Summary
Experiment på fas separerade giant unilamellar blåsor (GUVs) ofta försumma fysiologisk lösning villkoren. Detta arbete presenterar metoder för att studera effekten av hög-salthalt buffert på vätska-vätska fasseparation i laddade flerkomponents GUVs som en funktion av trans-membran lösning asymmetri och temperatur.
Abstract
Fas-separerad giant unilamellar blåsor (GUVs) uppvisar samexisterar vätska-beställde och vätska-disordered domäner är ett gemensamt biofysiska verktyg att undersöka lipid flotte hypotesen. Många studier, försumma dock effekterna av fysiologisk lösning villkor. På kontot presenterar det nuvarande arbetet effekten av hög-salthalt buffert och trans-membran lösning asymmetri på vätska-vätska fasseparation i laddade GUVs vuxit från dioleylphosphatidylglycerol, ägg ceramidas och kolesterol. Effekterna studerades under isotermiska och varierande temperaturförhållanden.
Vi beskriver utrustning och experimentella strategier tillämpas för att övervaka stabiliteten i samtidiga flytande domäner i laddade blåsor symmetriska och asymmetriska hög-salthalt lösning villkor. Detta innefattar en strategi för att förbereda laddade flerkomponents GUVs i hög-salthalt buffert vid höga temperaturer. Protokollet innebär möjlighet att utföra en partiell utbyte av den externa lösningen för en enkel utspädningssteg samtidigt minimera vesikler utspädning. En alternativ metod presenteras utnyttja en mikroflödessystem enhet som möjliggör en komplett extern lösning utbyte. Lösning effekterna på fasseparation studerades även under varierande temperaturer. Därför presenterar vi grundläggande design och nyttan av en egen inbyggd temperatur kontroll kammare. Dessutom vi reflektera över bedömningen av GUV fas staten, fallgropar i samband med det och hur att kringgå dem..
Introduction
Ända sedan observationen av micron stora domäner i vätska-vätska fas-separerad giant unilamellar blåsor (GUVs) av fluorescensmikroskopi, har GUVs använts som ett modellsystem för att undersöka lipidsänkande flotte hypotes1,2 , 3 . Området i sin fristående lipidens ligger i intervallet som från biologiska celler, är de lämpliga härmar av plasma membran med hypotetisk flottar. Ett flertal studier på sådana GUVs har utförts med blåsor spridda i rent vatten, sackaros eller låg-salthalt lösningar4,5,6,7,8. Dessa förhållanden återspeglar dock inte fysiologiskt relevant exponering för biomembranes hög-salthalt miljöer och trans-membran lösning asymmetri som är förutsättningarna för celler.
I detta arbete och i en tidigare publikation från vår grupp9undersöktes fas påstår av laddade flerkomponents GUVs som en funktion av förekomsten av salt och lösning asymmetri över membranet. GUVs utarbetades av blandningar av olika nyckeltal av dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ägg ceramidas (eSM) och kolesterol (Chol) i antingen sackaroslösning (med osmolaritet 210 mOsm/kg) eller hög-salthalt buffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 mOsm/kg). Lipid valet motiverades av de uppgifter som redan erhållits på arrangera gradvisdiagrammet av denna blandning6,8.
Det finns ett antal metoder för beredning av GUVs i litteratur10,11,12 (Observera att här, kommer vi inte att överväga de som rör överföring av lipider från en oljebaserad till en vattenfas 13 , 14 på grund av den inneboende faran med de återstående oljerester i membranet vilket kan påverka beteendet fas). Utarbetandet av GUVs i hög-salthalt buffert är associerade med specifika utmaningar. Den electroformation metod15,16 presenterar för lösningar av låg jonstyrka, ett snabbt sätt att förbereda GUVs i hög avkastning med små defekter10,17. Metoden är baserad på deponerar ett lager av lipider på en ledande yta (elektroden), torka dem och återfuktande dem med en vattenlösning samtidigt som ett AC-fält. Denna metod kräver dock justeringar om salt förekommer i vattenlösning18,19. Det antas att drivkraften för vesikler tillväxt av electroformation är electroosmosis16 som hindras vid hög konduktivitet20. Electroswelling av GUVs i hög-salthalt lösningar är därför inte en okomplicerad metod eftersom det kräver optimering för olika salt koncentrationer svullnad lösningen i. Gel-assisted vesikler svullnad21,22 är en potentiella alternativ till electroformation med ännu snabbare bildandet gånger. Denna strategi bygger på förbättrad lipid film hydratisering när en gel (agaros eller polyvinylalkohol (PVA)) används som substrat. Dessa metoder, har dock risken för membran kontaminering vid agaros-baserade svullnad23 och/eller temperatur gränser som i fallet med PVA-baserade svullnad. Likaså har ett protokoll att växa GUVs på cellulosa papper substrat nyligen etablerade24. Allmänna problem med denna metod är bristen på kontroll över substrat renhet samt användning av stora mängder lipid. I detta arbete, vi införa och presentera fördelarna med den mest traditionella metoden för GUV, nämligen den spontana svullnad metoden25,26. Den består av torkning ett lipidskikt på ett lipophobic substrat, återfuktande det i vattenånga atmosfär och efterföljande svullnad i önskad svullnad lösningen (se figur 1 och detaljer i avsnittet protokoll). Denna metod erbjuder inte kontroll över fördelningen av vesikler storlek och resulterar i totalt sett mindre blåsor jämfört med metoder där produktionen biträds av elektriskt fält, polymer substrat eller mikroflödessystem innebär. Men är vesikler kvalitet och storlek lämpligt för att undersöka tillståndet membran fas som utforskas här.
Skapa asymmetri mellan lösningarna över vesikler membran är associerade med vissa utmaningar också. En vanligt förekommande metod är direkt utspädning av vesikler suspensionen i önskad extern lösning27,28. Detta minskar dock också vesikler distribution tätheten. En annan strategi är att långsamt byta den externa lösningen runt GUVs bosatte sig på botten av ett flöde-cell som möjliggör lösning i - och datorkraft. För att undvika störande eller ens förlora blåsor med flödet, är låga flöden tillämpad8, vilket gör denna metod tid-ineffektiv. Dessutom, ingen av dessa metoder garanterar fullständig extern lösning utbyte. En uppenbar lösning är att immobilisera blåsor för att undvika att förlora dem under en extern lösning utbyte. Biotinylerade GUVs kan exempelvis vara bundna till en streptividin-belagd yta29. Men denna metod kan leda till kompositionella variationer på den klibbade och därmed icke-följs membranet segment30,31. Ansökan av magnetiska eller elektriska fält att fälla blåsor resultat i införande av membran spänning32. Anställa optisk pincett att fälla en vesikel kräver att ha ett handtag fäst (dvs. en pärla), medan användning av optiska bårar kan innebära lokal uppvärmning33. Svällning av GUVs kan också åstadkommas genom att odla dem på platina ledningar utan sista avlossning34. Detta ger emellertid blåsor som inte är isolerade och som vanligtvis är anslutna till ledningar eller andra blåsor med tunn lipid rör (tjuder).
Presenterade arbetet belyser strategier för att övervinna de ovannämnda begränsningarna. Först presenterar vi en detaljerad beskrivning av den spontana svullna metod anpassad och optimerad för produktionen av GUVs i hög-salthalt buffertar. Sedan introducerar vi två metoder för att effektivt skapa asymmetriska lösning villkor av enkel spädning eller utnyttjande av en mikroflödessystem enhet. Eftersom vårt mål är analysen av membran fas delstaten GUVs i olika lösning villkor, beskriver efterföljande avsnitten kriterier för lyckad statistisk analys och aktuella tips för att undvika falska kategorisering.
