Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

مرحلة السلوك من حويصلات مشحونة بظروف الحل المتماثلة وغير المتماثلة رصدها بالفحص المجهري الأسفار

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56034
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

Summary

كثيرا ما تهمل تجارب على مرحلة فصل أونيلاميلار العملاقة حويصلات (جوفس) الظروف الفسيولوجية الحل. ويعرض هذا العمل النهج لدراسة تأثير الملوحة العالية المخزن المؤقت على المرحلة سائل فصل في مشحونة جوفس متعددة المكونات كدالة عبر غشاء حل التباين ودرجة الحرارة.

Abstract

السائل-أمر بفصل المرحلة أونيلاميلار العملاقة حويصلات (جوفس) نستعرض تتعايش والمجالات اضطرابه السائل أداة البيوفيزيائية مشتركة للتحقيق في فرضية طوف الدهن. ومع ذلك، العديد من الدراسات، إهمال أثر الظروف الفسيولوجية الحل. في هذا الحساب، يعرض العمل الحالي تأثير الملوحة العالية العازلة وعبر غشاء حل عدم التماثل على سائل انفصال مشحونة جوفس نمت من ديولييلفوسفاتيديلجليسيرول، سفينجوميلين البيض والكوليسترول في الدم. وجرت دراسة الآثار تحت ظروف درجة الحرارة متحاور ومتفاوتة.

يمكننا وصف المعدات واستراتيجيات تجريبية قابلة للتطبيق لمراقبة استقرار المجالات السائل تتعايشان في حويصلات مشحونة تحت ظروف الحل الملوحة العالية المتماثلة وغير المتماثلة. ويشمل هذا نهج إعداد مشحونة جوفس متعددة المكونات في المخزن المؤقت للملوحة العالية في درجات حرارة عالية. البروتوكول يستلزم الخيار لإجراء تبادل الحل الخارجي بصورة جزئية بخطوة تخفيف بسيط مع التقليل من إضعاف حويصلة. ويرد كنهج بديل استخدام جهاز موائع جزيئية تسمح تبادل حلول خارجية كاملة. ودرست أيضا آثار الحل على انفصال تحت درجات حرارة متفاوتة. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن نقدم التصميم الأساسي والأداة المساعدة لدائرة الرقابة الداخلية درجة الحرارة بنيت. وعلاوة على ذلك، علينا أن نفكر في تقييم الدولة المرحلة جيوف المزالق المرتبطة معها، وكيفية التغلب عليها.

Introduction

من أي وقت مضى منذ مراقبة المجالات ميكرون الحجم في حويصلات سائل مفصولة بالمرحلة أونيلاميلار العملاقة (جوفس) بالفحص المجهري الأسفار، استخدمت جوفس كنظام نموذجي للتحقيق في الدهن طوف فرضية1،2 , 3 . منطقة بها بلير بذاتها تكمن في أن النطاق من الخلايا البيولوجية، فمناسبة يقلد أغشية البلازما تتميز اﻷطواف المفترضة. تم إجراء العديد من الدراسات على هذه جوفس مع حويصلات مبعثرة في المياه النقية أو السكروز أو حلول منخفضة الملوحة4،5،6،،من78. هذه الظروف، ومع ذلك، لا تعكس التعرض ذات الصلة فسيولوجيا من بيوميمبرانيس إلى بيئات عالية الملوحة وعدم التماثل في الحل عبر غشاء كما الشروط للخلايا.

في هذا العمل وفي منشور سابق من لدينا مجموعة9، بحثت دول المرحلة مشحونة جوفس متعددة المكونات كدالة على وجود عدم تناسق الملح والحل عبر الغشاء. وأعدت جوفس من خلائط نسب مختلفة من ديوليويلفوسفاتيديلجليسيرول (دوبج)، والبيض سفينجوميلين (eSM)، ونسبة الكولسترول في الدم (شول) في محلول السكروز (مع الاسموليه لموسم 210/كغ) أو العازلة عالية الملوحة (100 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، درجة الحموضة 7.5، 210 موسم/كغ). اختيار المحتوى الدهني له ما يبرره من البيانات التي تم الحصول عليها في مرحلة الرسم التخطيطي لهذا الخليط6،8.

عدد من الطرق لإعداد جوفس متوفرة في الأدب10،،من1112 (لاحظ أنه هنا، لا نعتبر تلك التي تنطوي على نقل الدهون من القائم على النفط إلى مرحلة مائي 13 , 14 بسبب الخطر الكامن من مخلفات النفط المتبقي في الغشاء مما قد يؤثر على سلوك المرحلة). ويرتبط إعداد جوفس في المخزن المؤقت للملوحة العالية مع التحديات المحددة. لحلول منخفضة القوة الأيونية، يعرض15،طريقة اليكتروفورميشن16 طريقة سريعة لتحضير جوفس في الغلات العالية مع تذكر عيوب10،17. الأسلوب الذي يستند إلى إيداع طبقة من الدهون على سطح موصل (مسرى) وتجفيف لهم وترطيب لهم مع محلول مائي حين تطبيق حقل التيار متردد. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب إجراء تعديلات إذا الملح موجود في ال18،محلول مائي19. فمن المفترض أن القوة الدافعة لنمو حويصلة من اليكتروفورميشن هو اليكتروسموسيس16 التي تعرقله في كوندوكتيفيتيس ارتفاع20. ومن ثم، اليكتروسويلينج جوفس في الحلول عالية الملوحة ليس نهجاً واضحة أنها تتطلب التحسين لتركيزات الملح مختلفة موجودة في الحل تورم. حويصلة ساعد جل تورم21،22 بديل محتمل اليكتروفورميشن مع أسرع حتى تشكيل مرات. يبني هذا النهج على ترطيب الفيلم الدهن المعززة عند استخدام هلام ([اغروس] أو كحول البولي فينيل (PVA)) كركيزة. ومع ذلك، تأتي هذه النهج، مع خطر تلوث الغشاء في حالة القائم على [اغروس] تورم23 حدود و/أو درجة الحرارة كما في حالة تورم المستندة إلى بولي. وبالمثل، بروتوكولا لتنمو جوفس على الركازة ورقة السيلولوز في الآونة الأخيرة أنشئت24. القضايا العامة المتعلقة بهذه الطريقة هي عدم وجود رقابة على نقاء الركيزة وكذلك استخدام كميات كبيرة من الدهون. في هذا العمل، وسوف يعرض ويقدم مزايا الأسلوب الأكثر تقليدية لإعداد جيوف، إلا وهي عفوية تورم الأسلوب25،26. وهو يتألف من جفاف طبقة دهن على الركازة نافرة، ترطيب أنه في الجو بخار الماء، وتورم اللاحقة في تورم الحل المنشود (انظر الشكل 1 والتفاصيل في قسم البروتوكول). هذا الأسلوب لا يتيح السيطرة على توزيع حجم حويصلة والنتائج في حويصلات أصغر عموما بالمقارنة مع الأساليب ويساعد فيها الإنتاج الحقل الكهربائي، يعني البوليمر الركازة أو موائع جزيئية. ومع ذلك، حويصلة نوعية وحجم مناسبة لفحص حالة المرحلة الغشاء كما استكشفت هنا.

خلق التفاوت بين الحلول عبر غشاء حويصلة يرتبط مع بعض التحديات، وكذلك. يتمثل أحد النهج استخداماً تمييع تعليق حويصلة في27،الحل الخارجي المطلوب28مباشرة. ومع ذلك، وهذا يقلل أيضا من كثافة توزيع حويصلة. استراتيجية أخرى لبطء تبادل الحل الخارجي حول جوفس استقروا في الجزء السفلي من خلية التدفق التي تسمح للحل في--وأووتفلوكس. لتفادي إزعاج أو حتى فقدان الحويصلات مع التدفق، هي معدلات التدفق المنخفض التطبيقية8، مما يجعل هذا النهج عدم كفاية الوقت. علاوة على ذلك، لم يكن أي من هذين النهجين ضمانات تبادل الحلول الكاملة الخارجية. حلاً واضحا شل حويصلات تفاديا لفقدان لهم أثناء تبادل حلول خارجية. على سبيل المثال، يمكن أن تكون مربوطة بيوتينيلاتيد جوفس على سطح المغلفة ستريبتافيدين29. ومع ذلك، قد يؤدي هذا النهج إلى الاختلافات التركيبية في يجري التقيد بها وبالتالي قطع الغشاء غير التقيد30،31. تطبيق المغناطيسي أو المجالات الكهربائية فخ النتائج حويصلات في فرض الغشاء التوتر32. استخدام الملقط الضوئية إلى اعتراض حويصلة يتطلب وجود مقبض تعلق (أي حبة)، بينما قد تشمل استخدام نقالات الضوئية التدفئة المحلية33. كما يمكن أن يتحقق ملائمة جوفس بتزايد عليها في أسلاك البلاتين دون مفرزة النهائي34. لكن هذا غلة الحويصلات التي ليست معزولة، والتي ترتبط عادة بالأسلاك أو غيرها حويصلات بأنابيب رقيقة الدهن (الحبال).

قدم عمل يسلط الضوء على استراتيجيات للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. أولاً نقدم وصفاً مفصلاً لطريقة تورم عفوية تكييفها والأمثل لإنتاج جوفس في المخازن المؤقتة للملوحة العالية. ثم نقدم أسلوبين لإنشاء شروط الحل غير متماثل بتمييع بسيطة أو استخدام جهاز موائع جزيئية بكفاءة. لأن هدفنا هو تحليل لحالة المرحلة غشاء جوفس في حل مختلف الظروف، وتصف المقاطع اللاحقة معايير نجاح التحليل الإحصائي وتلميحات الحالية لتجنب تصنيف كاذبة.

