoplamento dados cinemáticos com gravações eletromiográficas simultâneas do membro posterior durante a locomoção. Esta técnica tem sido feita em modelos do rato de ALS e SCI e pode ser usada para elucidar a relação entre a atividade muscular, inervação e da marcha. Esta técnica também pode ser acoplada com mais visados modelos de MS e desmielinização que pode produzir mais déficits discretos da marcha, incluindo focal EAE modelos29,30 ou desmielinização induzida por cuprizone31.
As técnicas que descrevemos para a medição dos movimentos conjuntas em camundongos EAE também podem ser aplicadas a outras doenças que prejudicam a marcha. Para modelos de rato de PD, SCI, ALS e acidente vascular cerebral8,9,10,11,13,14, registaram-se mudanças distintas em marcha. Por exemplo, modelos de roedores de PD caracterizam-se por comprimento do passo reduzido e velocidade, resultando em elevada cadência manter ambulante velocidade32. Análise cinemática da marcha, portanto, fornece poderosas ferramentas comportamentais para elucidar mecanismos de doença e identificar potenciais tratamentos usando estes modelos.
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Disclosures
Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer Sid Chedrawe para sua assistência técnica com as filmagens. Este trabalho foi financiado por fundos da MS Society do Canadá (EGID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