Analyserna utfördes under isotermiska förhållanden samt under varierande temperaturer. Medan temperatur control används vanligen, detaljer om experimentell temperaturkontroll chambers sällan beskrivs. Här presenteras en egen inbyggd installation att iaktta GUVs vid olika temperaturförhållanden.
Protocol
1. spontana svullnad av GUVs
Obs: kloroform är ett skadligt ämne, som är mycket volatila. Utför alla åtgärder som rör kloroform under ett dragskåp. Använd inte plast labware såsom pipettspetsar eller plastbehållare för överföring eller lagring av kloroform lösningar. Kloroform upplöser plast, som förorenar lösningen. Använd glas sprutor och glas behållare i stället. Dessutom arbeta så rena som möjligt för att undvika införandet av orenheter som de kan interagera med membran. Observera att typiska lipid koncentrationer i sista GUV förberedelserna i intervallet mikromolära, således orenheter i det koncentrationsintervallet kan ha stark effekt på beteendet membran.
- Förutom den grundläggande utrustningen, har följande redo.
- Förbered en polytetrafluoretylen (PTFE, allmänt känd som Teflon) platta för lipid nedfall av storlek ~1.5 cm x 1.5 cm och lämplig tjocklek. Rugga upp plattan med fint sandpapper på ena sidan.
Obs: PTFE är lipophobic och kommer inte vara fuktad av kloroform lösningar om smidig. Båda sidor av PTFE plattan kan vara ruggas upp för att undvika förvirring om den rätta sidan för lipid nedfall. Plåttjockleken bör väljas för lätt hantering, t.ex. att det inte är alltför flexibelt och kan enkelt täckas av återfuktning lösningen (se figur 1). Här använde vi plattor ~ 2 mm tjocklek. När ruggas upp, PTFE plattan kan återanvändas för nya experiment efter ordentlig rengöring (steg 1.3). - Förbereda en förslutningsbar glasflaska lämplig volym (~ 15 mL) för den slutliga lipid film återfuktning och vesikler tillväxten.
- Förbereda en förslutningsbar glasflaska som de ~ 15 mL injektionsflaskan av glas passar, det kommer att användas för att skapa en vattenmättad atmosfär för lipid film före svullnad, se figur 1.
- Förbered en polytetrafluoretylen (PTFE, allmänt känd som Teflon) platta för lipid nedfall av storlek ~1.5 cm x 1.5 cm och lämplig tjocklek. Rugga upp plattan med fint sandpapper på ena sidan.
- Förbereda 4 mM lipid bestånd i önskad förhållandet mellan 1,2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - phospho-(1 ' - rac - glycerol) (natriumsalt) (DOPG), ägg ceramidas (eSM) och kolesterol (Chol), med ytterligare 0,1 mol % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiIC 18) till en total lipid koncentration på 4 mM. Använda kloroform som lösningsmedel. Se tabell över material.
- Skölj PTFE plattan och glasbehållare med kommersiella diskmedel, etanol och kloroform i den sekvensen och slutligen torka dem.
- Använder en spruta av glas, insättning och jämnt fördelade 10-15 µL av lipid lager på ruggas upp sidan av PTFE plattan att skapa en enhetlig lipid-film. Använda sprutans nål för att sprida lösningen om det behövs.
- Placera PTFE plattan på en ren yta och ut det tillsammans med insatta lipid filmen för 2 h vid 60 ° C att ta bort kloroform. För enkelhetens skull sätter in plattan i behållaren rengöras och oförseglade 15 mL glas under uttorkning.
Obs: Den höga temperaturen säkerställer att lipid filmen är i en homogen singel-flytande tillstånd i detta och alla efterföljande steg. - Efter torkning, Fyll glasbehållaren före svullnad med avjoniserat vatten upp till en nivå som inte tillåter flytkraft att slå över de ~ 15 mL injektionsflaskan av glas (~ 1 cm), se figur 1.
- Put glasets ~ 15 mL injektionsflaska med PTFE plattan in i behållaren och täcker det så att en vattenmättad atmosfär kan uppstå, se figur 1B.
Obs: Kondenserat vatten på inre behållare väggarna ger en bra indikation för framgångsrika vattenånga mättnad. - Låt deponerade lipid filmen före sväller inuti glasbehållaren stängd vid 60 ° C i 4 h. Inom denna tidsperiod förbereda önskad svullnad lösningen.
Obs: För vesikler preparat som kan utföras vid lägre temperatur, denna tid kan extremt förkortas - ner till ett par minuter - om varma vattenmättad kväve eller argon används för före svullnad istället.- Förbereda 200 mM sackaros eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 justerade med HCl och Värm till 60 ° C för att göra svullnad lösningen.
- Efter före svullnad, ta ~ 15 mL glas med PTFE plattan ur behållaren. Med en spruta som är ansluten till ett 0,45 µm filter, lägga till ~ 5 mL av svullnad lösningen i injektionsflaskan 15 mL glas att återfukta lipid filmen.
Obs: Fastställande en nål till filtret underlättar införandet av svullnad lösningen. Före uppvärmningen sprutan och filter kan vara tillrådligt att säkerställa en enda-flytande fas tillstånd av lipid filmen samtidigt lägga svullnad lösningen. Filtrera lösningen minimerar (i-) organiska föroreningar av bakterier eller salt fällning etc. - försegla de ~ 15 mL injektionsflaska av glas som hålla hydratiserade lipid filmen på PTFE plattan att minimera avdunstning. Om det behövs kan du använda paraffin filma för att förbättra försegla. Lämna hydrerad lipid filmen vid 60 ° C över natten för slutliga GUV svullnad.
2. Skörd GUVs
Obs: aggregering av GUVs svullna och fristående från PTFE substrat resulterar i en liten (~ 1 mm) molnliknande dunge synliga vid ögat. Det visas vitaktig när ingen fluorescens färg används. Annars är det färgade enligt fluorophore absorptionsspektrum. Tillägg av DiIC 18 gör molnet rosa (se figur 2). Blåsor är koncentrerade i aggregatet och skörd det maximerar avkastning vesicle.
- Cool ner blåsor rumstemperatur inom ~ 1 h. Cut ~1/10 spetsiga ände en kolv pipettspetsen plast för klustret eller aggregat av blåsor att passa genom öppningen.
Obs: Kylningshastigheten är särskilt viktigt om fast-flytande fasseparation förväntas eftersom det förändrar storleken på solid domäner. Här, för att bromsa kyla, vi placeras provet i kontakt med en metall block storlek 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x B) som svalnat till rumstemperatur inom 1 h. - Pipett upp klustret tillsammans med en lämplig volym av svullnad lösning (se figur 2). Återsuspendering aggregat i svullnad lösningen att skapa symmetriska lösning villkor, eller någon önskad isoosmotisk lösning att skapa asymmetriska lösning villkor.
Obs: Den nedre gränsen för volymen är begränsat av storleken på sammanlagt skördas helt. Den externa lösningen späds ut och för att bedöma den exakta koncentrationen, volymen av vesikler lösningen måste hänsyn tas till.
3. Observation av GUVs för fas staten bedömning använder fluorescensmikroskopi
Obs: The GUVs var dopade med DiIC 18 som fluorescerande markör. Detta fluorophore partitioner prioriterat in i vätskan sömnrelaterade andningsstörningar (Ld) fas. Detta möjliggör fluorescence mikroskopi observationen av domäner som följd fasseparation i GUVs. Vi utfört bedömningen fas statligt med epi-fluorescensmikroskopi. I princip är dessa iakttagelser också genomförbara använder confocal laserscanning mikroskopi (CLSM), vilket också möjliggör signal kvantifiering (t.ex. att bestämma membran unilamellarity). Dock CLSM kräver mer avancerad utrustning och (oftast) påljusfluorescens observationer före skanning är bra i alla fall.