التحليلات التي أجريت تحت ظروف متحاور كذلك تحت درجات حرارة متفاوتة. بينما درجة حرارة مئويةأونترول هو استخداماً، وتفاصيل حول الدوائر التجريبية-التحكم في درجة الحرارة نادراً ما يوصف. ويرد هنا، بإعداد بني داخلية لمراقبة جوفس في ظروف الحرارة المختلفة.

Protocol

1-"تورم جوفس عفوية"

ملاحظة: كلوروفورم هو مادة ضارة، وشديدة التقلب. إجراء كافة العمليات التي تنطوي على كلوروفورم تحت غطاء دخان. لا تستخدم المختبرات الطبية البلاستيكية مثل نصائح ماصة أو حاويات بلاستيكية لنقل و/أو تخزين الحلول كلوروفورم. كلوروفورم يذوب البلاستيك، مما يلوث الحل. استخدام المحاقن الزجاجية والزجاج حاويات بدلاً من ذلك. وعلاوة على ذلك، عمل نظيفة قدر الإمكان تجنب إدخال شوائب كما أنها قد تتفاعل مع الأغشية. ملاحظة أن تركيزات الدهون نموذجية في التحضيرات النهائية جيوف في نطاق micromolar، وبالتالي قد يكون الشوائب في نطاق تركيز تأثير قوي على سلوك الغشاء.

  1. وبصرف النظر عن المعدات الأساسية، وأن العناصر التالية جاهزة.
    1. تحضير بوليتيترافلوريثيليني (PTFE، المعروف تفلون) لوحة لترسب الدهن من حجم ~1.5 سم × 1.5 سم وسمك مناسب. لوحة على جانب واحد مع الصنفرة غرامة الخشونة.
      ملاحظة: PTFE نافرة وسوف لا تبلل بحلول كلوروفورم إذا السلس. يمكن خشن كلا الجانبين من لوحة PTFE لتجنب الارتباك حول الجانب الصحيح لترسب الدهن. وينبغي اختيار سمك اللوح للتعامل مع السهل، مثلاً أنها ليست مرنة جداً ويمكن تغطيتها بسهولة بالحل ترطيب (انظر الشكل 1). هنا استخدمنا ألواح سمك ~ 2 مم. وبمجرد خشن، لوحة PTFE يمكن إعادة استخدامها للتجارب الجديدة بعد التنظيف السليم (الخطوة 1، 3)-
    2. إعداد قنينة زجاج يمكن إغلاقها بشرط التخزين المناسبة (~ 15 مل) لنمو ترطيب وحويصله الفيلم النهائي الدهن.
    3. إعداد حاوية زجاج يمكن إغلاقها بشرط الذي يناسب القنينة الزجاج ~ 15 مل؛ وأنها ستستخدم لخلق أجواء مشبعة المياه للدهن الفيلم قبل تورم، انظر الشكل 1-
  2. إعداد 4 مم مخزون الدهن المطلوب بنسبة 1، 2-ديوليويل-sn-جليسيرو-3-والرمات-(1 '--rac-الجلسرين) (ملح الصوديوم) (دوبج)، البيض سفينجوميلين (eSM)، ونسبة الكولسترول في الدم (شول)، مع إضافية 0.1 mol % 1, 1 ′-ديوكتاديسيل-3 ، 3,3 ′، 3 ′-تيتراميثيليندوكاربوسيانيني فوق كلورات (ديك 18) إلى تركيز الدهون إجمالية من 4 مم. استخدام كلوروفورم كمذيب. انظر الجدول المواد-
  3. دقة شطف لوحة PTFE وحاوية الزجاج مع المنظفات غسل الأطباق التجارية، الإيثانول، وكلوروفورم في هذا التسلسل وأخيراً تجفيفها.
  4. استخدام المحاقن زجاجية، إيداع وموزعا 10-15 ميليلتر من مخزون الدهن إلى الجانب خشن من لوحة PTFE إنشاء فيلم دهن موحدة. استخدام إبرة حقنه لنشر الحل إذا لزم الأمر.
    5. ضع لوحة PTFE على سطح نظيف
  5. وديسيككاتي أنه إلى جانب الفيلم الدهن المودعة ح 2 عند 60 درجة مئوية لإزالة في كلوروفورم. من أجل راحتك، إيداع اللوحة في حاوية الزجاج تنظيفها والغلق 15 مل خلال جفاف.
    ملاحظة: درجة حرارة عالية ويضمن أن يكون الفيلم الدهن في دولة واحدة-سائل متجانسة في هذا المجال وجميع الخطوات اللاحقة-
  6. بعد جفاف، ملء حاوية الزجاج قبل تورم مع المياه تصل إلى مستوى يسمح للطفو تدق فوق قنينة الزجاج ~ 15 مل (~ 1 سم)، انظر الشكل 1-
  7. وضع الزجاج ~ 15 مل فيال مع لوحة PTFE إلى الحاوية وتغطية ذلك بأجواء مشبعة المياه قد تنشأ، انظر الشكل 1B.
    ملاحظة: الماء المكثف في الجدران الحاوية الداخلية يعطي مؤشرا جيدا للتشبع بخار الماء ناجحة.
  8. السماح الفيلم المودعة في الدهون تضخم مسبقاً داخل حاوية زجاجية مغلقة عند 60 درجة مئوية ح 4. ضمن هذه الفترة الزمنية تعد الحل المنشود تورم.
    ملاحظة: لحويصلة الاستعدادات التي يمكن أن تجري في انخفاض درجة الحرارة، هذه المرة يمكن أن الغاية اختصارها-وصولاً إلى بضع دقائق-إذا يستخدم النيتروجين المشبعة في المياه الدافئة أو الأرجون تورم قبل بدلاً من ذلك.
    1. تحضير 200 ملم السكروز أو 100 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، pH 7.5 تعديلها مع HCl والحرارة إلى 60 درجة مئوية لجعل الحل تورم.
  9. بعد تورم قبل، تأخذ الزجاج ~ 15 مل مع لوحة PTFE خارج الحاوية. مع حقنه متصلة بعامل تصفية 0.45 ميكرومتر، إضافة ~ 5 مل الحل تورم في القنينة الزجاج 15 مل هيدرات الفيلم الدهن.
    ملاحظة: تحديد إبرة لعامل التصفية يخفف الإدراج الحل تورم. قد يكون من المستصوب لضمان حالة مرحلة السائلة واحد من الفيلم الدهن أثناء إضافة الحل تورم الاحترار قبل المحاقن والتصفية. تصفية الحل يقلل من (في-) الملوثات العضوية من البكتيريا أو اندفاع الملح إلخ
  10. ختم القنينة الزجاج ~ 15 مل عقد الفيلم الدهن رطب على لوحة PTFE للتقليل من التبخر. إذا لزم الأمر، استخدم الفيلم البارافين تعزيز الختم. اترك الفيلم الدهن رطب في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها للنهائي جيوف تورم.

2. حصاد جوفس

ملاحظة: تجميع جوفس منتفخة ومنفصلة عن نتائج الركيزة PTFE في أجمة تشبه سحابة صغيرة (~ 1 مم) مرئية بالعين المجردة. ويبدو مبيضة عند استخدام لا صبغة الأسفار. خلاف ذلك، هو لون حسب طيف امتصاص فلوروفوري. إضافة يجعل دييك 18 السحابة الوردي (انظر الشكل 2). الحويصلات التي تتركز في الكلية والحصاد فإنه يزيد الغلة حويصلة.

~1/10
  1. باردة أسفل الحويصلات إلى درجة حرارة الغرفة داخل h. ~ 1 قطع نهاية مدبب رأس المكبس ماصة بلاستيكية للكتلة أو مجموع الحويصلات لتناسب من خلال الفوهة.
    ملاحظة: أن معدل التبريد أهمية خاصة إذا كان من المتوقع فصل المرحلة الصلبة والسائلة كما أنه يغير حجم النطاقات الصلبة. هنا، إلى إبطاء التبريد، علينا وضع العينة على اتصال مع كتلة معدنية من حجم 5 سم × 9.5 سم × 7.5 سم (ح × الطول × العرض × العمق) أن يبرد لدرجة حرارة الغرفة داخل حاء 1
  2. ماصة تصل الكتلة جنبا إلى جنب مع وحدة تخزين مناسبة من تورم الحل (انظر الشكل 2). إعادة تعليق الإجمالية في حل تورم لخلق ظروف الحل متماثل، أو أي المطلوب حل iso ناضح لخلق ظروف الحل غير المتناظر.
    ملاحظة: الحد الأدنى للحجم محدود بحجم الإجمالي أن تحصد تماما. هو تمييع الحل الخارجي وبغية تقييم تركيز الدقيق، حجم الحل حويصلة يجب أن تؤخذ في الاعتبار-

3. مراقبة جوفس "مرحلة الدولة تقييم استخدام Fluorescence مجهرية"

ملاحظة: هي يخدر "جوفس" مع دييك 18 كعلامة مضيئة. هذا fluorophore أقسام تفضيلي إلى مرحلة اضطرابه السائل (دينار). وهذا يسمح لمراقبة الفحص المجهري fluorescence المجالات الناتجة عن انفصال في جوفس. أجرينا تقييم مرحلة الدولة مع برنامج التحصين الموسع-الأسفار مجهرية. من حيث المبدأ، قابلة هذه الملاحظات أيضا استخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم)، الذي يسمح أيضا للقياس الكمي إشارة (مثل تحديد غشاء أونيلاميلاريتي). ولكن كلسم يتطلب معدات أكثر تطورا و (عادة) برنامج التحصين الموسع-fluorescence الملاحظات قبل المسح مفيدة في أي حال.