- Besluta om ett mål (t.ex. 40 X förstoring med en 0.6 numeriska bländaröppningen (NA) som används här) att observera GUVs och använda den konsekvent när man jämför fas påstår av samma sammansättning i olika våra produktern villkor. Använda lämpliga excitation och utsläpp våglängd filter för att aktivera fluorescens observationer med fluorophore används (t.ex. magnetisering på 560 ± 40 nm och 630 ± 75 nm med en 585 nm stråldelare däremellan som används för DiIC 18).
Obs: Fas statsgränserna inom en arrangera gradvisdiagrammet beror på den resolution som målet uppnår eftersom det definierar minimal storlek mikro-domäner för att upptäckas. - För analys, bara välja GUVs som fullgör följande kvalitetskriterier.
- Säkra unilamellarity av GUV membranet genom visuell observation av olika blåsor och jämföra deras stödnivåer; blåsor med lägsta utsläpp fluorescensintensiteten är mest sannolikt unilamellar.
Obs: Spontan svullnad kan ge vesikler partier där en stor del av gigantiska blåsor inte är unilamellar. - Utföra en ytterligare kontroll av kvantifiera utsläpp fluorescensintensiteten hos förment unilamellar gigantiska blåsor och kontrollera motsvarande signalen för spridning inom befolkningen. Om inga heltal skillnader bland olika GUVs observeras, alla av dem är sannolikt unilamellar.
Obs: Om blåsor är beredda från konventionella lipider med hjälp av en etablerad metod som spontana svullnad, den strategi som beskrivs ovan för detektion av unilamellar blåsor är tillräcklig. Om att upprätta ett nytt GUV förberedelse protokoll eller använda okonventionella lipider, mer detaljerade studier kommer att behöva bekräfta unilamellarity. Exempelvis kunde membran fluorescens signaler märkta blåsor utarbetat ett nytt protokoll jämföras med de av GUVs som utarbetats av en etablerad metod; eller den membran porstorlek proteinet α-hemolysin kan infogas i vesikler membran 24. Dye lagt till på utsidan av blåsor skulle ange deras interiör eller inte, beroende på förekomst av uni- eller multilamellar blåsor, respektive. - Se till att GUV har en rimlig minsta diameter för domäner fortfarande vara igenkännlig.
- Se till att GUV har (nästan) inga defekter såsom utskjutande eller fastsatta delar eller interna strukturer.
- Säkra unilamellarity av GUV membranet genom visuell observation av olika blåsor och jämföra deras stödnivåer; blåsor med lägsta utsläpp fluorescensintensiteten är mest sannolikt unilamellar.
- Överför en alikvot av GUV suspension på ett objektglas och försegla det ordentligt. Förbereda en observation kammare.
- Insättning provet på objektglas. Omge den av distanshylsa silikon med en central cirkulär utklipp. För att undvika kontaminering, säkerställa att distansen inte är i kontakt med provet. Tätning inre genom att placera ett täckglas ovanpå silikon mellanlägget.
Obs: Istället för silikon spacer en kan använda silikonfett eller hemmagjord polydimethysiloxane (PDMS) distanser. Försegla kammaren säkerställer minsta avdunstning av provet och upprätthåller iso-osmolaritetssystem villkor. - Lämna prov för ~ 5 min för förnyad Jämviktstiden möjligt domäner.
Obs: Mekanisk stress från pipettering kan blanda membran domänerna, som behöver tid att reformen. - Placera objektglas med provet på Mikroskop scenen och analysera fas delstaten GUV partiet i en statistisk metod. Observera mer än 30 GUVs per parti och bestämma deras fas tillstånd enligt följande kriterier för bedömningen GUV fas statligt med DiIC 18 ( figur 3).
Obs: Efter deras tillväxt, blåsor kan ändra sina enskilda kompositioner på grund av (till exempel) domän spirande eller utbyte av membran material via nanorör. GUVs uppvisar därför kompositionella variationer inom samma batch 35.- Single-flytande fas som antingen vätska-beställt (Lo) eller flytande sömnrelaterade andningsstörningar (Ld): se till att den övergripande GUV-formen är sfäriska och slät och DiIC 18 fördelas homogent i membranet (första bilder i övre och nedre panelerna i < stark klass = ”xfig” > figur 3).
- Två faser Lo + Ld samexistens stat: se till att blåsor uppvisar domäner som visas cirkulär med smidig gränser; enligt DiIC 18 partitionering beteende domäner är klarröd (Ld) eller mörk röd/svart (Lo) (andra bilder i övre och bottenpaneler i figur 3, falska färg). Kontrollera att domäner är fria att sprida på vesikler ytan och kan sammanfalla.
- Två faser solid (S) + (S + Lo eller S + Ld) samexistens vätskeform: säkerställa att domänerna kan förefalla finger-liknande eller trint men med kantiga gränser (tredje bilder i övre och nedre panelerna i figur 3). Iaktta flytande domäner (röd) på solid (svart) bakgrund som inte visas diffusion. Tvärtom, solid (svart) domäner kommer att vara fria att sprida på en flytande bakgrund (röd).
- Trefas S + Lo + Ld samexistens: Observera tre typer av domäner som förekommer: (i) kantiga svart domäner (S), inbäddad i (ii) dim (Lo) och (iii) ljusa (Ld) röda domäner.
- Tillskriver fas staten som har fastställts vara dominerande bland ett stickprov, som i följande exempel befolkningen i GUVs:
- om 20 singel-flytande GUVs och 15 Lo + Ld GUVs observeras, anser partiet vara en singel-flytande fas.
- Om 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs och 25 single-flytande GUVs observeras, anser partiet vara ett Lo + Ld.
4. GUV Observation i ultrakalla enhet
Obs: först fabricera enhetens mikrofabricerade; information om mikroflödessystem enheten design och montering har fått någon annanstans 36 , 37. Se figur 4 för en kort beskrivning.
- Förbereda färska GUV svullnad lösning (salt eller sackaros enligt steg 1.8.1) och filtrera den genom ett 0,45 µm filter.
Obs: Alla orenheter i flödande lösningar kan täppa mikroflödessystem enheten. - Skär 200 µL kolv Pipettera plast tips och placera dem i hålen i PDMS delen av enheten. Tillsätt 100 µL och 5 µL av frisk och filtrerad svullnad lösning till reservoaren (se figur 5A) och varje snittet Pipettera tips, respektive. Centrifugera hela enheten på 900 x g i 10 min i en gunga rotor centrifug pre fylla enheten och ta bort luft.
- Före Fyll 1 mL glassprutan och Fäst slangen med svullnad lösningen och flytta kolven till 0 mL.
- Placera slangen i fluidic uttaget av enheten och placera sprutan i sprutpumpen.
Obs: Valet av sprutan och spruta pump varumärke är inte viktigt. Men glas sprutor är mer precisa och pumpen bör kunna fungera i intervallet µL/min flöde. - Anslut en anpassad trycket styrenhet till 8 öppningarna i kontrollen mikroflödessystem lager (se figur 5A). Ställ in trycket till trycket styrenheten till 3 bar (luft, kväve eller argon), men ställa ventilerna till mikroflödessystem enheten till stängt läge.
- Placera mikroflödessystem enheten, nu ansluten till sprutan pump och tryck control unit, på en inverterad confocal Mikroskop scenen.