  1. تقرر بصورة موضوعية (مثلاً 40 X التكبير مع فتحه عددية 0.6 (نا) هنا المستخدمة) الاحتفال جوفس واستخدامه دائماً عند مقارنة الدول مرحلة تكوين نفسه في سولوتيو مختلفةn الظروف. استخدام مرشحات الطول الموجي الإثارة والانبعاثات المناسبة لتمكين fluorescence الملاحظات مع فلوروفوري المستخدمة (مثل الإثارة في 560 ± 40 نانومتر و 630 ± 75 شمال البحر الأبيض المتوسط مع 585 نانومتر شعاع مقسم بين المستخدمة ل ديك 18)-
    ملاحظة: حدود الدولة المرحلة داخل رسم تخطيطي لمرحلة سوف تعتمد على هذا القرار الذي يحقق الهدف كما أنه يحدد حجم الحد الأدنى من المجالات الدقيقة الكشف عن-
  2. للتحليل، فقط حدد جوفس التي تفي بمعايير الجودة التالية.
    1. ضمان أونيلاميلاريتي للغشاء جيوف بالملاحظة البصرية من حويصلات مختلفة ومقارنة كثافة؛ وحويصلات مع كثافة الانبعاثات fluorescence أدنى الأكثر احتمالاً أونيلاميلار.
      ملاحظة: تورم عفوية قد تسفر عن دفعات حويصلة فيها جزء كبير من حويصلات العملاقة ليست أونيلاميلار.
      2. إجراء تدقيق إضافية بقياس كثافة الانبعاثات الأسفار من المفترض أن حويصلات العملاقة أونيلاميلار
    2. وتحقق الإشارة المقابلة لنثر ضمن السكان. إذا كان يتم ملاحظة لا الاختلافات عدد صحيح بين جوفس مختلفة، كل منهم من المحتمل أن أونيلاميلار-
      ملاحظة: إذا كانت تعد حويصلات من الدهون التقليدية باستخدام أسلوب الراسخة مثل تورم عفوية، النهج المذكور أعلاه للكشف عن حويصلات أونيلاميلار كافية. إذا إنشاء بروتوكول إعداد جوف جديد أو استخدام الدهون غير تقليدية، يلزم إجراء دراسات أكثر تفصيلاً للتأكد من أونيلاميلاريتي. على سبيل المثال، يمكن مقارنة الإشارات fluorescence غشاء من حويصلات توسم أعدها بروتوكول جديد جوفس أعدت بطريقة ثابتة؛ أو الأغشية المسامية البروتين α-hemolysin يمكن إدراجها في حويصلة الأغشية 24. صبغ إضافة إلى خارج الحويصلات ثم سيدخل بهم الداخلية أو لا، اعتماداً على الوجود ليوني-أو الحويصلات مولتيلاميلار، على التوالي.
    3. ضمان جيوف قطرها الحد أدنى معقول للنطاقات أن التعرف عليها لا تزال-
    4. ضمان جيوف (تقريبا) أي عيوب مثل أجزاء بارزة أو الالتزام بها أو الهياكل الداخلية-
  3. نقل قاسمة لتعليق جيوف إلى شريحة مجهر وختم ذلك بشكل صحيح. إعداد دائرة مراقبة.
  4. إيداع العينة على شريحة المجهر. المحيطة به بفاصل سيليكون مع الفصل دائري مركزي. لتجنب التلوث، تأكد أن المباعدة ليس على اتصال العينة. ختم الداخلية عن طريق وضع زلة الغطاء فوق فاصل سيليكون.
    ملاحظة: بدلاً من السيليكون فاصل واحد يمكن استخدام الشحوم سيليكون أو الفواصل بوليديميثيسيلوكساني محلية الصنع (PDMS). ختم الدائرة يضمن الحد الأدنى من التبخر من العينة ويحافظ على شروط iso-أوسمولار-
  5. ترك العينة ~ 5 دقائق لإعادة الموازنة مجالات الممكنة.
    ملاحظة: الضغط الميكانيكي من بيبيتينج قد خلط المجالات غشاء، التي تحتاج إلى وقت للإصلاح.
  6. مكان الشريحة المجهر مع العينة على خشبة المسرح المجهر وتحليل حالة المرحلة دفعة جوف في مقاربة إحصائية. مراقبة أكثر من 30 جوفس كل دفعة وتحديد حالتها المرحلة وفقا للمعايير التالية لتقييم الدولة المرحلة جيوف مع ديك 18 ( الشكل 3).
    ملاحظة: بعد نموها، وقد تتغير حويصلات هذه التراكيب الفردية بسبب (على سبيل المثال) المجال مهدها قبالة أو تبادل مواد الغشاء عن طريق الأنابيب النانوية. ولذلك يحمل جوفس الاختلافات التركيبية داخل المجموعة نفسها 35. المرحلة
    1. سائل واحد يجري أما السائل-أمر (لو) أو اضطرابه السائل (Ld): ضمان أن الشكل العام جيوف كروية والسلس والبلوتينيوم توزع ديك 18 في الغشاء (أول صور في لوحات العلوي والسفلي في < فئة قوية = "إكسفيج" > الشكل 3)-
    2. الدولة التعايش مرحلتين لو + Ld: ضمان أن الحويصلات يحمل المجالات التي يبدو دائري مع حدود ناعمة؛ ووفقا دييك 18 تقسيم السلوك هي المجالات أحمر (Ld) أو الأحمر الداكن/أسود (لو) (الثانية الصور في الأعلى و أسفل لوحات في الشكل 3، اللون كاذبة). تحقق من أن المجالات مجاناً نشرها على سطح حويصلة ويمكن أن تتجمع.
    3. الصلبة ذات مرحلتين (S) + السائل دولة التعايش (لو + S أو S + Ld): ضمان أن المجالات قد تبدو شبيهة بالإصبع أو مدور ولكن مع حدود الزاوي (الصور الثالثة في لوحات العلوي والسفلي في الشكل 3). مراقبة المجالات سائلة (أحمر) على خلفية صلبة (أسود) أنه لن يتم عرض نشرها. العكس، المجالات الصلبة (أسود) سوف تكون حرة في منتشر على خلفية سائلة (أحمر)-
    4. التعايش ثلاث مراحل S + لو + Ld: نلاحظ ثلاثة أنواع من المجالات التي تظهر: المجالات الأسود (ط) الزاوي (S)، جزءا لا يتجزأ من خافت (ii) (لو) و (ثالثا) مشرق (Ld) المجالات الحمراء.
  7. تنسب سكان جوفس إلى مرحلة الدولة التي قررت أن تكون مهيمنة على عينة عشوائية، كما في الأمثلة التالية:
    1. 20 إذا كان يلاحظ جوفس السائل واحد و 15 لو + Ld جوفس، النظر في المجموعة أن يكون مرحلة واحدة-السائل-
    2. إذا 10 S + L جوفس، 30 دينار + لو جوفس، 25 واحد والسائلة جوفس هي التقيد، تنظر المجموعة يكون Lo + ld.

4. جيوف المراقبة في جهاز موائع جزيئية

ملاحظة: أولاً افتعال الجهاز موائع جزيئية؛ وقد أعطيت تفاصيل تصميم الجهاز موائع جزيئية والجمعية في أماكن أخرى 36 ، 37؛ انظر الشكل 4 لوصف مختصر.