- Användning ett mål med samma förstoring och NA som under bulk observationerna. Kontrollera om fas statliga statistiken som förklaras i steg 3,7 förblir densamma om ett annat mål för att undvika observation artefakter som är baserade på olika resolutioner.
- Ladda GUVs till enheten.
- Första, pipett bort alla utom 25 till 50 µL av den lösning som har stannat kvar i behållaren. Tillsätt 150 µL av GUV lösningen (sackaros eller salt enligt steg 1.8.1, men på den lösning används för att fylla före enheten i steg 4.1) till reservoaren och mix av mild pipettering. Ställ in sprutan till 10 µL/min flöde i återkalla läge för cirka 20 min eller tills mer än 90% av fölen upptas.
Obs: Behållaren bör inte tillåtas att köras torr. Om detta händer kommer luftbubblor in i mikro-kanaler. Lägga till fler GUV lösning till reservoir under lastning men ta hand inte för att införa luftbubblor när pipett till enheten.
- Första, pipett bort alla utom 25 till 50 µL av den lösning som har stannat kvar i behållaren. Tillsätt 150 µL av GUV lösningen (sackaros eller salt enligt steg 1.8.1, men på den lösning används för att fylla före enheten i steg 4.1) till reservoaren och mix av mild pipettering. Ställ in sprutan till 10 µL/min flöde i återkalla läge för cirka 20 min eller tills mer än 90% av fölen upptas.
- Öppna alla de tryckreglerventiler enhet att stänga mikroflödessystem ring-ventilerna runt de fällor/GUVs. Ställ in sprutpumpen på 0 µL/min. Efter 1 h, Observera GUVs och spela in confocal bilder. Excite och upptäcka GUVs enligt fluorophore används (t.ex. magnetisering på 561 nm och upptäckt mellan 580-620 nm när det gäller DiIC 18). Använd samma urvalskriterier från steg 3.6 , och var noga med för att anteckna platsen för varje chef (dvs. kolumnen och rad nummer, se figur 4)
- utbyta lösningen kring GUVs .
- Ställ sprutpumpen-0 µL/min och Pipettera bort alla men 25 till 50 µL av GUV lösningen från reservoaren. Lägga till 150 µL av 2nd lösningen (i antingen sackaros eller salt enligt steg 1.8.1, beroende på den önska lösningen utanför GUVs) i reservoaren och mix av mild pipettering. Pipettera bort alla men 25 till 50 µL av buffertlösningen från reservoaren.
Obs: Denna lösning måste filtreras med ett 0,45 µm filter alltför.
- Ställ sprutpumpen-0 µL/min och Pipettera bort alla men 25 till 50 µL av GUV lösningen från reservoaren. Lägga till 150 µL av 2nd lösningen (i antingen sackaros eller salt enligt steg 1.8.1, beroende på den önska lösningen utanför GUVs) i reservoaren och mix av mild pipettering. Pipettera bort alla men 25 till 50 µL av buffertlösningen från reservoaren.
- Upprepa föregående steg minst 5 gånger att grundligt ersätta lösningen i behållaren. Ställa in sprutan till 10 µL/min flöde i återkalla läget för ~ 10 min att byta ut lösningen i mikro-kanalerna.
- Minska flödet till 1 µL/min. öppna de 8 enhet tryckreglerventiler för 2 s och Stäng igen (resulterar i öppning och stängning av mikrofabricerade ring ventiler). Ställa in flödet till 0 µL/min igen.
- Efter 1 h, Observera GUVs och spela in confocal bilder. Igen, var noga med för att notera den kolumn och rad i mikro-kammaren där varje GUV ligger kunna göra jämförelser av samma GUV före och efter externa buffert exchange.
5. Design och kalibrering av temperaturkontroll kammaren
Obs: en lämplig kammare för temperaturkontroll kan vara antingen erhållits kommersiellt eller hembyggda. Temperaturreglering sker oftast genom termisk koppling av kammaren med GUV provet med ett vattenbad eller en Peltier-elementet. Här, beskriver vi design och karakterisering av en hembyggda temperaturkontroll kammare med en yttre vatten termostat. Dessa termostater är tillgängliga i många laboratorier eller kan räddas från gamla utrustning såsom laser eller spektrometrar.
- Montera en värmeflöde kammare, här, gjorde av aluminiumblock, med kopplingar till ett vattenbad som visas i figur 6. Täta öppningarna på toppen och botten och aktivera ljusa fält observation av provet genom limning locket glasögon till blocket.
- Flip flöde kammaren på den sidan där provet kommer att placeras och överför med pipett en droppe av cirka 100 µL av den lösning som används i experiment enligt steg 1.8.1. Du kan också infoga en fiber optic temperatursond (e.g. FISO FTI-10) eller Lägg till en temperatur-känslig färgämne i en lämplig koncentration, e.g. 500 µM rodamin B.
- Montera GUV observation kammaren använder silikonfett deponeras i ringform eller några andra mellanlägg (PTFE eller gummi) och försegla det med en 0.17 µm skyddsglaset. Säkerställa att minskningen inte är i kontakt med tätningsmedel eller distansen för att undvika införandet av orenheter.
- Långsamt vänd enheten upp och ned och Anslut extern vatten termostaten med lämplig slang till den. Särskilt uppmärksamma eventuella vattenläckor.
- Set den lägsta önskad temperatur på externa vatten termostaten och låt systemet jämvikta tills behandlingen av temperaturgivaren är stabil, den tid som behövs för Jämviktstiden kommer att ge en uppskattning av systemet minimal responstid.
- Utföra kontroll experiment minst en gång innan du börjar använda kammaren.
- Mät lösningen temperaturen (t.ex. med en glas fiber sond) och jämför det med läsningen av termostaten över temperaturområdet sevärdheter.
- Kontrollera för en minimal förskjutning från termostat läsning och Linjäriteten hos de uppmätta temperaturerna.
- Kontrollera om en temperaturgradient inne i observation kammaren med en temperatur känslig färgämne. Mät temperaturen lösning via fluorescensintensiteten eller fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM) för olika avstånd från botten täckglas 40. Dessutom kontrollera om det finns någon temperaturgradient i regionen av GUV observation, som visas i figur 7.
6. GUV observationer vid varierande temperaturer
Obs: typiskt, för GUVs vars membran potentiellt fas-avskilj och som verkar vara homogen vid observation temperatur T obs, fasseparation kommer att inducerad nedan T obs (om som observeras beror på det temperaturområde som undersökt). Tvärtom, fas separerade blåsor ska bli homogen vid en temperatur som är högre än T obs. Men detta behöver inte vara fallet för en viss (komplexa) lipid sammansättning och det kan vara intressant att alltid skanna hela tillgängliga temperatur intervall 38. Protokollet för observation och utvärdering av fas övergången temperaturer förlitar sig inte på den specifika metod som används för temperaturkontroll.
- Montera temperatur observation kammaren enligt avsnitt 5, utelämna den fiber optic temperatur sonden eller temperaturkänsliga fluorophore.
- Ställ in externa vattenbadet rumstemperatur (23 ° C) och låt systemet jämvikta för 10-15 min.
- Räkna antalet fas separerade blåsor med kriterier från steg 3.6; den totala fasen som delstaten GUV befolkningen kommer att ge en antydan om regionen av övergångstemperaturen av systemet. Gå direkt till steg 6,5 om tillståndet fas i vesikler befolkningen är ganska heterogen.
- Öka (om majoriteten av blåsor är fas-separerad) eller minska (om majoriteten av blåsor är homogen) temperaturen i grova intervall (t.ex. 1-2 ° C) och låt systemet jämvikta för ca 2 min. omvärdera fas delstaten GUV befolkningen av medel för ett slumpmässigt prov och variera temperaturen tills vesikler befolkningen visar en heterogen fas stat.