  1. إعداد جديدة جيوف تورم الحل (الملح أو السكروز وفقا للخطوة 1.8.1) وتصفيته من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: قد تسد أية شوائب في الحلول التي تتدفق الجهاز موائع جزيئية.
  2. قطع 200 ميليلتر مكبس "الماصة؛" نصائح البلاستيك ووضعها في الثقوب في الجزء PDMS من الجهاز. إضافة 100 ميليلتر و 5 ميليلتر الطازجة وتورم الحل إلى الخزان المصفاة (انظر الشكل 5 ألف) وكل من القطع "الماصة؛" نصائح، على التوالي. الطرد المركزي الجهاز كله في 900 x ز لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد مركزي دوار بديل لما قبل ملء الجهاز وإزالة الهواء.
  3. قبل ملء المحاقن الزجاجية 1 مل وتعلق أنابيب مع الحل تورم ونقل موقف المكبس لمل 0-
  4. وضع الأنابيب مأخذ فلويديك الجهاز ثم ضع المحاقن في ضخ حقنه.
    ملاحظة: اختيار المحاقن ومحقنه المضخة العلامة التجارية ليست مهمة. بيد أن المحاقن الزجاجية أكثر دقة والمضخة ينبغي أن تكون قادرة على العمل في نطاق تدفق ميليلتر في الدقيقة-
  5. الاتصال بوحدة تحكم ضغط مخصص لمداخل 8 عنصر التحكم موائع جزيئية طبقة (انظر الشكل 5 ألف). تعيين الضغط إلى وحدة التحكم ضغط 3 بار (الهواء أو النيتروجين أو الأرجون)، ولكن تعيين الصمامات إلى الجهاز موائع جزيئية لموقف مغلقة.
  6. وضع الجهاز موائع جزيئية، متصلاً الآن بمحقنة المضخة والضغط وحدة التحكم، في مرحلة مجهر مقلوب [كنفوكل]- التكبير
    1. الاستخدام هدف مع نفسه و NA خلال الملاحظات الأكبر. التحكم إذا كانت إحصاءات الدولة المرحلة كما هو موضح في الخطوة 3، 7 لا تزال هي نفسها إذا كان هناك هدف آخر يستخدم لتجنب المراقبة القطع الأثرية التي تستند إلى قرارات مختلفة-
  7. تحميل جوفس في الجهاز-
    1. الأولى، ماصة بعيداً لكن كل 25 إلى 50 ميليلتر من الحل الذي بقي في الخزان. إضافة 150 ميليلتر من الحل جيوف (أما السكروز أو الملح وفقا للخطوة 1.8.1، لكن مطابقة الحل المستخدم لملء ما قبل الجهاز الموجود في الخطوة 4، 1) إلى الخزان ومزيج من بيبيتينج لطيف. مجموعة المحاقن لمعدل التدفق ميليلتر في الدقيقة 10 في سحب وضع لحوالي 20 دقيقة أو حتى أكثر من 90% الفخاخ مشغولة.
      ملاحظة: الخزان لا ينبغي أن تجف. إذا حدث هذا، سوف تدخل فقاعات الهواء الصغيرة-القنوات. إضافة مزيد جيوف الحل ريسيرفويr أثناء تحميل لكن الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء عند بيبيتينج في الجهاز-
  8. فتح كل من صمامات وحدة التحكم إغلاق الصمامات خاتم موائع جزيئية حول الفخاخ/جوفس. تعيين مضخة الحقن إلى 0 ميليلتر/دقيقة. بعد ح 1، الالتزام جوفس والصور [كنفوكل] سجل. إثارة وكشف جوفس وفقا فلوروفوري المستخدمة (مثل الإثارة في شمال البحر الأبيض المتوسط والكشف بين 580-620 نانومتر أما دييك 18 561). استخدام نفس معايير التحديد من الخطوة 3، 6 ،، والحرص على ملاحظة موقع كل جيوف (أي العمود والصف رقم، انظر الشكل 4)
  9. تبادل الحل المحيطة جوفس . تعيين مضخة الحقن إلى 0 ميليلتر/min
    1. و "الماصة؛" ميليلتر بعيداً كل لكن 25 إلى 50 من الحل جيوف من الخزان. إضافة 150 ميليلتر من الحل الثاني (في السكروز أو الملح وفقا للخطوة 1.8.1، اعتماداً على الحل المنشود خارج جوفس) إلى الخزان ومزيج من بيبيتينج لطيف. "الماصة؛" ميليلتر بعيداً كل لكن 25 إلى 50 من الحل المخزن المؤقت من الخزان.
      ملاحظة: هذا الحل يجب أن تصفية باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر جداً.
  10. كرر الخطوة السابقة 5 مرات على الأقل لاستبدال دقة الحل في الخزان. تعيين المحاقن لمعدل التدفق ميليلتر في الدقيقة 10 في سحب وضع ~ 10 دقيقة ليحل محل الحل في الدقيقة-القنوات-
    11. فتح
  11. تقليل معدل التدفق إلى 1 ميليلتر/دقيقة 8 صمامات التحكم الضغط وحدة 2 s وإغلاق مرة أخرى (أسفر عن فتح وإغلاق الصمامات خاتم موائع جزيئية). تعيين معدل التدفق إلى 0 ميليلتر/دقيقة مرة أخرى.
  12. ح بعد 1، التقيد جوفس والصور [كنفوكل] سجل. ومرة أخرى، الحرص على ملاحظة العمود والصف للدائرة الصغرى بحيث يقع كل جيوف تسمح بإجراء مقارنات جيوف نفس قبل وبعد تبادل العازلة الخارجية.

5. تصميم والمعايرة في دائرة التحكم في درجة الحرارة

ملاحظة: غرفة مناسبة للتحكم في درجة الحرارة يمكن أن يكون أما الحصول عليها تجارياً أو الصنع. التحكم في درجة الحرارة وعادة ما يتحقق عن طريق اقتران الحرارية الدائرة مع جيوف العينة في حمام مائي أو عنصر بلتيير. هنا، يمكننا وصف تصميم وتوصيف دائرة الصنع-التحكم في درجة الحرارة تعمل الحرارة مياه خارجية. هذه الحرارة المتوفرة في العديد من المختبرات أو يمكن إنقاذه من المعدات القديمة مثل أشعة الليزر أو مطيافات.

  1. تجميع دائرة تدفق حرارة، هنا، مصنوعة من كتلة الألومنيوم، مع موصلات لحمام الماء كما هو موضح في الشكل 6. ختم الفتحات في أعلى وأسفل وتمكين المراقبة الميدانية مشرق من العينة بالالتصاق غطاء النظارات إلى الكتلة.
  2. الوجه الدائرة تدفق على الجانب حيث سيتم وضع العينة و "الماصة؛" معالجة تجميعية لحوالي 100 ميليلتر من الحل المستخدمة في التجارب وفقا للخطوة 1.8.1. اختيارياً، أدخل تحقيق ألياف بصرية درجة حرارة (مثل مبادرة المسار السريع فيسو-10) أو إضافة صبغة حساسة لدرجة الحرارة في بتركيز مناسب، مثلاً 500 ميكرومتر باء والرودامين
    3. تجميع دائرة المراقبة جيوف الشحوم سيليكون المودعة في الشكل الدائري أو بعض مباعدة الأخرى (PTFE أو المطاط) باستخدام
  3. وختم ذلك مع زجاج غطاء 0.17 ميكرون. التأكد من أن الانخفاض ليس على اتصال بالوكيل الختم أو الفاصلة تجنب إدخال شوائب.
  4. ببطء دورة الجمعية رأسا وتوصيل الحرارة المياه الخارجية بأنابيب مناسبة لها. إيلاء اهتمام خاص لأي تسرب المياه-
  5. مجموعة أدنى المطلوب درجة الحرارة على الحرارة المياه الخارجية والسماح للنظام بحجته حتى يتم قراءة استشعار درجة الحرارة مستقرة؛ والوقت اللازم للموازنة سوف تعطي تقديراً للوقت استجابة الحد الأدنى من النظام-
  6. إجراء تجارب التحكم مرة واحدة على الأقل قبل البدء في استخدام الدائرة.
    1. قياس درجة حرارة الحل (مثلاً مع تحقيق ألياف زجاجية) ومقارنتها للقراءة للحرارة على نطاق درجة الحرارة على الفائدة-
    2. التحقق إزاحة الحد أدنى من القراءة الحرارة والخطي لدرجات الحرارة المقاسة.
    3. التحقق من تدرج درجة الحرارة داخل غرفة المراقبة باستخدام صبغة حساسة درجة حرارة. قياس درجة حرارة الحل عن طريق كثافة fluorescence أو عمر fluorescence التصوير المجهري (فليم) لمسافات مختلفة من كشف الغطاء السفلي 40. بالإضافة إلى ذلك تحقق ما إذا كان هناك أي تدرج درجة الحرارة في منطقة المراقبة جيوف، كما هو مبين في الشكل 7.

6. جيوف الملاحظات في "درجات حرارة متفاوتة"

ملاحظة: عادة، جوفس الأغشية التي يحتمل أن تكون المرحلة-منفصلة والتي تبدو وكأنها متجانسة في مراقبة درجة الحرارة T obs، ستكون المرحلة الفاصلة التي يسببها أدناه تي obs (إذا لوحظ أن يعتمد على درجة الحرارة نطاق التحقيق). العكس بالعكس، فصل مرحلة ينبغي أن تصبح حويصلات متجانسة في درجة حرارة أعلى من تي obs. ومع ذلك، هذا لا يحتاج إلى أن يكون الحال بالنسبة لتركيبة المادة الدهنية (معقدة) خاصة وقد يكون من المثير للاهتمام أن تفحص دائماً نطاق درجة الحرارة موجوداً كله 38. البروتوكول المتعلق بالمراقبة والتقييم للمرحلة الانتقالية درجات الحرارة لا تعتمد على أسلوب معين يستخدم للتحكم في درجة الحرارة-

  1. تجميع الدائرة مراقبة درجة الحرارة وفقا المادة 5، إهمال التحقيق الألياف البصرية درجة الحرارة أو فلوروفوري حساسة لدرجة الحرارة-
  2. تعيين حمام المياه الخارجية إلى درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) والسماح للنظام بحجته عن 10-15 دقيقة
  3. عد عدد حويصلات المرحلة مفصولة باستخدام المعايير من الخطوة 3، 6؛ والمرحلة الشاملة سوف تعطي الدولة السكان جيوف تلميحاً حول المنطقة لدرجة حرارة التحول من النظام. إذا كانت الدولة المرحلة عبر السكان حويصلة غير متجانسة بل انتقل مباشرة إلى الخطوة 6، 5-
  4. زيادة (إذا كانت أغلبية حويصلات مفصولة بالمرحلة) أو نقصان (إذا كانت أغلبية حويصلات متجانسة) درجة الحرارة في فترات الخشنة (مثل 1-2 درجة مئوية) والسماح النظام حجته لحوالي 2 دقيقة إعادة تقييم حالة المرحلة يعني السكان جوف بمن عشوائية العينة وتختلف درجة الحرارة حتى يظهر حالة مرحلة غير متجانسة من السكان حويصلة.
  5. مرة واحدة السكان بالقرب من النقطة من المرحلة الانتقالية (أي الدول المرحلة بين جوفس الفردية غير متجانسة نوعا)، تقليل الفاصل الزمني درجة الحرارة (مثل 0.5 درجة مئوية) لزيادة دقة. السماح للنظام بإعادة تقييم الدولة مرحلة من سكان جوف عن طريق عينة عشوائية، وحجته ل ~ 2 دقيقة.
  6. حالما يتم تمرير هذه النقطة من المرحلة الانتقالية، تبقى متفاوتة درجة الحرارة حتى يتم جوفس جميع الآن متجانسة أو مفصولة بمرحلة، على التوالي.
  7. تحقق للتباطؤ لتقييم ما إذا كانت مرات الموازنة كافية. مسح
    1. تغير اتجاه درجة الحرارة، أنا.هاء إذا تم الفحص لارتفاع درجة الحرارة، القيام المسح بتقليل درجة الحرارة-
    2. اختر على الأقل مجموعة فرعية من درجات الحرارة لتقييم جيوف السكان مرحلة الدولة نسبة (مثلاً 80% فصل المرحلة).
    3. إذا تبين انحرافات كبيرة بين الاتجاهين في نسبة الدولة مرحلة التباطؤ، تقليل حجم الخطوة درجة الحرارة و/أو زيادة الوقت الموازنة في خطوات 6.4 و 6.5.
    4. إذا لم يكن هناك لا التباطؤ المبين بنسب متساوية، النظر في زيادة الوقت الحجم و/أو الموازنة خطوة.
  8. الأرض أن نسب الدولة المرحلة ضد الحرارة. للتحديد الكمي، تناسب البيانات إلى نموذج مناسب ( الشكل 8).
    ملاحظة: تتميز المرحلة الانتقالية منحنيات عادة مسار سيجمويدال ويوفر النموذج بولتزمان سيجمويدال مجموعة مناسبة من المناسب معلمات:
    Equation 1
    y: جزء من الزي/المرحلة-فصل جوفس
    1: قيمة الكسر الأولى
    2: قيمة الكسر النهائي
    T: درجة حرارة
    تي ميكس: درجة الحرارة في النصف الأعلى y
    حيث y هي جزء جوفس متجانسة، ألف 1 و ألف 2 ينبغي أن تكون ثابتة على 0 و 1، على التوالي. كما الامتزاج يفترض الانتقال أن يكون سيجمويدال، حالما يتم قياس قيمة الكسر 0 عند درجة حرارة معينة تعتبر جميع القيم جزء من نطاق درجة الحرارة أدناه أن تكون 0. العكس من ذلك، بمجرد جزء ضئيل القيمة 1 عند درجة حرارة معينة، جميع القيم جزء من نطاق درجة الحرارة المذكورة أعلاه يفترض أن تكون 1.

Representative Results

جوف تورم

ومع اقتراب تورم عفوية الموصوفة هنا، جوفس تتألف من دوبج، الإدارة السليمة بيئياً، وشول كانت تزرع بين عشية وضحاها في 210 ملم السكروز أو 100 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، درجة الحموضة 7.5 تشكل مجموعها مرئية. ويضمن حصاد الإجمالية حويصلة عالية الغلة. استثارة في حل تورم أسفرت عن شروط الحل الغشاء ترانس متماثل. لخلق ظروف غير المتناظر، المجموع كان حراكه في iso-أوسمولار السكروز أو حل الملوحة العالية، على التوالي (الشكل 2). إضعاف الناتج يناظر تبادل حلول شبه خارجي مع التقليل من إضعاف عدد جوفس.

تعيين مخطط المرحلة جوفس استخدام مجهر الأسفار

وجود 0.1 mol % الخاصة بالمرحلة ديك18 في جوفس سمح للمراقبة لدولهم المرحلة عبر الفحص المجهري الأسفار واسع المجال. لوحظت حويصلات العارضة S + L مرحلة الانفصال عن طريق علامة x 63/1.2NA ليتمكن من حل ناعما تنظيم مجالات مثل الإصبع. المتبقية لجميع الحالات، 40 ×/0.6 استخدمت هدف نا. كانت مجموعة لتجنب القطع الأثرية أثناء التفتيش البصري جوفس وإلى أقصى حد إمكانية تكرار نتائج، بعض المعايير التي تحدد فيها حويصلات للنظر في تحليل مرحلة الدولة (الخطوة 3، 6 من البروتوكول).

جوفس أعدت من خلائط دوبج/eSM/تشول الثلاثي لمجموعة واسعة النطاق من نسب منتفخة في الحل الملوحة العالية أو السكروز ولاحظ في درجة حرارة الغرفة معارضها متجانسة لو أو مراحل Ld ولو + Ld وق + L انفصال، انظر الشكل 3. الشكل 9 يوضح الحويصلات نحو المعيبة، التي لا ينبغي أن تدرج في تحليل البيانات ويوضح أيضا كيفية تحديد الحويصلات مولتيلاميلار.

بسبب تاريخهم غير معروف، جوفس من المحتمل أن يحمل داخل دفعة التباين التركيبي35. ومن ثم تقرر الدولة المرحلة الشاملة لتركيبة معينة في مقاربة إحصائية. جيوف السكان على تكوين الدهن معينة كانت تعزى إلى الدولة المرحلة التي لوحظ أن تكون مهيمنة في عينة عشوائية (الخطوة 3، 6 من البروتوكول). حتى الآن، كثيرا ما التراكيب قريبة من منطقة التعايش لو + Ld أسفرت عن دفعات حيث الدولة المهيمنة المرحلة تتكون أغلبية ضيقة. وتكررت التفتيش البصري لمثل هذه الحالات الغامضة، مع مالا يقل عن ثلاث عينات مستقلة. وكان متوسط جزء صغير حويصلات مع الدولة مرحلة مماثلة (مثل فصل المرحلة لو + Ld العارضة) موجودة داخل عينات عشوائية على مدى عدد المحاكمات التي تم اتخاذها كنتيجة نهائية (الشكل 10).

البروتوكولات وصف أسفرت عن نمو جيوف كافية على طائفة واسعة من نسب مختلفة من دوبج، والإدارة السليمة بيئياً، وشول في الحلول عالية الملوحة والسكروز. يمكن تعيين مناطق واسعة داخل المخطط الثلاثي المرحلة ظروف الحل عالية الملوحة متماثل، فضلا عن غير المتناظر (الشكل 11). ونوقشت الاختلافات في سلوك مرحلة حويصلة لاحظ تحت ظروف مختلفة الحل في مكان آخر في التفصيل9.

الملاحظات لسلوك المرحلة بعد exchange المخزن المؤقت كاملة باستخدام الأسلوب موائع جزيئية

تهيئة ظروف الحل غير متماثل بالتخفيف من النتائج في المخلفات الحل تورم خارج. نهجنا موائع جزيئية تسمح لتبادل حل خارجي كامل. ويبين الشكل 5A الجهاز موائع جزيئية جمعت تماما في مرحلة مجهر [كنفوكل] جنبا إلى جنب مع منفذ فلويديك ومداخل التحكم الضغط. أنابيب متصلة عبر أنابيب معدنية 90 ° للسماح بمساحة لأحال ضوء التصوير من أعلى.

للمراقبة داخل الجهاز موائع جزيئية، ومجهر [كنفوكل] مع علامة x 63/1.2NA ونفذ الماء الغمر الهدف العدسة. كما هو الحال مع الملاحظات السابقة في الجزء الأكبر، استخدمت ديك18 لوصمة عار الغشاء. عند إبداء الملاحظات لمرحلة الدولة جوفس المحاصرين في الجهاز، يجب أن الحرص على عدم إساءة تفسير البيانات. نظراً لقرب جوفس إلى الوظائف، قد حظر مسارات الضوء الإثارة والانبعاثات جزئيا بواسطة PDMS مما أدى إلى ظهور كاذبة من المجالات (الشكل 12). هنا، الكشف عن الضوء المنقولة مفيدة للتحقق من موقف جوفس في الوظائف. هذا التأثير غير المرغوب فيه خاصة بارزة جوفس الصغيرة لأقل من 10 ميكرون في القطر. وفي هذه الحالات، قد رفضت البيانات. وتوضح الصورة [كنفوكل] في الشكل 13A مقطع حويصلة مستو يمر هذا مجال لو في حويصلة جيوف. وفي هذه الحالة، مسح المقطع العرضي مستو أخرى أعلى أو أسفل المقطع سوف لا أظهرت المجال نظراً لصغر حجمها بالمقارنة مع الذي يعتبر في حالة مرحلة متجانسة من جيوف، الذي هو لماذا فإنه سيكون قد ضاعت وحويصله. ومن ثم، ينبغي أن تستخدم كدسة z [كنفوكل] لتفتيش كامل سطح جيوف. للفحص المجهري واسع المجال، هذا قد لا يكون مشكلة لأنه يمكن تصويرها حويصلة كله في وقت واحد.

وأخيراً، هي أمثلة جوفس قبل وبعد تبادل للحل الخارجي حيث من الواضح ما هي مرحلة الدول الأغشية هي (الشكل 14). كل جهاز له الدوائر 60 (مع كل زوج من الوظائف إلى اعتراض من جوف واحد)، السماح لعشرات تجارب كل جهاز (انظر الشكل 4). ومع ذلك، قد تضيع بعض جوفس خلال تبادل الحلول الخارجية. وهذا يمكن التقليل من خلال الخطوات التالية: 1) استخدام طلاء ألبومين المصل البقري (BSA) لمنع التصاق جوف/تمزق في الوظائف؛ ويتم طلاء بتعريض جدران غرفة إلى 20 ملغ/مل جيش صرب البوسنة على 60 دقيقة والشطف اللاحقة مع المخزن المؤقت العامل. هو جزيء لاصقة أخرى يمكن أن تستخدم poly(L-lysine)-الاختلاس-poly(ethylene glycol)39. 2) مطابقة ناضح حذراً من الحلول الداخلية والخارجية لتجنب جوفس الرخو، التي يمكن أن تمر من خلال مركز الوظائف أو انفجار جوفس. 3) تحسين إجراءات إعداد جيوف الحصول على حويصلات أكبر من ~ 8 ميكرومتر في القطر لمنع المرور من خلال مركز الوظائف.

تصميم وتوصيف دائرة التحكم في درجة الحرارة لمراقبة جيوف المرحلة الولايات

لقد قمنا بتصميم دائرة تدفق بسيط، الذي يتميز باتصالات للحرارة المياه الخارجية (الشكل 6). حصلناالدائرة طحن كتلة الألومنيوم. وبصفة عامة، لا تحتاج مواد الدائرة أن تكون الحرارة موصلة، كما يقترن العينة إلى حمام الماء بزجاج الغطاء السفلي كما هو موضح في الشكل 6 باء و جيم 6.