- När befolkningen är nära peka av fasövergång (dvs fasen anges bland enskilda GUVs är ganska heterogen), minska temperatur intervallet (t.ex. 0,5 ° C) för att öka upplösningen. Låt systemet jämvikta för ~ 2 min och omvärdera fas delstaten GUV befolkningen med hjälp av ett slumpmässigt urval.
- När punkten av fasövergång är passerat, hålla varierande temperaturen tills alla GUVs är nu homogen eller fas separerade, respectively.
- Kontrollera för hysteres att utvärdera om tidens Jämviktstiden är tillräckliga.
- Ändra riktningen av temperaturen scan, jag.e. om genomsökningen gjordes för att öka temperaturen, göra sökningen genom att minska temperaturen.
- Välja minst en delmängd av temperaturer att bedöma GUV befolkningen fas statligt förhållande (t.ex. 80% fas-separerad).
- Om betydande avvikelser mellan båda riktningarna i fas statligt förhållande indikerar hysteres, minska temperaturen stegstorlek och/eller öka Jämviktstiden tiden i steg 6.4 och 6.5.
- Om det finns ingen hysteres som anges av lika nyckeltal, överväga att öka steg storlek eller Jämviktstiden tiden.
- Rita fas statliga nyckeltalen mot temperaturen. För kvantifiering, passar data till en lämplig modell ( figur 8).
Obs: Fas övergången kurvor har vanligen en sigmoidal bollbana och sigmoidal Boltzmann modellen ger en lämplig uppsättning passande parametrar:
y: bråkdel av uniform/fas-separerad GUVs
en 1: den första bråktal
en 2: den slutliga bråktal
T: temperatur
T blanda: temperatur på halv maximal y
Y är fraktionen av homogen GUVs, bör A 1 och A 2 fastställas till 0 och 1, respektive. Som blandbarhet antas övergången vara sigmoidal, när bråkdel värdet mäts för att vara 0 vid en viss temperatur alla bråkdel värden i temperaturintervallet nedan anses vara 0. Tvärtom, när bråkdel värdet är 1 vid en viss temperatur, alla bråk värden i temperaturintervallet ovan antas vara 1.
Representative Results
GUV svullnad
Spontan svullnad synsätt beskrivs här GUVs består av DOPG, eSM, och Chol odlades över natten i 210 mM sackaros eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 bildar en synlig samlade. Skörda sammanlagt säkerställer hög vesikler avkastning. Resuspension i svullnad lösningen resulterat i symmetriska trans-membran lösning villkor. För att skapa asymmetriska villkor, sammanlagt var resuspended i en iso-osmolaritetssystem sackaros eller hög-salthalt lösning, respektive (figur 2). Resulterande utspädning motsvarar en kvasi extern lösning utbyte samtidigt minimera utspädning av antalet GUVs.
Arrangera gradvis diagrammet kartläggning av GUVs med fluorescensmikroskopi
Närvaro av 0.1 mol % av fas-specifik DiIC18 i GUVs tillåtet för observationen av deras fas stater via wide-fältet fluorescensmikroskopi. Blåsor som uppvisar S + L fasseparation observerades genom en 63 x / 1.2NA för att kunna lösa fint strukturerat finger-liknande domäner. För alla återstående fall, en 40 x / 0.6 NA mål användes. För att undvika artefakter under visuell inspektion av GUVs och maximera reproducerbarhet, vissa kriterier sattes som bestäms som blåsor att överväga för fas staten analys (protokoll steg 3.6).
GUVs beredd från ternära DOPG/eSM/Chol blandningar av ett brett urval av nyckeltal svullna i sackaros eller hög-salthalt lösning och observerade vid rumstemperatur uppvisade homogen Lo eller Ld faser, Lo + Ld och S + L fasseparation, se figur 3. Figur 9 visar exemplarily defekta blåsor, som inte bör ingå i dataanalysen och visar också hur man identifierar multilamellar blåsor.
På grund av deras okända historia sannolikt GUVs uppvisar inom-batch kompositionella variation35. Därför fastställdes övergripande fas delstaten en viss sammansättning i en statistisk metod. GUV populationer av en viss lipid sammansättning var tillskrivs fas staten som observerades för att vara dominerande i ett slumpmässigt urval (protokoll steg 3.6). Ändå gav kompositioner nära regionen Lo + Ld samexistens ofta partier där dominerande fas staten gjorde upp en snäv majoritet. För sådana vaga fall upprepades okulärbesiktningen med minst tre oberoende prover. Fraktionen av blåsor med identiska fas tillstånd (t.ex. utställande Lo + Ld fasseparation) inom de slumpmässiga proverna var i genomsnitt över antal prövningar som togs som slutresultatet (figur 10).
De beskrivna protokoll resulterade i tillräcklig GUV tillväxt över ett brett spektrum av olika nyckeltal DOPG, eSM och Chol i hög-salthalt och sackaros lösningar. Omfattande regioner inom ternära arrangera gradvisdiagrammet kunde mappas symmetrisk samt asymmetrisk hög-salthalt lösning villkor (figur 11). Skillnaderna i vesikler fas beteende observerats under olika lösning förhållanden diskuterades någon annanstans i detalj9.
Observationer av fas beteende efter komplett buffert utbyte med metoden mikrofabricerade
Att skapa asymmetriska lösning villkor genom utspädning resulterar i rester av svullnad lösningen utanför. Vårt mikroflödessystem tillvägagångssätt möjliggör en komplett extern lösning utbyte. Figur 5A visar mikroflödessystem enheten är färdigmonterade på confocal Mikroskop scenen tillsammans med fluidic utlopp och tryck kontroll vikar. Rören är anslutna via 90 ° metallrör att ge utrymme för överförs ljus imaging från ovan.
För observation inom mikroflödessystem enheten, en confocal Mikroskop med en 63 x / 1.2NA vatten nedsänkning objektiv genomfördes. Som med tidigare iakttagelser i bulk, användes DiIC18 för att färga membranet. När du gör observationer av fasen delstaten GUVs fångade i enheten, måste vara försiktig att inte misstolka data. På grund av närheten av GUVs till inlägg blockeras excitation och utsläpp lätta stigar delvis av den PDMS leder till falska utseendet på domäner (figur 12). Här är överförs lätt detektion användbart att kontrollera positionen för GUVs på inlägg. Denna oönskade effekt är särskilt framträdande för små GUVs på mindre än 10 µm i diameter. I dessa fall avvisades data. Confocal bilden i figur 13A visar ett planar vesikler avsnitt som korsar en Lo-domän som är närvarande på den GUV vesikler. I det här fallet skulle plana tvärsnitt skanningar ytterligare ovanför eller nedanför avsnittet har inte visade den domän på grund av sin ringa storlek jämfört som av GUV, vilket är varför det skulle ha missats och vesikler anses vara i en homogen fas stat. En confocal z-stack bör därför användas för att inspektera hela GUV ytan. För wide-fältet mikroskopi kanske detta inte ett problem eftersom den hela vesikler kan avbildas på en gång.