صرف النظر عن التصميم الدقيق، ينبغي تقييم أداء الدائرة. على وجه التحديد يمكننا التحقق من الخطي في درجة حرارة العينة مع خارجياً-تعيين درجة الحرارة، أي إزاحة درجة الحرارة منتظمة، وتدرج درجات الحرارة داخل الدائرة. وتناول النقطتين الأوليين بقياس درجة الحرارة مباشرة داخل الغرفة تحقيق ألياف بصرية درجة حرارة (مثل مبادرة المسار السريع فيسو-10). ونحن أيضا فحص لتدرج درجة الحرارة داخل تعليق جوف. هذا تدرج يمكن أن تنبع من تدفق الحرارة إلى خارج الدائرة. قياسات درجات الحرارة مكانياً حلها يمكن الحصول بواسطة fluorophore حساس درجة حرارة40، انظر الشكل 7.

رسم البيانات والمناسب للحصول على تيمزيج من جوفس مفصولة بالمرحلة

التآمر جزء صغير جوفس متجانسة على نطاق درجة الحرارة الملاحظ أسفرت عن مسار نقطة بيانات على شكل سيجمويدالي. نحن تناسب البيانات إلى نموذج بولتزمان (بروتوكول قسم 6.8) التي Tمزيج يمكن استخلاصه (الشكل 8).

Figure 1
رقم 1: الخطوات التجريبية خلال بروتوكول تورم عفوية (اللوحة العلوية) مع مرحلة المقابلة لنمو حويصلة (أسفل اللوحة). فيلم متجانسة في الدهون (A) A هو ينتشر على صفيحة PTFE خشن والمجففة من أي مذيب. فيلم (ب) الدهن المجفف ثم منتفخة مسبقاً في أجواء مشبعة المياه داخل حاوية مغلقة مع المياه لتسهيل ترطيب بلير. يحتوي على لوحة PTFE القنينة الزجاجية باطلة ولا يزال مفتوحاً أثناء هذه الخطوة ترطيب. (ج) دهن منتفخة قبل الفيلم أخيرا يصبح رطب تماما بإضافة الحل المنشود تورم على لوح PTFE المغلفة بالدهن داخل القنينة الزجاجية. لتجنب التبخر، قنينة زجاجية مختومة بشكل صحيح أثناء الاحتضان بين عشية وضحاها. للتقليل من الاختلافات التركيبية داخل مجموعة، تحتاج جميع الخطوات تتم عند درجة حرارة حيث خليط الدهن الامتزاج الكامل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: جوف الحصاد. الفيلم الدهن (A) A التي تودع تتألف من دوبج/eSM/تشول في نسب المولى من 20/60/20 مع 0.1 mol % ديك18 كان متورما في المخزن المؤقت للملوحة العالية تتألف من 100 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، 7.5 درجة الحموضة. بالإضافة إلى ذلك أغلقت غطاء حاوية الزجاج مع الفيلم البارافين. المنطقة المكبرة لمصلحة يحتوي على مجموع جيوف الناتجة عن ذلك. مظهره الأحمر نتيجة لوجود ديك18. كانت تحصد "جوفس" (ب) مع تلميح ماصة مبتوراً. في هذه الصورة، بيبيتيد الإجمالي يصل جنبا إلى جنب مع 50 ميليلتر من تورم الحل، التي نقلت إلى قنينة جديدة. (ج) إنشاء غشاء العابرة غير المتناظر شروط الحل، قد تضعف الإجمالية في حل خارجي آخر متساوي التوتر. هنا، مجموع جنبا إلى جنب مع 50 ميليلتر تورم الحل كان حراكه في 950 ميليلتر محلول السكروز أدى إلى إضعاف 20 x الحل تورم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: جوف التصوير- حقل واسع fluorescence صور جوفس يخدر مع 0.1 mol % دييك18 أعد ولاحظ في الملح متماثل أو حلول السكروز تتكون من نسب مختلفة من دوبج، والإدارة السليمة بيئياً، وشول (في المخزن المؤقت الملح، من اليسار إلى اليمين: 40/20/40؛ 50/20/30؛ 30/60/10؛ في السكروز، من اليسار إلى اليمين: 30/30/40؛ 20/60/20؛ 40/50/10). الصور تصوير جوفس في مختلف الدول مرحلة (التعايش) وفقا للمعايير الواردة في البروتوكول خطوة 3.6 المقررة. هنا، تم تصويرها حويصلات من خلال 40 ×/0.6 هدف نا. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تخطيط لتصميم القناة موائع جزيئية. أدخل جوفس فلويديك الطبقة السفلي (القنوات المحددة) عبر المدخل أسفل خزان. عامل تصفية كتل الحطام غير المرغوب فيها من الجهاز. أنهم ثم إدخال مجموعة واسعة دوائر 60 (8 صفوف وأعمدة 15) كل الوظائف التي تحتوي على واحد جيوف التقاط (راجع إدراج). يمكن أن تكون كل غرفة معزولة داخل صمام خاتم دفعتها طبقة تحكم (قنوات السوداء شغلها) فوق طبقة فلويديك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الجهاز موائع جزيئية. (أ) صورة لجهاز موائع جزيئية يستخدم لاعتراض جوفس واحدة وتبادل تماما الحل الخارجي. تسميات تشير إلى الخزان لإضافة الحلول (1)، 8 × مداخل الضغط تتصل ضغط التحكم وحدة (2)، ومنفذ فلويديك المحاقن ومضخة (3). تظهر لوحة (ب) وحدة مراقبة الضغط يضم 8 صمامات كل تنظيم 1 أنبوب متصل بالجهاز موائع جزيئية. هنا صمامات #1 و #2 مفتوحة وبالتالي يتم إغلاق الصمامات خاتم المقابلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: دائرة مراقبة درجة الحرارة- (أ) الدائرةأمام الجمعية العامة. (ب) الدائرة أسيمبليد (التي تواجه صعودا) مع 2 مم غطاء النظارات لصقها إلى أعلى وأسفل. فاصل المطاط البرتقال تدابير 0.5 مم في الارتفاع ومختومة مع زلة غطاء 0.17 ملم للمراقبة لتعليق جيوف المغلقة. في هذه الصورة يتم إدخال مجس درجة حرارة لأغراض المعايرة (الألياف براون إنهاء الدائرة على اليمين). (ج) التجميع النهائي في مرحلة المجهر المقلوب دون مسبار درجة الحرارة. تواجه الآن مباعدة المطاط البرتقالي أسفل. المطاط مادة لاصقة ما يكفي لعقد العينة في المكان. لاحظ أن الضوء يمكن أن تنتقل من خلال نموذج تمكين برنامج التحصين الموسع-الأسفار والملاحظات الميدانية مشرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: الحصول على بيانات درجة الحرارة مكانياً حلها داخل غرفة المراقبة بقياسات فليم من صبغة حساسة درجة الحرارة (هنا: 500 ميكرومتر ب والرودامين) 40-نقاط البيانات التي تم الحصول عليها في 0 و 10، 30، 300 و 400 ميكرون أعلاه بكشف الغطاء السفلي. نقاط البيانات الأحمر والأزرق التي قيست لدرجة حرارة حوض ماء تعيين في 30 درجة مئوية و 12 درجة مئوية على التوالي. نقاط سوداء البيانات تشير إلى اليسار حمام الماء لحجته إلى درجة حرارة الغرفة. لاحظ الاختلافات الصغيرة درجة الحرارة في جميع أنحاء الدائرة ولكن بقي أقل من 0.5 درجة مئوية (الأشرطة الرمادية). ارتفاع مجموع الدائرة هو حوالي 500 ميكرومتر وفقا لسمك مباعدة (انظر أعلاه). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: تحديد درجة الحرارة الامتزاج. يظهر الرسم البياني نقاط البيانات الفردية متجانسة (دولة واحدة والسائلة) جزء صغير جوفس أعدت من دوبج/eSM/تشول في نسبة 30/40/30 يخدر مع 0.1 mol % ديك18 من ثلاث عينات عشوائية مستقلة (N = 20-40). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي للوسائل. تم تركيب نقاط البيانات بولتزمان نموذج الموضحة في الخطوة 6.8 (الخط الأسود المستمر) مجال خلط درجة الحرارة Tمزيج كان استخلاصه منه (خط اتبع الأحمر المستمر للإحداثي السيني) وفقا لنصف الحد الأقصى سيجمويدال منحنى على التنسيق (خط أسود متقطع). تم إصلاح القيم الأولية والنهائية (1 و2) إلى 0 و 1، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: حويصلات معيبة. أمثلة من حويصلات العملاقة أعد من 20/60/20 دوبج/eSM/تشول ويخدر مع 0.1 mol % إذا دييك18 التي لا تفي بالمعايير المحددة في الخطوة 4.2 تصويرها بالمجهر الأسفار واسع المجال. كانت الأمثل كثافة عرض نطاقات من الصور الفردية لشدة الأسفار حويصلة يصور في كل مرة. بسبب وجود مواد إضافية الغشاء وحويصلات صغيرة مغلفة، لا يمكن تعريف الدولة مرحلة من حويصلة في (أ) بوضوح. مظهر هذه حويصلة العملاقة لا تسمح لأي تفتيش بصري موثوقة لاميلاريتي. لوحة (ب) يصور حويصلة منها الداخلية غير مزدحمة مع مواد الغشاء. نتيجة لذلك، يتم فرضه إشارة الأسفار من الغشاء الخارجي حويصلة مع الإشارات الداخلية، مما يجعل من المستحيل تصور لاميلاريتي والمجالات المحتملة. (ج) ترد كثافات الأسفار من ثلاث حويصلات عملاقة مختلفة في المقارنة المباشرة داخل نطاق كثافة العرض نفسه. هذه الصورة يبين أنه يمكن تحديد الحويصلات مولتيلاميلار العملاقة (1، 2) إشارة fluorescence زيادة بالمقارنة مع جيوف (3). هنا، مولتيلاميلار، فضلا عن المعرض حويصلات العملاقة أونيلاميلار لو + Ld مرحلة الانفصال. حويصلات في جميع الصور تم تصويرها عن طريق 40 ×/0.6 هدف نا. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
رقم 10: فصل جزء مرحلة لو + Ld جوفس بلغ على الأقل ثلاث عينات مستقلة. حويصلات تتألف من 30/40/30 دوبج/eSM/تشول القريبة من الحدود لمنطقة التعايش لو + Ld. أشرطة الخطأ لظروف متماثلة السكروز توضح نثر دفعة لدفعة. تسمية التنسيق وصف الحلول داخل/خارج الحويصلات؛ السكروز: السكروز 210 مم؛ الملح: 100 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ أشرطة الخطأ تشير إلى الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
رقم 11: رسم تخطيطي للمرحلة جوفس أعدت من دوبج، الإدارة السليمة بيئياً، وشول معين تحت ظروف مختلفة حل استخدام السكروز 210 ملم (السكروز) و 100 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس، درجة الحموضة 7.5 (الملح)- المرحلة جيوف الدول وبحثت في السكروز/السكروز (A؛ والقسم العلوي)، السكروز/الملح (داخل/خارج) (A؛ وقسم متعدد الأضلاع السفلي)، الملح/الملح (ب؛ والقسم العلوي)، والملح/السكروز (ب؛ وقسم متعدد الأضلاع السفلي). وتوضح الرسوم الكاريكاتورية نمط المجال المهيمن داخل المقاطع المميزة وشروط الحل المطابق. حويصلة مرحلة الدول الممثلة في أقسام متعدد الأضلاع السفلي لوحظت ظروف الحل غير متماثل إلى تمييع جيوف x 20. مقتبس من مرجع9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الشكل 12: التحف جوفس المحاصرين. مثال جيوف صغيرة حيث يمكن رؤية مجال خاطئة نظراً للقرب الوثيق مع الوظائف (دوبج/eSM/تشول 60/20/20). المشرق-الميدان أحال صورة الخفيفة عرض الوظائف (grيتم تراكب ey) مع الصورة الأسفار [كنفوكل] من جوف (برتقالي). وتعتبر الوظائف لإنشاء نمط تدخل في صورة مشرقة الميدانية. الأسفار إشارة قريبة هو تخفيض الوظائف (يمين) مما يعطي مظهر انفصال. شريط المقياس = 5 ميكرومتر.

Figure 13
الشكل 13: أمثلة من اثنين جوفس مختلفة استولت عليها الوظائف PDMS حيث الدول مرحلة تكون مرئية بوضوح. (أ) لو + Ld المرحلة حويصلة المنفصلين عن ذويهم من دوبج/eSM/تشول 60/20/20. (ب) حويصلة من 40/30/30 العارضة دينار أو لو أحادي الطور. تم فحص [كنفوكل] z-كومة من حويصلة كله للتأكد من أن أية مجالات (خارج نطاق التركيز) كانوا حاضرين. وينظر إلى حواف الوظائف على الجانب الأيمن من الصور (رمادي). شريط المقياس = 5 ميكرومتر.

Figure 14
رقم 14: السلوك الناتج من المرحلة بعد تبادل فلويديك كاملة باستخدام جهاز موائع جزيئية. نفس جوف يرد على حد سواء قبل وبعد تبادل الحلول على () متماثل الملح/الملح (داخل/خارج) للملح/السكروز (داخل/خارج) (دوبج/eSM/تشول 60/20/20، هو شريط مقياس 2 ميكرومتر) و (ب) متماثل السكروز/السكروز (داخل/خارج) إلى السكروز/الملح (في الخارج) (دوبج /eSM/تشول 30/40/30، مقياس بار = 3 ميكرومتر). مقتبس من مرجع9.

Discussion

النجاح في إنتاج جوفس لمرحلة الدولة الملاحظات تحت ظروف الملوحة العالية المتماثلة وغير المتماثلة

البروتوكولات المقدمة هنا يقدم استراتيجية لتقييم تأثير الملوحة العالية المخزن المؤقت وحل عدم التماثل في حالة المرحلة غشاء جوفس مشحونة عبر طائفة واسعة من التراكيب. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه تحقيق هذا الهدف تم إنتاج جوفس مشحونة في المخازن المؤقتة للملوحة العالية.

ونحن بنجاح جوفس في محلول السكروز والعازلة عالية الملوحة التي تنتجها نهجاً تورم عفوية بسيطة، الذي يتضمن خطوة ترطيب قبل الفيلم الدهن المودعة وخطوة ترطيب نهائي بين عشية وضحاها لنمو حويصلة. من المهم ملاحظة أن ترسب الدهون وينبغي أن يتم على لوحة PTFE خشن لضمان انتشار المادة الدهنية حتى تؤتي الحويصلات أونيلاميلار. وعلاوة على ذلك، من الضروري تنفيذ كل خطوة أثناء إعداد حويصلة عند درجة حرارة حيث يكون الفيلم الدهن في حالة مرحلة متجانسة والسوائل. آخر، يمكن بوليديسبيرسي في تكوين السكان حويصلة والتحيز تحليل الدولة المرحلة النهائية من السكان. بروتوكول معين تورم عفوية من غلة جوفس أجمة حويصلة فيها من ناحية توفر إمكانية إعادة تعليق ذلك بكميات صغيرة للحصول على التركز الشديد تشتت حويصلة، ومن ناحية أخرى يوفر حلاً غير متماثل الشروط عبر الغشاء مع التقليل من التخفيف من حويصلات8،28. من الضروري أن خلال تمييع حويصلة أو حل خارجي تبادل، الداخل وخارج أوسمولاريتيس تظل متطابقة كما قد حمل مورفولوجيا التغييرات الناجمة عن عدم التطابق الاسموليه أو منع لو + Ld مرحلة الفصل41 ، أو في حالة ناقص التوتر الظروف، قد تؤدي إلى انفجار حويصلة.

هنا، أسفرت المحاولات الرامية إلى تحسين البروتوكولات اليكتروفورميشن في الحل الملوحة العالية إنتاج لا جوفس بينما تورم بولي-بمساعدة أسفرت عن الحويصلات مولتيلاميلار. على الرغم من أنه يتطلب وقت أطول للتحضير والنتائج على دفعات حويصلة من نوعية أدنى10،17، والنجاح في إنتاج الحويصلات مشحونة بعفوية وتورم يأتي مع مزايا إضافية. ويطالب بالحد الأدنى من الجهد بينما أسفر عن عائدات كافية للتحليلات الإحصائية دفعة، واشترط على عكس اليكتروفورميشن، لا معدات متطورة أو التحسين. وعلاوة على ذلك، لم يلاحظ أي التلوث باكسدة الدهن42،43. ووفقا للأدب لا توجد اختلافات بين التراكيب الدهن من حويصلات والأرصدة المقابلة من حيث أنها كانت تزرع7،17. وعلاوة على ذلك، لا يطالب تكوين حويصلة على الركازة PTFE إدراج أي التلوث خلافا لأساليب تورم جل المساعدة حيث يمكن إدخال الجزيئات الأجنبية من الركازة23. ويأتي اليكتروفورميشن مع زيادة العيوب المتصلة بإضعاف حويصلة المفرط عند إنشاء شروط الحل غير متماثل. جوفس اليكتروفورميشن التي تنتجها موجودة عادة تشتت متجانسة (على النقيض من تعليق حويصلة مركزة للغاية في شكل أجمة تشكلت خلال تورم عفوية). أي تمييع الحل الخارجي يضعف إلى حد كبير عدد الحويصلات كذلك. وعلاوة على ذلك، على مدى هذا العمل فقد لوحظ أن جوفس دوبج/eSM/تشول تنتجها اليكتروفورميشن في السكروز أصبحت غير مستقرة إذا كانت مخففة في المخزن المؤقت للملوحة العالية. الأسفار من بقع الدهون على الشريحة المجهر أشارت إلى أن الحويصلات سوف انفجر قبل انتهاء التفتيش البصري لم يكن ممكناً. يمكن أن يعزى عدم الاستقرار هذا إلى توتر غشاء مرتفعة من حويصلات أعده اليكتروفورميشن بالمقارنة مع تلك التي حصل عليها تورم عفوية10.

على الرغم من أن إضعاف حويصلة نهج سهلة وسريعة لإنشاء ظروف الحل جيوف غير المتناظر، تنجز بتبادل حل جزئي خارجي، فقط لو بنسبة عالية (هنا: 95%، الشكل 2)، وإلى تمييع، آثار وستظل تورم الحل. اختيار درجة تبادل الحلول الخارجية هو مفاضلة بين بيبيتينج حتى أجمة حويصلة جنبا إلى جنب مع الحل تورم (القسم 2) وعدم إذابته كثيرا. ومن ثم، قمنا بعرض نهج بديلة موائع جزيئية مناقشتها في مكان آخر في التفصيل37 التي تسمح لتبادل حلول خارجية سريعة وكاملة خلال المرحلة جيوف الدولة الملاحظات للتحقق من ملاحظات الدولة المرحلة لتمييع حويصلات. ولوحظت الملاحظات من مرحلة الدولة الاختلافات عند تغيير من متماثل لشروط الحل غير المتناظر الواقع متفقة. بالإضافة إلى ذلك، كل الأساليب إيجاد حل غير المتناظر الشروط المبينة هنا هي سريعة نسبيا (مقارنة الرقم8)، وتأتي مع أي مخاطر معروفة لتغييرات التكوين المحلي (قارن الإشارات30،31)، زيادة في التوتر الغشاء (قارن الإشارة32)، أو التدفئة المحلية (قارن مرجع33)، أما بالنسبة للأساليب البديلة وناقش في المقدمة. أثناء محاصرة موائع جزيئية، توازن ناضح بين حويصلة الداخلية والخارجية ليست ضرورية فقط لتجنب مرحلة الدولة القطع الأثرية كما ذكر أعلاه ولكن أيضا الانكماش الناجم عن ظروف الحل مكثف قد يسبب جوفس المحاصرين كشف من خلال الوظائف بعد تبادل حلول خارجية.