Slutligen, exempel ges på GUVs före och efter utbytet av yttre lösningen där det framgår vad fasen staterna membranen är (figur 14). Varje enhet har 60 chambers (vardera med ett par inlägg att fälla en enda chef), vilket gör att tiotals experiment per enhet (se figur 4). Dock kan vissa GUVs vilse under extern lösning utbytet. Detta kan minimeras genom följande steg: 1) med bovint serumalbumin (BSA) beläggning för att förhindra GUV vidhäftning/bristning på inlägg; beläggning görs genom att exponera kammaren väggarna till 20 mg/mL BSA för 60 min och efterföljande sköljning med arbetande bufferten. En annan självhäftande molekyl som kan användas är poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)39. (2) noggrann osmotisk matchning av de inre och yttre lösningarna att undvika slapp GUVs, som kunde passera genom centrum av inlägg eller bristningen av GUVs. (3) optimera GUV förberedelser proceduren för att få blåsor som är större än ~ 8 µm i diameter för att hindra passage genom centrum av inlägg.
Design och karakterisering av temperaturreglerade kammare för observation av GUV fas stater
Vi utformade ett enkelt flöde kammare, som har anslutningar till externa vatten termostaten (figur 6). Vi fick denkammare av fräsning av aluminiumblock. Kammaren materialet behöver i allmänhet inte vara värme ledande, eftersom provet är kopplat till vattenbadet på nedre luckan glas som visas i figur 6B och 6 C.
Oberoende av den exakta utformningen, bör utförandet av kammaren utvärderas. Vi kollade specifikt för linearitet provtemperaturen med externt-set temperaturen, någon systematisk temperaturkompensationen och en temperaturgradient i kammaren. De två första punkterna togs upp av direkt temperaturmätning i kammaren av en fiber optic temperatursond (e.g. FISO FTI-10). Vi kollade också för en temperaturgradient inom GUV suspensionen. Sådan en övertoning kunde hejda från värmeflöde till utsidan av kammaren. Rumsligt löst temperaturmätningar kan erhållas genom en temperatur känslig fluorophore40, se figur 7.
Data plottning och passande att erhålla Tblanda av fas-separerad GUVs
Plottning fraktionen av homogen GUVs över den observerade temperaturområden resulterade i en sigmoidally formad data punkt bana. Vi passar data till Boltzmann modellen (avsnitt 6.8 protocol) från vilket de Tblandat kunde härledas ()figur 8).
Figur 1: Experimental steg under spontana svullnad protokollet (övre panelen) med motsvarande steg av vesikler tillväxt (nedre panel). (A) A homogen lipid film sprids på PTFE plåt ruggas upp och torkade från eventuella lösningsmedel. (B), den torkade lipid film är sedan före svullen i en vattenmättad atmosfär inuti en sluten behållare med vatten för att underlätta lipidens återfuktningen. Void glasflaskan innehåller PTFE plattan och förblir öppen under återfuktning steg. (C), den pre-svullna lipid film blir äntligen fullt hydrerad genom tillsats av önskad svullnad lösningen på lipid-belagd PTFE plattan släpper glasflaskan. För att undvika avdunstning, försluts glasflaskan ordentligt under natten ruvning. För att minimera kompositionella variationer inom en batch, måste alla steg utföras vid en temperatur där lipid blandningen är fullt blandbar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: GUV skörd. (A) A deponeras lipid film bestående av DOPG/eSM/Chol på molar förhållandet mellan 20/60/20 med 0.1 mol % DiIC18 var svullen i hög-salthalt buffert består av 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. Locket på glasbehållaren var dessutom förseglad med paraffin film. Förstorade området av intresse innehåller den resulterande GUV-aggregatet. Dess röda utseende är en följd av förekomsten av DiIC18. (B) The GUVs skördades med en stympad pipettspetsen. I denna bild, var sammanlagt pipetteras upp tillsammans med 50 µL av svullnad lösning, som överfördes till en ny injektionsflaska. (C) för att skapa asymmetriska trans-membran lösning förutsättningar, sammanlagt var utspädd i en annan isoton extern lösning. Här, sammanlagt tillsammans med 50 µL svullnad lösning var resuspended i 950 µL sackaroslösning vilket resulterar i en 20 x spädning av svullnad lösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: GUV imaging. Brett fält fluorescens bilder av GUVs dopade med 0.1 mol % DiIC18 beredd och observerade i symmetriska salt eller sackaros lösningar bestående av olika nyckeltal DOPG, eSM och Chol (i salt buffert, från vänster till höger: 40/20/40, 50/20/30; 30/60/10; i sackaros, från vänster till höger: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Bilderna visar GUVs i olika (samtidiga) fas bedömas enligt kriterierna i protokollet steg 3.6. Här, blåsor var avbildade genom en 40 X / 0.6 NA mål. Skala barer = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Layout av mikrofabricerade kanal design. GUVs in det nedre fluidic lagret (konturerad kanaler) via inloppet nedanför en reservoar. Ett filter blockerar oönskat skräp från enheten. De anger sedan en rad 60 chambers (8 rader och 15 kolumner) varje innehållande inlägg för enda GUV capture (se Infoga). Varje kammare kan isoleras inom en ring ventil aktiveras av en kontroll lager (fyllda svarta kanaler) ovanför fluidic lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mikroflödessystem enhet. (A) fotografi av en mikroflödessystem enhet används för att fälla enstaka GUVs och helt byta yttre lösningen. Etiketter anger reservoaren att lägga till lösningar (1), 8 x tryck inlopp ansluten till den tryck kontroll enheten (2) och fluidic utlopp ansluten till sprutan och pump (3). (B) visar trycket styrenheten med 8 ventiler varje reglera 1 tub ansluten till mikroflödessystem enheten. Ventiler #1 och #2 är här öppen och därmed motsvarande ring ventilerna är stängda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: temperatur kontroll kammare. (A) kammareinnan montering. (B) samman kammare (uppåt) med 2 mm locket glasögon limmade till toppen och botten. Den orange Gummimellanlägg mäter 0,5 mm i höjd och är förseglad med en 0.17 mm täckglas för observation av slutna GUV upphängning. I denna bild infogas en temperatursond för kalibrering (bruna fiber spännande kammaren till höger). (C) slutmontering på scenen av en inverterade mikroskopet utan den temperatur sonden. Den orange Gummimellanlägg nu nedåt. Gummit är självhäftande nog att hålla provet på plats. Observera att ljus kan överföras genom provet möjliggör både påljusfluorescens och ljusa fältobservationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: rumsligt löst temperaturdata inne i observation kammaren erhålls genom FLIM mätningar av temperatur känslig färgämne (här: 500 µM rodamin B) 40. datapunkter erhållits på 0, 10, 30, 300 och 400 µm ovanför det nedre täckglaset. Röda och blå datapunkterna mättes temperaturen i vattenbadet som vid 30 ° C och 12 ° C, respektive. Svart datapunkter visar vatten bad vänster temperera vid rumstemperatur. Små temperaturvariationer i hela kammaren var observerats men bott under 0,5 ° C (grå staplar). Totala kammare höjden är ca 500 µm enligt spacer tjocklek (se ovan). Felstaplarna indikerar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: lokalisera blandbarhet temperaturen. Diagrammet visar enskilda datapunkter i homogena (singel-flytande tillstånd) andelen av GUVs beredd från DOPG/eSM/Chol i förhållandet 30/40/30 dopade med 0.1 mol % DiIC18 från tre oberoende stickprov (N = 20-40). Felstaplar representera standardfel för medel. Datapunkter utrustades till Boltzmann modellen beskrivs i steg 6,8 (kontinuerlig svart linje) från vilken det domän blandande temperatur Tblandat var utläsas (Följ röda kontinuerlig linje till abscissa) enligt den halv högst den sigmoidal kurvan på y-axeln (streckad svart linje). Inledande och avslutande värden (en1 och en2) fastställdes till 0 och 1, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: defekt vesicles. Exempel på gigantiska blåsor beredd från 20/60/20 DOPG/eSM/Chol och dopade med 0.1 mol % om DiIC18 som inte uppfyller kriterierna som angetts i steg 4,2 fotograferad av wide-fältet fluorescensmikroskopi. Intensitet display spänner av enskilda bilder var optimerad för fluorescensintensiteten hos den avbildade vesikler varje gång. På grund av ytterligare membran material och inkapslade mindre blåsor definieras inte fasen delstaten i vesikler (A) tydligt. Utseendet på denna jätte vesikler tillåter inte någon tillförlitlig okulärbesiktning för lamellarity. Panelen (B) skildrar en vesikel som interiören är trångt med membran material. Följaktligen är fluorescens signalen exteriör vesikler membran ovanpå med dess interna signal, omöjliggör en visualisering av lamellarity och potentiella domäner. (C) fluorescens stödnivåerna tre olika giant blåsor visas i direkt jämförelse inom intervallet intensitet samma display. Denna bild visar att giant multilamellar blåsor (1, 2) kan identifieras genom sin ökade fluorescens signal jämfört med GUV (3). Här, multilamellar samt unilamellar gigantiska blåsor utställning Lo + Ld fasseparation. Blåsor i alla bilder var avbildade genom en 40 x / 0.6 NA mål. Skala barer = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 10: bråkdel av Lo + Ld fas separerade GUVs i genomsnitt över minst tre oberoende prover. Blåsor bestod av 30/40/30 DOPG/eSM/Chol nära gränsen till regionen Lo + Ld samexistens. Felstaplarna för symmetrisk sackaros villkor illustrera sats till sats spridningen. Etikett för y-axeln beskriver lösningar insida/utsida blåsor; sackaros: 210 mM sackaros; Salt: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Felstaplar visar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: arrangera gradvisdiagrammet av GUVs beredd från DOPG, eSM, och Chol mappas på olika lösning villkor med 210 mM sackaros (sackaros) och 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (salt). GUV fas påstår utforskades i sackaros/sackaros (A; övre delen), sackaros/salt (in/ut) (A; polygonal underdel), salt/salt (B, övre delen) och salt/sackaros (B; polygonal underdel). Karikatyrerna illustrera det dominerande domän mönstret inom den markerade avsnitten och motsvarande lösning villkor. Vesikler fas länder representerade i avsnitten lägre polygonal observerades under asymmetrisk lösning förhållanden vid 20 x GUV utspädning. Anpassad från referens9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: artefakter i instängd GUVs. Exempel på en liten GUV där en falsk domän kan ses på grund av närheten med inlägg (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Den ljusa-fältet överförs ljus bild som visar inlägg (grEY) överdras med confocal fluorescens bilden av GUV (orange). Inlägg är sett till skapa en interferensmönstret i bildens ljusa-fältet. Fluorescens signalen nära inlägg (höger) reduceras ger intrycket av fasseparation. Skalstapeln = 5 µm.
Figur 13: exempel på två olika GUVs fångas av PDMS inlägg där fas staterna är klart synliga. (A) Lo + Ld fas separerade vesikler gjord av DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) en vesikel tillverkad av 40/30/30 uppvisar Ld eller Lo enfas. En confocal z-stack av den hela vesikler undersöktes för att bekräfta att inga (out-of-fokus) domäner var närvarande. Kanterna på inlägg syns på höger sida av bilderna (grå). Skalstapeln = 5 µm.
Figur 14: resulterande fas beteende efter en fullständig fluidic exchange apparaten mikroflödessystem. Samma GUV visas både före och efter lösning exchange för (A) symmetriska salt/salt (in/ut) till salt/sackaros (in/ut) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, skalstapeln är 2 µm) och (B) symmetriska sackaros/sackaros (in/ut) till sackaros/salt (in/ut) (DOPG eSM/Chol 30/40/30, skala bar = 3 µm). Anpassad från referens9.
Discussion
Framgångsrik produktion av GUVs för fas statens observationer under symmetriska och asymmetriska hög-salthaltsförhållanden
De protokoll som presenteras här introducerar en strategi för att bedöma påverkan av hög-salthalt buffert och lösning asymmetri på membran fas delstaten laddade GUVs över ett brett spektrum av kompositioner. En av de stora utmaningarna för att uppnå detta mål var produktionen av laddade GUVs i hög-salthalt buffertar.
Vi producerade framgångsrikt GUVs i sackaroslösning och hög-saltlösning buffert av en enkel spontana svullnad tillvägagångssätt, som inkluderar en pre hydrering steg av deponerade lipid filmen och en övernattning slutliga återfuktning för vesikler tillväxt. Det är viktigt att notera att lipid nedfall bör göras på en uppruggad PTFE plattan att säkerställa även lipid spridning för att ge unilamellar blåsor. Dessutom är det viktigt att utföra varje steg under vesikler beredning vid en temperatur där lipid filmen är i en homogen och flytande fas. Annars, vesikler befolkningen kan vara polydisperse i komposition och bias slutliga fas staten analysen. Det specifika protokollet för den spontana svullnad av GUVs avkastning en vesikel klump som å ena sidan erbjuder möjligheten att slamma det i små volymer för att få högkoncentrerad vesikler dispersioner, och å andra sidan ger asymmetriska lösning villkor över membranet samtidigt minimera utspädning av blåsor8,28. Det är viktigt att under vesikler spädning eller extern lösning utbyta, insidan och utanför lägre förbli matchade som morfologi förändringar orsakade av osmolaritet missmatchningar kan inducera eller förhindra Lo + Ld fas separation41 eller, vid hypoton villkor, kan leda till vesikler spricker.
Här, resulterade försök att optimera electroformation protokoll i hög-salthalt lösning i produktionen av ingen GUVs medan PVA-assisted svullnad gav multilamellar blåsor. Även om det kräver längre förberedelse gånger och resultat i vesikler partier av lägre kvalitet10,17, framgångsrika produktion av laddade blåsor av spontana kommer svullnad med ytterligare fördelar. Det kräver minimal ansträngning samtidigt som leder till tillräcklig avkastning för statistiska batch analyser, och till skillnad från electroformation, ingen avancerad utrustning eller optimering krävdes. Dessutom observerats inga föroreningar av lipid oxidation42,43. Enligt litteraturen finns det inga skillnader mellan lipid kompositioner av blåsor och de motsvarande bestånd som odlades de7,17. Dessutom frågar inte vesikler bildning på ett PTFE-substrat införandet av eventuella föroreningar i motsats till gel-assisted svullnad metoder där främmande molekyler kan införas av substrat23. Electroformation kommer med ytterligare nackdelar relaterade till överdriven vesikler utspädning när skapa asymmetriska lösning förutsättningar. GUVs produceras av electroformation förekommer oftast som en homogen dispersion (i motsats till den högkoncentrerade vesikler fjädringen i form av en klump som bildas under spontana svullnad). Utspädning av den externa lösningen skulle väsentligen späd antalet blåsor samt. Dessutom, under loppet av detta arbete konstaterades att DOPG/eSM/Chol GUVs producerad av electroformation i sackaros blev instabil om spädning sker i hög-salthalt buffert. Fluorescens från lipid fläckar på objektglas anges att blåsor skulle brista innan deras okulärbesiktning var möjligt. Sådan instabilitet kan tillskrivas en förhöjd membran spänning av blåsor som utarbetats av electroformation jämfört med dem som erhålls genom spontan svullnad10.
Även om vesikler utspädning är en enkel och snabb metod att skapa asymmetriska GUV lösning förutsättningar, det bara åstadkommer en dellösning externa exchange, om än i en hög bråkdel (här: 95%, figur 2), som vid utspädning, spår av den svullnad lösning kommer att förbli. Valet av graden av extern lösning utbyte är en kompromiss mellan pipettering upp den vesikler klump tillsammans med svullnad lösningen (avsnitt 2) och inte späda ut den för mycket. Därför införde vi en alternativ mikroflödessystem strategi diskuteras på annat håll i detalj37 som möjliggör en snabb och komplett extern lösning exchange under GUV fas statens observationer att verifiera fas staten iakttagelser för utspädd blåsor. Observationer av fas staten variationer vid byte från symmetriska till asymmetrisk lösning villkor observerades faktiskt vara överens. Dessutom båda metoder att generera asymmetrisk lösning villkor visas här är comparably snabb (jämför Ref.8) och komma med några kända risker om lokala sammansättningen ändringar (jämför referenser30,31), öka i membran spänning (jämför referens32) eller lokal uppvärmning (jämför referens33), när det gäller alternativa metoder diskuteras i inledningen. Under mikroflödessystem fångst är en osmotisk balans mellan vesikel interiör och exteriör inte bara nödvändigt att undvika fas staten artefakter som nämnts ovan men också deflation orsakas av hyperton lösning villkor kan orsaka de fångade GUVs att glida igenom inläggen efter ett utbyte av extern lösning.
Även om spontan svullnad har tillämpats framgångsrikt för att växa oladdade kan blåsor från ett DOPC/eSM/Chol system, i andra fall, avsaknad av avgifter försämra GUV svullnad på grund av resulterande bristen på repulsion mellan de enskilda lipidmonolager44 . Att utvidga perioden före svullnad eller införa skrymmande lipid headgroups kan motverka denna fråga45. Dessutom kan vesikler stabilitet efter deras utspädning i lösningar skiljer sig från den som används för svullnad variera för olika lipid kompositioner och utspädning media, som vi inte har undersökt här. Också har vi inte undersökt möjligheten att trimma den genomsnittliga GUV diametern med den förberedelse metod presenteras här. Men parametrar såsom vesikler sammansättning och svullnad lösning kommer sannolikt att påverka resultaten. Tillämpningen av alternativa metoder46 kan ge större blåsor lipider och lösningar används här, men de kan komma med andra nackdelar som är associerad med metoden. Den ovan beskrivna metoden att producera GUVs i symmetriska och asymmetriska hög-salthaltsförhållanden ger ett potentiellt verktyg för fortsatta studier av blåsor består av olika lipid kompositioner och spridda i olika medier. Så vi inte har undersökt dessa möjligheter, kommer framtida prövningar visar hur allmänt GUV beredning och spädning metoderna kan tillämpas.
Att observera fasseparation vid varierande temperaturer
Det finns olika försöksuppställningar lämplig att studera GUVs vid varierande temperaturer. Medan dessa inställningar inte är vanligen beskrivs i detalj inom litteraturen, presenterar det nuvarande arbetet en grundläggande församling som är tillämpliga för sådana studier.
Under bedömningen av GUV fas påstår över ett brett temperaturområde är det viktigt att de observerade blåsor är väl jämviktas efter temperaturen har ändrats. Ett sätt att säkerställa detta är att kontrollera för hysteres. Om hysteres är närvarande, temperatur stegen bör minskas eller Jämviktstiden gånger ökat. Som temperatur upprättas kontroll i detta arbete av en vattenbaserad termostat, spänna av arbetstemperatur är idealiskt begränsad till 0 - 100 ° C. Detta intervall kan utökas genom att använda andra temperatur kontroll vätskor såsom olja eller genom att anställa andra uppställningar, e.g. en Peltier enhet. I praktiken är arbetstemperaturen också begränsat möjligt kondens eller avdunstning. Dessutom för temperaturer långt från rumstemperatur blir förekomsten av en steady-state temperaturlutning över observation kammaren mer sannolikt. Tänkbar utrustning kan också skadas vid extrema temperaturer. För typiska temperaturområden som är lämpliga för lipid vesikler studier (~ 10-50 ° C7,9) observation utrustningen bör övervägas men förväntas normalt inte.Vesikler domän observation artefakter
Det finns ett antal källor för observation artefakter med wide-fältet fluorescensmikroskopi. Först och främst bör man vara medveten om att den maximala upplösning r för objektet tillämpas för visuell inspektion av vesikler fas staterna bestämmer detektionsgränsen för lipid domäner enligt:
där λ är våglängden utsläpp och NA är numerisk bländare av målet. Ett typiskt mål med en 40 x förstoring och en NA 0,6 som upptäcker grön utsläpp ljus omkring 560 nm skulle nå en optisk upplösning på ~0.6 µm. därför studier som jämför fas påstår av blåsor från särskilda lipid blandningar bland olika villkor bör använda samma mål för samma lipid blandningen.
En annan artefakt är förekomsten av lipid domäner till följd av lipid photo-oxidation på grund av en långvarig exponering för magnetisering ljus41. Foto-skador uppstår företrädesvis på omättade kolväten lipid beståndsdelarna. I själva verket för lipid kompositioner, sådan domän bildandet av initialt homogen blåsor observerades här efter en lång period av magnetiseringen ljusexponering (~ 30 s). För att motverka problemet, hölls excitation ljuset fokuserad på ett synfält för bara några sekunder för bedömningen av fas-statligt. DiIC18 var därför lämplig för våra syften. Andra färgämnen, dock kan vara mycket mer känsliga och kan behöva hanteras på lägre excitation stödnivåer och med kortare excitation ljus exponering gånger.
Mekaniska skjuvning stress från pipett överföringen av blåsor blandar potentiellt domäner tillfälligt, och därmed snedvrida skenbara vesikler fas beteende. För vissa partier, olika blåsor visade olika fas beteenden 0 min och 5 min efter pipett överföra på det Mikroskop täckglaset. Skjuvspänningen induceras av strömningen i ultrakalla enheten har också visat sig resultera i domänen blandning47. Blåsor ska lämnas ostört under en tillräckligt lång tid för Jämviktstiden före observation. Inom denna studie var blåsor instängd på mikroflödessystem enheten kvar orörd i 1 h efter vesikler lastning och lösning utbyte innan observation.
Undvika några av de ovannämnda svårigheterna samt de begränsningar som införts av de lätta diffraktionsgränsen, alternativa metoder såsom kärnmagnetisk resonans spektroskopi48 eller super upplösning mikroskopi tekniker49 kunde vara anställd.
Slutsats och outlook
Presenterade arbetet visar en uppsättning metoder som möjliggör analys av påverkan av hög-salthalt symmetriska och asymmetriska lösning villkor på membran fasseparation. Alla metoderna som presenteras är lämplig för andra användningar. Mikroflödessystem enheten ger till exempel en plattform för att studera kinetiken för domänen bildandet och försvinnande vid induktion av lösning asymmetri. Dessutom kunde domän utseende som en funktion av salt koncentration undersökas ditåt. Alla metoder kan också användas för att titta på påverkan på beteendet fas använder några andra lösningar av intresse.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete är en del av konsortiet MaxSynBio, som finansieras gemensamt av det federala ministeriet för utbildning och forskning i Tyskland och i Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
| chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
| cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
| Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
| NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
| HCl (37 %) | Roth | ||
| Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
| Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
| Parafilm | |||
| Threaded vial 45x27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
| Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
| Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
| Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
| Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
| Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
| Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
| Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
| 0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |
References
- Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
- Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
- Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
- Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
- Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
- Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
- Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
- Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
- Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
- Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
- Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
- Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
- Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
- Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
- Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
- Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
- Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
- Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
- Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
- Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
- Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
- Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
- Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
- Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
- Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
- Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
- Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
- Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
- Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
- Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
- Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).