على الرغم من أن تورم عفوية قد طبقت بنجاح أن ينمو بدون تهمة حويصلات من نظام شول/دوبك/الإدارة السليمة بيئياً، وفي حالات أخرى، عدم وجود تهم قد تنال من جيوف تورم نظراً لعدم الناتجة من التنافر بين بليرس الفردية44 . تمديد فترة ما قبل تورم أو إدخال هيدجروبس دهن ضخمة قد مواجهة هذه المسألة45. وعلاوة على ذلك، قد تختلف استقرار حويصلة بعد إضعاف بحلول مختلفة عن تلك المستخدمة تورم للتراكيب المختلفة الدهن وتمييع وسائط الإعلام، ونحن لم التحقيق هنا. ونحن أيضا لم تستكشف إمكانية ضبط القطر جوف متوسط مع طريقة إعداد المقدمة هنا. ولكن المعلمات مثل تكوين حويصلة وتورم الحل من المحتمل أن تؤثر على النتائج. قد تسفر عن تطبيق أساليب بديلة46 حويصلات أكبر للدهون والحلول المستخدمة هنا، بيد أنها قد تأتي مع العيوب الأخرى المرتبطة بهذه الطريقة. يوفر النهج المبين أعلاه لإنتاج جوفس في ظروف الملوحة العالية المتماثلة وغير المتماثلة أداة محتملة لإجراء مزيد من الدراسات حويصلات مكونة من التراكيب المختلفة الدهن وتفرقوا في وسائل الإعلام المختلفة. كما أننا لم تستكشف هذه الإمكانيات، والمحاكمات في المستقبل سوف تظهر عموما كيف يمكن تطبيق أساليب إعداد وتمييع جيوف.

مراقبة المرحلة فصل في درجات حرارة متفاوتة

وتوجد الأجهزة تجريبية مختلفة مناسبة لدراسة جوفس في درجات حرارة متفاوتة. بينما هذه الأجهزة عادة لا وصف بالتفصيل داخل الأدب، يعرض العمل الحالي جمعية أساسية المنطبقة على مثل هذه الدراسات.

قياسات التحكم تظهر أن درجة حرارة هذا المنزل صممت وصنعت الدائرة تحديداً يسيطر الحرارة وتدرجات حرارة داخل الدائرة ضمن القرار درجة الحرارة التجريبية. أنه يكفل أن الظروف الحرارية التجريبية تتسق مع قراءة الحرارة.

خلال تقييم جيوف المرحلة الدول عبر نطاق واسع من درجات حرارة، من المهم أن الحويصلات ملاحظتها هي اكويليبراتيد جيدا بعد أن تم تغيير درجة الحرارة. إحدى الطرق الممكنة لضمان ذلك هو التحقق من التباطؤ. إذا كان التباطؤ الحالي، ينبغي أن تراجع الخطوات درجة الحرارة و/أو زيادة مرات الموازنة. كدرجة الحرارة تأسيس التحكم في هذا العمل بالحرارة المستندة إلى الماء، يقتصر نطاق درجات الحرارة العامل مثالي 0-100 درجة مئوية. هذا ويمكن توسيع النطاق باستخدام السوائل الأخرى مراقبة درجة الحرارة مثل النفط أو عن طريق استخدام الأجهزة الأخرى، مثل جهاز بلتيير. في الممارسة العملية، كما يحد درجة حرارة العامل التكثيف ممكن أو التبخر. وبالإضافة إلى ذلك، حدوث تدرج درجة الحرارة ثابت الدولة عبر دائرة المراقبة لدرجات الحرارة بعيداً عن درجة حرارة الغرفة، يصبح أكثر احتمالاً. أيضا، قد أضرت معدات التصوير في درجات الحرارة القصوى. لنطاقات درجة الحرارة النموذجية الملائمة للدهن حويصلة الدراسات (~ 10-50 درجة مئوية7،9) ينبغي النظر في الأضرار التي لحقت معدات للمراقبة لكن عادة ليس من المتوقع.

حويصلة مجال المراقبة الفنية

وهناك عدد من المصادر لمراقبة القطع الأثرية باستخدام مجهر الأسفار واسع المجال. أولاً وقبل كل شيء، واحد ينبغي أن يكون علم أن يحدد الحد الأقصى للقرار صاد للكائن تطبيق للتفتيش البصري للدول مرحلة حويصلة حد الكشف عن مجالات الدهن وفقا ل:
Equation 2
λ هو الطول الموجي الانبعاثات، حيث NA هو الفتحة الرقمية للهدف. هدفا نموذجية مع 40 x التكبير ونا من 0.6 الذي يكتشف الانبعاثات خضراء خفيفة حوالي 560 نانومتر ستصل الدقة بصرية من ~0.6 ميكرومتر. ومن ثم، الدراسات التي تقارن بين الدول مرحلة من حويصلات مصنوعة من خلائط الدهن خاصة بين مختلف شروط يجب استخدام نفس الهدف لخليط دهن نفسه.

قطعة أثرية أخرى هو حدوث مجالات الدهن نتيجة للتأكسد الدهن نتيجة تعرض لمدة طويلة للإثارة الخفيفة41. صور--الضرر يحدث تفضيلي على الهيدروكربونات غير المشبعة دهن مويتيس. وفي الواقع، بعض التراكيب الدهنية، مثل تشكيل المجال من حويصلات متجانسة في البداية فقد لوحظ هنا بعد فترة طويلة من التعرض للضوء للإثارة (~ 30 ثانية). وللتصدي لهذه المسألة، أبقى على ضوء الإثارة مركزة في حقل واحد لعرض لبضع ثوان فقط لتقييم مرحلة الدولة. ومن ثم، كان ديك18 مناسبة لأغراضنا. الأصباغ الأخرى، ومع ذلك، قد تكون أكثر حساسية وقد تحتاج إلى معالجة في أدنى درجات الإثارة ومع الإثارة أقصر التعرض للضوء مرات.

يحتمل أن تختلط إجهاد القص الميكانيكية من نقل ماصة الحويصلات المجالات مؤقتاً، مما يشوه سلوك مرحلة حويصلة الظاهر. لبعض دفعات، أظهرت حويصلات مختلف السلوكيات مرحلة مختلفة 0 دقيقة و 5 دقائق بعد ماصة نقل إلى ساترة المجهر. كما ثبت القص الإجهاد الناجم عن تدفق السوائل في الجهاز موائع جزيئية ينتج المجال خلط47. ينبغي أن تترك حويصلات دون عائق لكمية كافية من الوقت للموازنة قبل الملاحظة. ضمن هذه الدراسة، تركت حويصلات المحاصرين على الجهاز موائع جزيئية دون عائق ح 1 بعد تحميل حويصلة والتبادلات الحل قبل الملاحظة.

لتجنب بعض الصعوبات المذكورة أعلاه، فضلا عن القيود المفروضة بالحد حيود الضوء، والطرق البديلة مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي48 أو تقنيات الفحص المجهري سوبر القرار49 يمكن استخدامها.

الاستنتاجات والتوقعات

ويوضح عمل قدم مجموعة من الأساليب التي تسمح لتحليل تأثير ظروف الملوحة العالية الحل المتماثلة وغير المتماثلة على انفصال الغشاء. الأساليب المقدمة كلها مناسبة لتطبيقات أخرى. على سبيل المثال، يوفر الجهاز موائع جزيئية منبرا لدراسة حركية تشكيل المجال والاختفاء عند تنظيم دورات تعريفية لحل عدم التناظر. أيضا، يمكن دراسة المظهر المجال كدالة لتركيز الملح بهذه الطريقة. يمكن أيضا استخدام كافة الأساليب للبحث في تأثير على سلوك مرحلة استخدام أي حلول أخرى للفائدة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل هو جزء من اتحاد ماكسسينبيو، الذي تموله الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث الألمانية وجمعية ماكس بلانك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt Avanti Polar Lipids 840475C abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860061 abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %) Avanti Polar Lipids 700000 abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Molecular Probes D-282 abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) Merck
NaCl (> 99.8 %) Roth
HCl (37 %) Roth
Tris (≥ 99.9 %) Roth
Sucrose (≥ 99.5 %) Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL Kimble Soda flat bottom, white screw cap
pH meter Mettler Toledo MP220
Osmometer Gonotec Osmomat030
Epi-fluorescence microscope Zeiss Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA Zeiss LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA Leica 506174
Objective 63x, 0.9 NA Leica 506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläaser
Parafilm "M" Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL Braun
0.45 µm syringe filter GVS North America Cameo 25AS, 1213723 Acetate, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Tags

الكيمياء، المسألة 128، الحويصلات أونيلاميلار العملاقة، اتهم الأغشية، عفوية تورم الأسلوب، عدم التماثل الحل transmembrane، ميكروفلويديكس، المجالات غشاء، سائل اضطرابه المرحلة السائلة أمر المرحلة، مرحلة التعايش، مثلث جيبس، امتزاج الحرارة والأسفار والفحص المجهري [كنفوكل]
مرحلة السلوك من حويصلات مشحونة بظروف الحل المتماثلة وغير المتماثلة رصدها بالفحص المجهري الأسفار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubsch, B., Robinson, T.,… More

Kubsch, B., Robinson, T., Steinkühler, J., Dimova, R. Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56034, doi:10.3791/56034 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter