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Chemistry

Comportement de phase des vésicules chargées dans des Conditions de Solution symétrique et asymétrique suivies avec la microscopie en Fluorescence

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56034
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

Summary

Expériences sur les vésicules unilamellaires géant phase séparée (GUVs) négligent fréquemment des conditions de solution physiologique. Cet ouvrage présente des approches pour étudier l’effet de la forte salinité tampon sur la séparation de phase liquide-liquide dans GUVs multicomposants chargées en fonction de l’asymétrie de solution membranaires et la température.

Abstract

Des vésicules de phases séparées géant unilamellaires (GUVs) présentant la coexistence ordonnée liquide et liquide-désordonnée des domaines sont un outil commun et biophysique pour enquêter sur l’hypothèse de radeau lipidique. De nombreuses études, toutefois, négligent l’impact des conditions de solution physiologique. Pour cette raison, les travaux en cours présente l’effet d’asymétrie de solution tampon et membranaires forte salinité sur la séparation des phases liquide-liquide dans GUVs chargées est passées de dioleylphosphatidylglycerol, œuf sphingomyéline et cholestérol. Les effets ont été étudiés dans des conditions de température isotherme et variables.

Nous décrire l’équipement et des stratégies expérimentales applicables pour la surveillance de la stabilité des coexistants domaines liquides dans les vésicules chargées dans des conditions symétriques et asymétriques solution forte salinité. Cela inclut une approche pour préparer chargées GUVs multicomposants à forte salinité tampon à haute température. Le protocole suppose la possibilité d’effectuer un échange partiel de la solution externe en une étape simple dilution tout en minimisant la dilution de la vésicule. Une autre approche est présentée en utilisant un dispositif microfluidique qui permet un échange complet de solution externe. Les effets de la solution sur la séparation de phase ont été également étudiés sous des températures différentes. À cette fin, nous présentons la conception de base et l’utilité d’une chambre de contrôle de température intégré interne. En outre, nous réfléchissons sur l’évaluation de l’état de phase GUV, pièges associé et comment contourner.

Introduction

Depuis l’observation des domaines taille micron dans les vésicules de liquide-liquide phases séparées géant unilamellaires (GUVs) par microscopie de fluorescence, GUVs ont été utilisés comme un système modèle pour étudier les lipides radeau hypothèse1,2 , 3 . Comme la zone de leur bicouche autoportantes compris dans une fourchette de celle des cellules biologiques, ils sont adaptés imite des membranes plasmiques mettant en vedette les radeaux hypothétiques. De nombreuses études sur ces GUVs ont été réalisées avec des vésicules entraînés par l’eau pure, saccharose ou des solutions de faible salinité4,5,6,7,8. Ces conditions, cependant, ne reflètent pas physiologiquement pertinente exposition des biomembranes aux environnements de forte salinité et l’asymétrie de solution membranaires comme le sont les conditions pour les cellules.

Dans ce travail et dans une publication précédente du notre groupe9, les États de phase de GUVs multicomposants chargées ont été examinés en fonction de la présence d’une asymétrie de sel et de la solution à travers la membrane. GUVs sont préparés à partir de mélanges de différentes proportions de cholestérol (Chol) dans une solution de saccharose (avec osmolarité de 210 mOsm/kg) ou tampon de forte salinité (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210, oeuf sphingomyéline (eSM) et dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) mOsm/kg). Le choix des lipides était justifié par les résultats déjà obtenus sur le diagramme de phase de ce mélange6,8.

Un certain nombre de méthodes pour la préparation de GUVs est disponible dans la littérature10,11,12 (noter qu’ici, nous ne considérerons pas ceux impliquant le transfert de lipides d’une base d’huile à une phase aqueuse 13 , 14 en raison du danger inhérent des résidus de pétrole restant dans la membrane qui peut affecter le comportement de phase). La préparation de GUVs dans un tampon de forte salinité est associée à des défis particuliers. Pour des solutions de faible force ionique, l’electroformation méthode15,16 présente une façon rapide de préparer GUVs avec des rendements élevés avec petits défauts10,17. La méthode s’inspire de déposer une couche de lipides sur une surface conductrice (l’électrode), sécher et les hydratant avec une solution aqueuse tout en appliquant un champ AC. Toutefois, cette méthode requiert ajustements si le sel est présent dans la solution aqueuse18,19. Il est supposé que la force motrice pour la croissance de la vésicule par electroformation est électro-osmose16 qui est entravé à conductivité élevée20. Electroswelling de GUVs dans les solutions de forte salinité n’est donc pas une approche directe car elle nécessite optimisation pour différentes concentrations de sels présentes dans la solution de gonflement. Gel-assisted vésicule gonflement21,22 est une alternative possible à electroformation avec des temps de formation encore plus rapides. Cette approche s’appuie sur l’hydratation du film lipidique accrue lorsqu’un gel (agarose ou alcool polyvinylique (PVA)) est utilisé comme substrat. Ces approches, viennent toutefois, avec le risque de contamination de la membrane dans le cas d’agarose gonflement23 et/ou température limites fondées comme dans le cas de gonflement base PVA. De même, un protocole de croître GUVs sur un substrat de papier de cellulose a été récemment établi24. Questions d’ordre générales de cette méthode sont le manque de contrôle sur la pureté du substrat, ainsi que l’utilisation de grandes quantités de lipides. Dans ce travail, nous introduirons et présenter les avantages de la méthode plus traditionnelle de GUV préparation, à savoir la spontanée gonflement méthode25,26. Il se compose d’une couche de lipides sur un substrat lipophobes, il hydratant dans l’atmosphère de vapeur d’eau et gonflement ultérieur dans la solution recherchée de gonflement de séchage (voir Figure 1 et les détails dans la section protocole). Cette méthode n’offre pas de contrôle sur la distribution de taille des vésicules et se traduit par des vésicules dans l’ensemble plus petites par rapport aux méthodes où la production est assistée par champ électrique, support en polymère ou microfluidique :. Cependant, la qualité de la vésicule et la taille est appropriée pour l’examen de l’état de phase de membrane comme exploré ici.

Création d’asymétrie entre les solutions à travers la membrane de la vésicule est associé à certains défis aussi bien. Une approche couramment utilisée est la dilution directe de la suspension de vésicules dans la solution externe désirée27,28. Toutefois, cela diminue aussi la densité de distribution de vésicule. Une autre stratégie consiste à échanger lentement la solution externe autour GUVs s’installe au fond d’une cellule d’écoulement qui permet à la solution in - et excrétion. Pour éviter de déranger ou même perdre les vésicules avec le flux, faibles débits sont appliquées8, ce qui rend cette approche temps-inefficace. En outre, aucune de ces approches garantit exchange solution complète externe. Une solution évidente consiste à immobiliser des vésicules afin d’éviter de les perdre lors d’un échange de solution externe. Par exemple, biotinylé GUVs peut être attaché sur une surface streptavidine29. Toutefois, cette approche peut conduire à des variations de compositions à la collés et donc la membrane non-respecté segments de30,31. L’application de magnétique ou les champs électriques pour piéger les résultats de vésicules en imposant la membrane tension32. Employant des pinces optiques pour piéger une vésicule, il faut avoir une poignée attachée (c'est-à-dire une perle), tandis que l’utilisation des traverses optiques peut impliquer des locaux chauffage33. Piégeage de GUVs peut également être réalisé en les élevant sur des fils de platine sans détachement final34. Cela donne toutefois des vésicules qui ne sont pas isolés et qui sont généralement connectés aux câbles ou autres vésicules de tubes minces lipidique (sangles).

Le travail présenté met en évidence des stratégies pour surmonter les limitations susmentionnées. Nous présentons d’abord une description détaillée de la méthode de gonflement spontanée adapté et optimisé pour la production de GUVs dans des tampons de forte salinité. Puis, nous présentons deux approches pour créer efficacement les conditions de la solution asymétrique par simple dilution ou l’utilisation d’un dispositif microfluidique. Parce que notre objectif est l’analyse de l’état de phase de membrane de GUVs dans des conditions différentes solution, les sections suivantes décrivent critères d’analyse statistique réussie et présents conseils pour éviter la catégorisation fausse.

Les analyses ont été effectuées dans des conditions isothermes, ainsi que sous des températures différentes. Alors que c de la températureontrol est couramment employée, détails sur chambres expérimentales de contrôle de température sont rarement décrits. Ici, une configuration interne construite à observer GUVs aux diverses conditions de température est présentée.

Protocol

1. gonflement spontané de GUVs

Remarque : chloroforme est une substance nocive, qui est très volatile. Effectuer toutes les opérations impliquant le chloroforme sous une hotte aspirante. Ne pas utiliser le matériel de laboratoire en plastique tels que pointes de pipette ou de contenants de plastique pour le transfert et/ou le stockage des solutions de chloroforme. Chloroforme dissout en plastique, qui contamine la solution. Utiliser des seringues de verre et les bouteilles de verre à la place. En outre, travailler aussi propre que possible pour éviter l’introduction d’impuretés comme ils peuvent interagir avec les membranes. Notez que les concentrations de lipides typique dans les derniers préparatifs de GUV sont dans la gamme micromolaire, ainsi les impuretés dans cette gamme de concentration pourraient avoir un effet important sur le comportement de la membrane.

  1. En dehors de l’équipement de base, disposez des éléments suivants prêts.
    1. Prepare un polytétrafluoréthylène (PTFE, communément appelé téflon) plaque pour les dépôts de lipides de taille ~1.5 cm x 1,5 cm et d’épaisseur appropriée. Poncer la plaque sur une face avec papier abrasif fin.
      Remarque : PTFE est lipophobes et ne va pas être mouillé par solutions de chloroforme si lisse. Les deux côtés de la plaque PTFE peuvent être rugueuse pour éviter la confusion au sujet du bon côté pour les dépôts de lipides. L’épaisseur de la plaque doit être choisi pour la manipulation facile, par exemple qu’il n’est pas trop souple et peut être facilement couverts par la solution d’hydratation (voir Figure 1). Ici nous avons utilisé des plaques d’environ 2 mm d’épaisseur. Une fois que rugueuse, la plaque PTFE peut être réutilisée pour nouvelles expériences après un nettoyage correct (étape 1.3).
    2. Préparer un flacon en verre refermable de volume approprié (environ 15 mL) à la croissance de l’hydratation et de la vésicule de film lipidique final.
    3. Préparer un récipient de verre scellés dans lequel s’inscrit le flacon en verre ~ 15 mL ; il sera utilisé pour créer une atmosphère saturée d’eau pour un gonflement pré film lipidique, voir la Figure 1.
  2. Préparer 4 mM stocks de lipides dans le ratio désiré de 1,2 - dioléoyl - sn - glycéro - 3 - phospho-(1 ' - rac - glycérol) (sel de sodium) (DOPG), d’oeufs supplémentaires 0,1 mol % 1,1 sphingomyéline (eSM) et cholestérol (Chol), ′ - dioctadecyl - 3 , 3, 3 ′, 3 ′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiIC 18) à une concentration de lipides totaux de 4 mM. Utilisez chloroforme comme solvant. Voir la Table des matières.
  3. Rincer soigneusement la plaque PTFE et le récipient en verre avec du détergent pour lave-vaisselle commercial, l’éthanol et le chloroforme dans cet ordre et enfin les faire sécher.
  4. à l’aide d’une seringue en verre, déposez et répartir uniformément les 10-15 µL de stock de lipides sur le côté rugueux de la plaque PTFE pour créer un film lipidique uniforme. Utilisez l’aiguille de la seringue pour écarter la solution si nécessaire.
  5. Placez la plaque PTFE sur une surface propre et elle dessécher ainsi que le film lipidique déposé pendant 2 h à 60 ° C pour éliminer le chloroforme. Par souci de commodité, déposer la plaque sur le récipient en verre nettoyé et non scellés 15 mL pendant la dessiccation.
    Remarque : La température élevée s’assure que le film lipidique est dans un état de simple-liquide homogène dans ce domaine et toutes les étapes subséquentes.
  6. Après la dessiccation, remplir le récipient en verre préalablement gonflement à l’eau désionisée jusqu'à un niveau qui ne permet pas de flottabilité renverser le flacon en verre ~ 15 mL (~ 1 cm), voir la Figure 1.
  7. Mettez le verre de ~ 15 mL flacon avec la plaque PTFE dans le récipient et le couvrir afin que peut émerger une atmosphère saturée d’eau, voir Figure 1 b.
    Remarque : L’eau de condensation sur les parois du récipient interne donne une bonne indication pour la saturation de la vapeur d’eau réussie.
  8. Let le film lipidique déposé préalablement gonfler dans le récipient de verre fermés à 60 ° C pendant 4 h. Dans ce laps de temps Préparez la solution de gonflement désirée.
    Remarque : Pour les préparations de vésicules qui peuvent être menées à plus basse température, cette fois peut être extrêmement raccourcie - vers le bas pour quelques minutes - si chaleureuse saturé azote ou argon est utilisé pour le gonflement pré à la place.
    1. Prepare 200 mM saccharose ou 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 ajusté avec HCl et faire chauffer jusqu'à 60 ° C pour faire la solution gonflement.
  9. Après le gonflement pré, prendre le verre de ~ 15 mL avec la plaque PTFE hors du conteneur. Avec une seringue reliée à un filtre de 0,45 µm, ajouter environ 5 mL de la solution de gonflement dans le flacon de verre de 15 mL pour hydrater le film lipidique.
    Remarque : Une aiguille au filtre de fixation facilite l’insertion de la solution de gonflement. Préchauffage de la seringue et le filtre peut être souhaitable pour assurer un état de phase liquide-single du film lipidique lors de l’ajout de la solution de gonflement. La solution de filtrage réduit au minimum (in-) contaminations organiques de bactéries ou de sel précipité etc.
  10. sceller le flacon en verre mL ~ 15 tenant le film lipidique hydraté sur la plaque PTFE pour minimiser l’évaporation. Si nécessaire, utilisez film de paraffine pour améliorer l’étanchéité. Laissez le film lipidique hydraté à 60 ° C pendant la nuit pour final GUV gonflement.

2. Récolte GUVs

Remarque : l’agrégation de GUVs enflés et détaché du PTFE substrat provoque une touffe de nuages peu (~ 1 mm) visible par le œil. Elle apparaît blanchâtre lorsqu’aucun colorant de fluorescence n’est utilisé. Dans le cas contraire, il est de couleur selon le spectre d’absorption de fluorophore. L’ajout de DiIC 18 rend le nuage rose (voir Figure 2). Les vésicules sont concentrés dans l’agrégat et récolte il maximise le rendement de la vésicule.

~1/10
  1. cool down les vésicules à la température ambiante au sein de ~ 1 h. Coupez le bout pointu d’un piston en plastique de pipette pour le cluster ou agrégat de vésicules pour passer par l’orifice.
    Remarque : Le taux de refroidissement est particulièrement important si la séparation de phase solide-liquide s’attend à ce qu’il modifie la taille des domaines solides. Ici, pour ralentir le refroidissement, nous avons placé l’échantillon en contact avec un bloc de métal de dimensions 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x P) qui s’est refroidi à la température ambiante dans 1 h.
  2. Pipette jusqu'à la grappe avec un volume approprié de gonflement de solution (voir la Figure 2). Remettre en suspension l’agrégat dans la solution de gonflement pour créer les conditions de la solution symétrique, ou à toute solution iso-osmotique de créer les conditions de la solution asymétrique voulue.
    Remarque : La limite inférieure du volume est limitée par la taille de l’agrégat à récolter complètement. La solution externe est diluée et afin d’évaluer la concentration exacte, le volume de la solution de la vésicule doit être pris en considération.

3. Observation de GUVs pour la microscopie de Fluorescence à l’aide de Phase État évaluation

Remarque : The GUVs étaient dopés au DiIC 18 comme marqueur fluorescent. Ce fluorophore répartit préférentiellement dans la phase liquide-désordonnée de (Ld). Cela permet l’observation de la microscopie de fluorescence des domaines résultant de la séparation de phase dans les GUVs. Nous avons effectué l’évaluation d’état de phase avec la microscopie épifluorescente. En principe, ces observations sont également réalisables à l’aide de laser confocal, microscopie (CLSM), qui permet également pour la quantification du signal (par exemple pour déterminer les unilamellarity de la membrane). Cependant, CLSM exige un matériel plus sophistiqué et (généralement) les observations épifluorescente avant la numérisation sont utiles dans tous les cas.

  1. Décider sur un objectif (par exemple 40 X grossissement avec une ouverture numérique 0,6 (NA) comme utilisé ici) observer les GUVs et utiliser systématiquement lors de la comparaison des États de phase de même composition dans différent solutioconditions de n. Utiliser des filtres de longueur d’onde d’excitation et d’émission appropriés pour permettre des observations de fluorescence avec le fluorophore utilisé (p. ex. une excitation à 560 nm ± 40 630 ± 75 nm avec un séparateur de faisceau 585 nm entre les deux comme ceux utilisés dans le DiIC 18).
    NOTE : Limites d’état de Phase dans un diagramme de phase dépendra de la résolution que l’objectif atteint car elle définit la taille minimale de micro-domaines à détecter.
  2. Pour l’analyse, sélectionnez uniquement GUVs qui remplissent les critères de qualité suivants.
    1. Assurer unilamellarity de la membrane GUV par observation visuelle des vésicules différentes et comparer leurs intensités ; vésicules avec la plus faible intensité d’émission de fluorescence sont vraisemblablement unilamellaires.
      NOTE : Gonflement spontané peut produire des lots de vésicule où une grande partie des vésicules géantes ne sont pas unilamellaires.
    2. Effectuer une vérification supplémentaire en quantifiant l’intensité d’émission de fluorescence de soi-disant unilamellaires de vésicules géant et vérifier le signal correspondant pour la diffusion au sein de la population. Si aucune différence de nombre entier entre GUVs différents n’est observés, tous sont susceptibles d’être unilamellaires.
      Remarque : Si les vésicules sont préparés à partir des lipides conventionnels à l’aide d’une méthode établie comme gonflement spontané, l’approche décrite ci-dessus pour la détection des vésicules unilamellaires est suffisante. Si établissant un nouveau protocole de préparation de GUV ou l’utilisation des lipides non conventionnelles, des études plus approfondies devront confirmer unilamellarity. Par exemple, les signaux de fluorescence de membrane de vésicules marquées par un nouveau protocole pourraient être comparés à ceux de GUVs préparés selon une méthode établie ; ou la membrane pore protéine α-hémolysine peut être inséré dans la vésicule membranes 24. Colorant ajouté à l’extérieur des vésicules puis entrerait leur intérieur ou non, selon la présence d’uni - ou vésicules multilamellaires, respectivement.
    3. Veiller à ce que le GUV a un diamètre minimum raisonnable pour les domaines toujours être reconnaissables.
    4. Veiller à ce que le GUV n’a (presque) aucun défauts tels que des parties saillantes ou collés ou des structures internes.
  3. Une prise aliquote de GUV de suspension sur une lame de microscope et scellez le tout correctement. Préparer une chambre d’observation.
  4. Déposer l’échantillon sur la lame de microscope. L’entourent par une entretoise de silicone avec une découpe circulaire centrale. Pour éviter toute contamination, s’assurer que l’espacement n’est pas en contact avec l’échantillon. Sceller l’intérieur en plaçant une lamelle couvre-objet sur le dessus de l’entretoise de silicone.
    Remarque : Au lieu de la silicone entretoise une pouvez utiliser graisse silicone ou entretoises de maison polydimethysiloxane (PDMS). La chambre d’étanchéité assure une évaporation minimale de l’échantillon et maintient les conditions de l’iso-osmolaires.
  5. Laisser l’échantillon pendant ~ 5 min pour la rééquilibration de domaines possibles.
    Remarque : Les contraintes mécaniques de pipetage peut mélanger les domaines membranaires, qui ont besoin de temps pour réformer.
  6. Place la lame de microscope avec l’échantillon sur la platine du microscope et d’analyse l’état de phase du lot GUV dans une approche statistique. Observez plus de 30 GUVs par lot et de déterminer leur état de phase selon les critères suivants pour l’évaluation de l’État phase GUV DiIC 18 ( Figure 3).
    Remarque : Après leur croissance, les vésicules peuvent changer leurs compositions individuelles (par exemple) domaine en herbe au large ou échange de matériel de membrane par l’intermédiaire de nanotubes. GUVs présentent donc des variations de compositions dans le même lot 35. Phase du
    1. unique-liquide ou liquide-commandé (Lo) ou liquide-désordonnée (Ld) : s’assurer que la forme globale de GUV est sphérique et lisse et DiIC 18 est distribuée de façon homogène dans la membrane (premières images en haut et en bas des panneaux en < classe forte = « xfig » > Figure 3).
    2. État de coexistence de deux phases Lo + Ld : veiller à ce que les vésicules présentent des domaines qui apparaissent circulaires lisse bornages ; selon le DiIC 18 partitionnement comportement domaines sont rouge vif (Ld) ou rouge foncé/noir (Lo) (seconde images dans le haut et panneaux inférieurs dans la Figure 3, en fausses couleurs). Vérifier que les domaines sont libres de diffuser sur la surface de la vésicule et peuvent fusionner.
    3. En deux phases solides (S) + État de coexistence liquide (S + Lo ou S + Ld) : s’assurer que les domaines peuvent sembler doigt ou arrondies mais avec des limites angulaires (troisième images en haut et en bas des panneaux à la Figure 3). Observer les domaines liquides (rouge) sur fond solid (noir) qui n’affiche pas de diffusion. A l’inverse, domaines solide (noir) seront libres de diffuser sur un fond de liquid (rouge).
    4. Coexistence de trois phases S + Lo + Ld : observer trois types de domaines apparaissant : (i) angulaires domaines noirs (S), incorporé dans (ii) dim (Lo) et (iii) brillant (Ld) domaines rouges.
  7. Attribuent la population de GUVs à l’état de phase qui a été établie à dominante parmi un échantillon aléatoire, comme dans les exemples suivants :
    1. 20 si simple-liquide GUVs et 15 Lo + Ld GUVs sont observées, examiner les lots qui doivent être une Single-liquide phase.
    2. Si 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs et 25 single-liquide GUVs sont observées, examiner le lot à être un Lo + LD

4. GUV Observation en dispositif microfluidique

Remarque : tout d’abord de fabriquer le dispositif microfluidique ; détails de conception de dispositif microfluidique et d’assemblage ont été donnés ailleurs 36 , 37 ; Voir la Figure 4 pour une brève description.

  1. Préparer fraîche GUV gonflement solution (sel ou saccharose selon étape 1.8.1) et filtrer à travers un filtre de 0,45 µm.
    Remarque : Toutes les impuretés dans les fluide des solutions peuvent obstruer le dispositif microfluidique.
  2. Piston de couper 200 µL Pipeter pointes en plastique et les place dans les trous dans la partie PDMS de l’appareil. Ajouter 100 µL et 5 µL de la fraîche et filtrée gonflement solution dans le réservoir (voir Figure 5 a) et chacun de coupe Pipeter conseils, respectivement. Centrifuger l’ensemble du dispositif à 900 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse de rotor de swing à remplir à l’avance l’appareil et retirer l’air.
  3. Pré-remplir la seringue de 1 mL verre et joint tube avec la solution de gonflement et revenir à la position du piston à 0 mL.
  4. Placer le tube dans la prise de courant fluidique de l’appareil et placez la seringue dans le pousse-seringue.
    Remarque : Le choix de seringue et seringue pompe marque n’est pas important. Cependant, les seringues de verre sont plus précis et la pompe doit être capable de fonctionner dans la gamme de débit µL/min.
  5. Connecter une unité de contrôle de pression personnalisée aux entrées du 8 du contrôle microfluidiques couche (voir Figure 5 a). Réglez la pression sur l’unité de commande de pression à 3 bars (air, azote ou argon), mais les vannes de la valeur du dispositif microfluidique à la position fermée.
  6. Placer le dispositif microfluidique, maintenant raccordé à l’appareil de contrôle de seringue pompe et la pression, sur une scène de microscope confocal inversé.
    1. Utiliser un objectif avec le même grossissement et NA que pendant les observations en vrac. Contrôler si les statistiques d’état de phase comme expliqué dans l’étape 3,7 restent les mêmes, si un autre objectif est utilisé pour éviter les artefacts d’observation qui sont fondent sur différentes résolutions.
  7. Charger les GUVs dans le dispositif.
    1. Premier, pipette loin tout sauf 25 à 50 µL de la solution qui est restée dans le réservoir. Ajouter 150 µL de la solution GUV (saccharose ou sel selon étape 1.8.1, mais correspondant à la solution utilisée pour pré-remplir l’appareil à l’étape 4.1) au réservoir et le mélange de pipetage doux. Set de retirer de la seringue à 10 µL/min Débit en mode pendant environ 20 min ou jusqu'à ce que plus de 90 % des pièges sont occupées.
      NOTE : Le réservoir ne puissent pas fonctionner à sec. Dans ce cas, les bulles d’air entrera les microcanaux. Ajoutez plus GUV solution dans le réservoirr pendant le chargement mais prendre soin de ne pas pour introduire des bulles d’air lors du pipetage dans le dispositif.
  8. Ouvrez toutes les vannes d’unité de contrôle de pression pour fermer les vannes-anneau de microfluidique autour des pièges/GUVs. Mettre la pompe de seringue 0 µL/min. Après 1 h, observer le GUVs et images confocales Records. Exciter et détecter les GUVs selon le fluorophore utilisé (p. ex. une excitation à 561 nm et détection entre 580-620 nm en ce qui concerne le DiIC 18). Utiliser les mêmes critères de sélection à l’étape 3.6 , et prendre soin de noter l’emplacement de chaque GUV (c'est-à-dire la colonne et ligne numéro, voir Figure 4)
  9. échanger la solution entourant les GUVs .
    1. Mettre la pompe de seringue 0 µL/min et distribuer loin tous mais de 25 à 50 µL de la solution GUV provenant du réservoir. Ajouter 150 µL de la solution 2 (en saccharose ou sel selon étape 1.8.1, selon la solution recherchée en dehors des GUVs) au réservoir et le mélange de pipetage doux. Pipetter loin tous mais de 25 à 50 µL de la solution tampon dans le réservoir.
      NOTE : Cette solution doit être filtré à l’aide d’un filtre de 0,45 µm trop.
  10. Répétez l’étape précédente au moins 5 fois à remplacer complètement la solution dans le réservoir. La valeur de la seringue à 10 µL/min débit à retirer le mode pendant environ 10 min à remplacer la solution dans les microcanaux.
  11. Réduire le débit de 1 µL/min. ouvrir les 8 unité soupapes de surpression pour 2 s et fermer à nouveau (donnant lieu à ouverture et fermeture des soupapes anneau microfluidique). Régler le débit à 0 µL/min nouveau.
  12. Après 1 h, observer le GUVs et images confocales Records. Encore une fois, prenez soin de noter la colonne et la rangée de la micro-chambre où se trouve chaque GUV pour permettre des comparaisons de la GUV même avant et après l’échange de la mémoire tampon externe.

5. Conception et étalonnage de la chambre de contrôle de température

Remarque : une chambre adaptée pour contrôler la température peut être obtenue dans le commerce ou maison construite. Contrôle de la température est généralement obtenue par couplage thermique de la chambre avec l’échantillon GUV à un bain d’eau ou un élément Peltier. Nous décrivons ici la conception et la caractérisation d’une chambre de construction artisanale-contrôle de la température avec un thermostat d’eau externe. Ces thermostats sont disponibles dans de nombreux laboratoires ou peut être récupérés de vieux équipements tels que les lasers ou les spectromètres.

  1. Assemble une chambre de flux thermique, ici, établie d’un bloc d’aluminium, avec des connecteurs à un bain d’eau tel qu’illustré à la Figure 6. Sceller les ouvertures en haut et en bas et de permettre l’observation de champ lumineux de l’échantillon par collage des verres de couverture au bloc.
  2. Flip la chambre de flux du côté où l’échantillon sera placé et pipette une goutte d’environ 100 µL de la solution utilisée dans des expériences selon étape 1.8.1. Vous pouvez également insérer une sonde de température optiques de fibre (p. ex. FISO FTI-10) ou ajouter un colorant sensible à la température dans une concentration appropriée, par exemple 500 µM Rhodamine B.
  3. Monter la chambre d’observation GUV à l’aide de graisse silicone déposé en forme d’anneau ou de certains autre entretoise (PTFE ou en caoutchouc) et fermez-le hermétiquement avec un couvercle en verre 0,17 µm. S’assurer que la chute n’est pas en contact avec l’agent d’étanchéité ou l’entretoise pour éviter l’introduction d’impuretés.
  4. Lentement tourner l’ensemble à l’envers et brancher le thermostat externe avec tube approprié pour elle. Soyez particulièrement attentif aux éventuelles fuites d’eau.
  5. Ensemble la plus basse température sur le thermostat externe désirée et laisse le système équilibrer jusqu'à ce que la lecture de la sonde de température est stable ; le temps nécessaire pour l’équilibration donnera une estimation du temps de réponse minimal du système.
  6. Réaliser des expériences de contrôle au moins une fois avant d’utiliser la chambre de.
    1. Mesurer la température de la solution (par exemple avec une sonde de fibre de verre) et la comparer à la lecture du thermostat sur la plage de températures d’intérêt.
    2. Recherchez un décalage minime de la lecture du thermostat et la linéarité des températures mesurées.
    3. Recherchez un gradient de température à l’intérieur de la chambre d’observation en utilisant un colorant sensible de température. Mesurer la température de la solution par l’intensité de la fluorescence ou la durée de vie de fluorescence imaging microscopy (FLIM) pour des distances différentes de la lamelle couvre-objet de fond 40. En outre, vérifier s’il y a un gradient de température dans la région d’observation GUV, comme illustré à la Figure 7.

6. GUV Observations à des températures variant

Remarque : en général, pour GUVs dont les membranes potentiellement phase distincte et qui semblent être homogène à l’observation de la température T obs, séparation des phases sera induite par dessous T obs (si qui est observée dépend de l’intervalle de température étudié). Inversement, la phase séparée des vésicules devienne homogènes à une température supérieure à T obs. Toutefois, cela n’a pas besoin d’être le cas pour une composition particulière lipidique (complexe) et il pourrait être intéressant à toujours analyser la température accessible toute gamme 38. Le protocole pour l’observation et l’évaluation des températures de transition de phase ne dépend pas de la méthode spécifique utilisée pour contrôler la température.

  1. Assembler la chambre d’observation de température conformément à l' article 5, en omettant la sonde optique de fibre ou le fluorophore thermosensibles.
  2. Réglez le bain d’eau externe à température ambiante (23 ° C) et laisser le système équilibrer pendant 10-15 min.
  3. Compter le nombre de vésicules phase séparée en utilisant les critères de l’étape 3.6 ; la phase globale, état de la population de GUV donneront une idée sur la région de la température de transition du système. Si l’état de phase dans l’ensemble de la population de la vésicule est plutôt hétérogène, passez directement à l’étape 6.5.
  4. Augmenter (si la majorité des vésicules sont des phases séparées) ou diminuer (si la majorité des vésicules est homogène) la température à intervalles grossiers (p. ex. 1-2 ° C) et laissez le système équilibrer pour environ 2 min. ré-évaluer l’état de phase de la population de GUV de signifie de manière aléatoire, l’échantillon et de varier la température jusqu'à ce que la population de vésicules indique un état de phase hétérogène.
  5. Une fois que la population est près du point de transition de phase (c'est-à-dire la phase précise parmi GUVs individuels sont assez hétérogènes), diminuer l’intervalle de température (par exemple 0,5 ° C) pour augmenter la résolution. Laisser le système de réévaluer l’état de phase de la population de GUV au moyen d’un échantillon aléatoire ainsi qu’équilibrer pendant environ 2 min.
  6. Une fois que le point de transition de phase est passé, la garder faisant varier la température jusqu'à ce que tous les GUVs sont maintenant homogène ou phases séparées, respectivement.
  7. Recherchez hystérésis évaluer si le temps d’établissement suffisent. Scan
    1. changement de la direction de la température, je.e. si l’analyse a été effectuée pour l’augmentation de la température, faire le scan en diminuant la température.
    2. Choisir au moins un sous-ensemble des températures afin d’évaluer le rapport de l’État GUV population phase (par exemple 80 % de phases séparées).
    3. Si des écarts substantiels entre les deux sens dans le rapport d’état de phase indiquent hystérésis, réduire la taille de palier de température et/ou d’augmenter le temps d’équilibrage en étapes 6.4 et 6.5.
    4. S’il n’y a aucune hystérésis indiqué par des rapports égaux, envisagez d’augmenter la durée taille et/ou d’équilibration de l’étape.
  8. Tracer les rapports d’état de phase contre la température. Pour la quantification, ajuster les données à un modèle approprié ( Figure 8).
    Remarque : Les courbes de transition de Phase fonction communément une trajectoire sigmoïde et le modèle de Boltzmann sigmoïde fournit un ensemble de paramètres de montage :
    Equation 1
    y : fraction d’uniforme/phases séparées GUVs
    A 1 : la valeur de la fraction initiale
    A 2 : la valeur de la fraction finale
    T : température
    T mix : température à mi-hauteur y
    Y étant la fraction de GUVs homogènes, A 1 et A 2 devraient être fixés à 0 et 1, respectivement. Comme la miscibilité transition est supposée pour être sigmoïde, une fois que la valeur de fraction est mesurée à 0 à une certaine température, toutes les valeurs de la fraction de l’intervalle de température ci-dessous sont considérés comme 0. Inversement, une fois que la valeur de la fraction est 1 à une température particulière, toutes les valeurs de la fraction de l’intervalle de température ci-dessus sont censés pour être 1.

Representative Results

GUV gonflement

Avec l’approche de gonflement spontané décrite ici, GUVs composé de DOPG, eSM, et Chol ont été cultivées pendant la nuit en 210 mM saccharose ou 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, formant un agrégat visible. L’agrégat de récolte assure la vésicule haut rendements. La remise en suspension dans la solution de gonflement a entraîné dans des conditions de solution symétrique membranaires. Pour créer des conditions asymétriques, l’agrégat a été resuspendu dans un iso-osmolaires saccharose ou solution de forte salinité, respectivement (Figure 2). La dilution qui en résulte correspond à un échange de solution quasi externe tout en minimisant la dilution du nombre de GUVs.

Cartographie de diagramme de phase de GUVs à l’aide de la microscopie en fluorescence

La présence de 0,1 mol % du DiIC18 phase spécifique dans les GUVs tolérée pour l’observation de leurs États de phase par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence de grand champ. Vésicules montrant la séparation des phases S + L ont été observées par un x 63 / 1.2NA pour pouvoir régler finement structuré doigt domaines. Pour tous les cas, un 40 x / 0,6 restant objectif NA a été utilisé. Pour éviter les artéfacts lors de l’inspection visuelle de GUVs et pour maximiser la reproductibilité, certains critères ont été fixés que déterminé quels vésicules à envisager pour l’analyse d’état de phase (étape 3.6 du protocole).

GUVs préparés à partir de mélanges ternaires de Chol/ger/DOPG d’un large éventail de rapports gonflées en saccharose ou solution forte salinité et observée à la température ambiante exposées séparation de phase homogène Lo ou phases Ld, Lo + Ld et S + L, voir la Figure 3. Figure 9 illustre vésicules façon exemplaire défectueux, ce qui ne devraient pas figurer dans l’analyse des données et indique comment identifier les vésicules multilamellaires.

En raison de leur histoire inconnue, GUVs sont susceptibles de présenter dans les lots variation composition35. Par conséquent, l’état général de la phase d’une composition particulière a été déterminée dans une approche statistique. GUV populations d’une certaine composition lipidique ont été attribuées à l’état de phase qui s’est avérée pour être dominante dans un échantillon aléatoire (étape 3.6 du protocole). Encore, compositions à proximité de la région de coexistence Lo + Ld produit souvent des lots où l’état de phase dominante composée d’une courte majorité. Dans ces cas-là vague, l’inspection visuelle a été répétée au moins trois échantillons indépendants. La fraction des vésicules avec état de phase identique (par exemple la séparation de phase des Lo + Ld exposante) présents au sein des échantillons aléatoires a été répartie sur le nombre d’essais qui a été pris dans le résultat final (Figure 10).

Les protocoles décrits entraîné suffisamment GUV croissance sur une large gamme de différentes proportions de DOPG, eSM et Chol dans les solutions de forte salinité et saccharose. Les régions vastes dans le diagramme de phase ternaire peuvent être mappées dans des conditions symétriques et asymétriques solution forte salinité (Figure 11). Les différences dans le comportement de phase de vésicule observée dans des conditions différentes de solution ont été traitées ailleurs détail9.

Observations du comportement de phase après échange tampon complète à l’aide de la méthode de microfluidique

La création des conditions de la solution asymétrique par dilution entraîne les résidus de la solution de gonflement à l’extérieur. Notre approche de la microfluidique permet un échange de solution externe complète. Figure 5 a montre le dispositif microfluidique entièrement monté sur la platine du microscope confocal avec prise de courant fluidique et prises de contrôle de pression. Tubes sont reliés par des tuyaux en métal 90 ° pour permettre l’espace transmis d’imagerie lumière d’en haut.

Pour l’observation au sein du dispositif microfluidique, un microscope confocal avec un x 63 / 1.2NA eau immersion objectif a été mis en place. Comme pour les précédentes observations en vrac, DiIC18 a été utilisé pour colorer la membrane. Lorsque vous faites des observations de la phase d’état de GUVs pris au piège dans l’appareil, il faut ne pas de mal interpréter les données. En raison de la proximité des GUVs aux postes, les chemins de lumière d’excitation et d’émission peuvent être partiellement bloquées par le PDMS conduisant à la fausse apparence de domaines (Figure 12). Ici, la détection de lumière transmise est utile pour vérifier la position des GUVs aux postes. Cet effet indésirable est particulièrement éloquents pour petits GUVs de moins de 10 µm de diamètre. Dans ces cas, les données ont été rejetées. L’image confocale à la Figure 13 a montre une section plane vésicule qui traverse un domaine Lo présent sur la vésicule GUV. Dans ce cas, scans section transversale plane encore au-dessus ou au-dessous de la section n’auraient pas montré le domaine en raison de sa petite taille par rapport à celle, de la GUV, qui est pourquoi il aurait été manqué et la vésicule, considéré comme étant dans un état de phase homogène. Par conséquent, une pile z confocale devrait servir d’inspecter toute la surface GUV. Pour la microscopie à champ large, peut-être pas un problème car la vésicule entier peut être photographiée en même temps.

Enfin, des exemples sont donnés de GUVs avant et après l’échange de la solution externe lorsqu’il est évident que la phase Etats des membranes sont (Figure 14). Chaque périphérique possède 60 chambres (chacune avec une paire de bornes pour piéger un seul GUV), permettant à des dizaines d’expériences par périphérique (voir Figure 4). Cependant, certains GUVs peuvent se perdre au cours de l’échange de la solution externe. Cela peut être minimisé par les étapes suivantes : 1) avec l’albumine sérique bovine (BSA) revêtement pour éviter GUV adhérence/rupture aux postes ; revêtement est fait en exposant les murs de la chambre à 20 mg/mL de BSA pour 60 min et un rinçage ultérieur avec le tampon de travail. Une autre molécule d’adhésif qui peut être utilisée est poly(L-lysine)-greffe-poly(ethylene glycol)39. 2) un appariement osmotique attentif des solutions internes et externes pour éviter GUVs flasques, qui pourraient passer par le Centre des postes ou éclatement de GUVs. 3) optimisation de la procédure de préparation de GUV pour obtenir plus de ~ 8 µm de diamètre pour éviter le passage par le Centre des postes des vésicules.

Conception et caractérisation de chambre isotherme pour l’observation de GUV phase des États

Nous avons conçu une chambre à simple flux, qui dispose de connexions vers le thermostat externe (Figure 6). Nous avons obtenu lechambre de fraisage d’un bloc d’aluminium. En général, le matériel de la chambre n’a pas besoin d’être conductrice, de chaleur que l’échantillon est couplé à l’eau du bain par le couvercle inférieur en verre tel qu’illustré à la Figure 6 b et 6C.

Indépendamment de la conception exacte, la performance de la chambre doit être évaluée. Plus précisément, nous avons vérifié pour la linéarité de la température de l’échantillon avec la température externe, tout décalage de température systématique et un gradient de température dans la chambre. Les deux premiers points ont été abordées par la mesure directe de la température dans la chambre par une sonde de température optiques de fibre (p. ex. FISO FTI-10). Nous avons également vérifié pour un gradient de température au sein de la suspension GUV. Tel un gradient peut provenir du flux de chaleur vers l’extérieur de la chambre. Mesures de température dans l’espace résolu peut être obtenue par un fluorophore sensible de température40, voir la Figure 7.

Traçage de données et mise en place d’obtenir Tmélanger des phases séparées GUVs

Traçant la fraction de GUVs homogènes sur la plage de température observée a abouti à une trajectoire de point de données sigmoïdal en forme. Nous ajustons les données pour le modèle de Boltzmann (protocole section 6.8) d'où le Tmix pourrait être déduite ()Figure 8).

Figure 1
Figure 1 : les étapes expérimentales durant le protocole gonflement spontané (panneau supérieur) avec l’étape correspondante de la croissance (panneau inférieur) de la vésicule. Film lipidique homogène (A) A est étalé sur une plaque PTFE rugueuse et séché de n’importe quel solvant. (B), les lipides séchées film est alors préalablement gonflé dans une atmosphère saturée d’eau à l’intérieur d’un récipient fermé avec de l’eau pour faciliter l’hydratation de la bicouche. Le flacon en verre vide contient la plaque PTFE et reste ouvert au cours de cette étape d’hydratation. (C), les lipides préalablement gonflé film enfin devient entièrement hydraté par l’addition de la solution recherchée gonflement sur la plaque de PTFE lipides enduit à l’intérieur de la fiole de verre. Pour éviter l’évaporation, le flacon de verre est correctement scellé durant l’incubation durant la nuit. Afin de minimiser les variations de compositions d’un lot, toutes les mesures doivent être effectuées à une température où le mélange de lipides est complètement miscible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : récolte de GUV. Film de lipides (A), A déposé consistant en DOPG/eSM/Chol à des rapports molaires de 60/20/20 avec 0,1 mol % DiIC18 était enflé dans le tampon de forte salinité composée de 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. En outre, le couvercle du récipient verre a été scellé avec film de paraffine. La zone agrandie d’intérêt contient l’agrégat GUV qui en résulte. Son aspect rouge est une conséquence de la présence du DiIC18. (B) The GUVs ont été récoltées avec une pointe de pipette tronqué. Dans cette image, l’agrégat a été reversé avec 50 µL de solution, de gonflement qui ont été transférés dans un nouveau flacon. (C) créer asymétrique membranaires solution conditions, l’agrégat a été dilué dans une autre solution externe isotonique. Ici, l’ensemble ainsi que les 50 µL de solution de gonflement a été resuspendu dans 950 µL de solution de saccharose entraînant une dilution 20 x de la solution de gonflement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : imagerie de GUV. Large champ des images de fluorescence de GUVs dopés avec 0,1 mol % DiIC18 établi et observé dans le sel symétrique ou solutions de saccharose consistant en différentes proportions de DOPG, eSM et Chol (dans un tampon salin, de gauche à droite : 40/20/40 ; 50/20/30 ; 30/60/10 ; en saccharose, de gauche à droite : 30/30/40 ; 20/60/20 ; 40/50/10). Les images représentent GUVs dans différents États de phase (coexistence) appréciées selon les critères à l’étape de protocole 3.6. Ici, les vésicules ont été imagés à travers un 40 X / 0,6 objectif NA. Barreaux de l’échelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : schéma de conception des canaux microfluidiques. GUVs entrer dans la couche inférieure fluidique (les canaux) via l’entrée ci-dessous un réservoir. Un filtre bloque les débris indésirables de l’appareil. Puis, ils entrent un tableau de 60 chambres (8 lignes et 15 colonnes) chaque messages contenant pour capture GUV unique (voir insérer). Chaque chambre peut être isolé dans une bague soupape actionnée par une couche de contrôle (canaux noir rempli) au-dessus de la couche fluidique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : dispositif microfluidique. (A) photographie d’un dispositif microfluidique permettant de piéger GUVs unique et change complètement la solution externe. Les étiquettes indiquent le réservoir d’ajouter des solutions (1), le 8 x entrées pression raccordé à l’appareil de contrôle à pression (2), et la prise de courant fluidique relié à la seringue et pompe (3). (B) indique l’unité de contrôle de pression avec 8 soupapes chacun régulation 1 tube relié au dispositif microfluidique. Ici vannes #1 et #2 sont ouvertes et par conséquent les vannes de bague correspondante sont fermées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : chambre avec contrôle de température. Chambre (A)devant l’Assemblée. (B) chambre assemblé (vers le haut) avec des lunettes de couverture de 2 mm collés en haut et en bas. L’entretoise en caoutchouc orange mesure 0,5 mm de hauteur et est scellée avec une lamelle de 0,17 mm pour l’observation de la suspension GUV ci-joint. Dans cette image, on introduit une sonde de température à des fins d’étalonnage (fibre brune sortant de la chambre sur la droite). (C) montage Final sur la scène d’un microscope inversé sans la sonde de température. L’entretoise en caoutchouc orange est maintenant vers le bas. Le caoutchouc est colle suffisamment pour maintenir l’échantillon en place. Notez que la lumière peut être transmise à travers l’échantillon permettant épifluorescente et observations de terrain vif à le. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : données de température résolu dans l’espace à l’intérieur de la chambre d’observation obtient par mesures FLIM de colorant sensible de température (ici : 500 µM Rhodamine B) 40. des points de données obtient à 0, 10, 30, 300 et 400 µm au-dessus de la lamelle inférieure. Les points de données rouge et bleu ont été mesurées pour la température du bain d’eau réglé à 30 ° C et 12 ° C, respectivement. Les points noirs indiquent la gauche de bain l’eau s’équilibrer à température ambiante. Variations de température faible tout au long de la chambre ont été observées mais est restées inférieur à 0,5 ° C (barres grises). La hauteur de la chambre total est environ 500 µm selon l’épaisseur de la cale d’espacement (voir ci-dessus). Les barres d’erreur indiquent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : localisation de la température de miscibilité. Le graphique présente les points de données individuels de homogène (single-liquide État) la fraction de GUVs préparés à partir de DOPG/eSM/Chol dans un ratio de 30/40/30 dopé avec 0,1 mol % DiIC18 de trois échantillons aléatoires indépendants (N = 20-40). Barres d’erreur représentent écart-type des moyens. Points de données sont montées sur le modèle de Boltzmann décrit à l’étape 6,8 (ligne noire continue) dont le domaine mélange température Tmix a été déduite (ligne continue rouge suivi d’abscisse) selon la mi-hauteur de la sigmoïde courbe sur l’axe des ordonnées (pointillé noir). Les valeurs initiales et finales (un1 et2) ont été fixées à 0 et 1, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : vésicules défectueux. Exemples de vésicules géants préparé à partir de 20/60/20 DOPG/eSM/Chol et dopé à 0,1 mol % si DiIC18 qui ne répondent pas aux critères définis à l’étape 4.2 imagé par microscopie de fluorescence de grand champ. Gammes d’affichage intensité d’images individuelles ont été optimisées pour l’intensité de la fluorescence de la vésicule représentée chaque fois. En raison de la présence de matériel de membrane supplémentaire et encapsulé de vésicules plus petites, l’état de phase de la vésicule en (A) ne peut être clairement définie. L’apparition de cette vésicule géant ne permet pas de toute inspection visuelle fiable pour lamellarity. Panneau (B) dépeint une vésicule dont l’intérieur est rempli de matériau de la membrane. En conséquence, le signal de fluorescence de la membrane de la vésicule extérieur se superpose avec son signal interne, une visualisation des lamellarity et des domaines potentiels de rendu impossible. (C) les intensités de fluorescence des trois différentes vésicules géantes apparaissent en comparaison directe au sein de la plage d’intensité même affichage. Cette image montre que les vésicules multilamellaires géants (1, 2) peuvent être identifiés par leur signal de fluorescence accrue par rapport à la GUV (3). Ici, multilamellaire ainsi qu’unilamellaires des vésicules géant pièce séparation de phase Lo + Ld. Vésicules dans toutes les images ont été imagées par un 40 x / 0,6 objectif NA. Barreaux de l’échelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Fraction de la phase de Lo + Ld séparée GUVs moyennées sur au moins trois échantillons indépendants. Vésicules étaient composés de 30/40/30 DOPG/eSM/Chol, près de la frontière de la région de coexistence Lo + Ld. Les barres d’erreur pour des conditions de saccharose symétrique illustrent la dispersion au lot. L’étiquette de l’axe des ordonnées décrit des solutions à l’intérieur/extérieur des vésicules ; saccharose : saccharose 210 mM ; sel : 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 ; Barres d’erreur indiquent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : diagramme de Phase de GUVs préparés à partir de DOPG, eSM et Chol mappées dans des conditions de solution différente à l’aide de saccharose de 210 mM (saccharose) et 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (sel). GUV phase précise ont été explorés en saccharose/sucrose (A; section supérieure), saccharose/sel (in/out) (A; section polygonale inférieure), sel/salt (B; section supérieure) et sel/saccharose (B; section polygonale inférieure). Les dessins animés illustrent le modèle de domaine dominant dans les sections en surbrillance et les conditions correspondantes de la solution. États de phase de vésicule représentées dans les sections polygonales inférieures ont été observés dans des conditions de solution asymétrique après dilution de GUV x 20. Adapté de référence9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : artefacts dans GUVs piégés. Exemple d’un petit GUV où un domaine faux peut être vu en raison de la proximité avec les postes (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Le champ lumineux transmis lumière image montrant les postes (grEY) se superpose à l’image de confocal fluorescence de la GUV (orange). Les postes sont considérés pour créer une figure d’interférence à l’image de lumineux-zone. Le signal de fluorescence fermer les postes (à droite) est réduit en donnant l’apparence d’une séparation de phase. Echelle = 5 µm.

Figure 13
Figure 13 : exemples de deux GUVs différentes capturés par les postes PDMS où les États de phase sont clairement visibles. (A) Lo + Ld phase séparée vésicule de DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) une vésicule de 40/30/30 présentant Ld ou Lo monophasé. Une pile z confocale de la vésicule entier a été étudiée pour confirmer qu’aucun domaine (out-of-focus) n’était présents. Les bords des postes apparaissent sur le côté droit des images (gris). Echelle = 5 µm.

Figure 14
Figure 14 : comportement résultant de la phase après un échange de fluidique complet à l’aide du dispositif microfluidique. Les GUV indiquée avant et après l’échange de la solution pour (A) symétrique sel/salt (in/out) à sel/sucrose (in/out) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, barre d’échelle est de 2 µm) et (B) symétrique saccharose/saccharose (in/out) à saccharose/sel (in/out) (DOPG / eSM/Chol 30/40/30, échelle bar = 3 µm). Adapté de référence9.

Discussion

Production réussie de GUVs pour les observations d’état de phase dans des conditions de forte salinité symétriques et asymétriques

Les protocoles présentés ici présente une stratégie visant à évaluer l’influence de l’asymétrie de tampon et solution forte salinité sur l’état de phase de membrane de GUVs chargées sur une large gamme de compositions. Un des défis majeurs dans la réalisation de cet objectif était la production de GUVs chargées dans des tampons de forte salinité.

Nous avons réussi à produire GUVs dans une solution de sucrose et tampon haute-saline par une simple approche gonflement spontanée, qui comprend une étape d’hydratation avant du film lipidique déposé et une étape de nuit hydratation final pour la croissance de la vésicule. Il est important de noter que le dépôt lipidique doit être fait sur une plaque PTFE rugueuse pour assurer même lipides propagation pour donner les vésicules unilamellaires. En outre, il est essentiel d’effectuer toutes les étapes lors de préparation de la vésicule à une température où le film lipidique est dans un état de phase homogène et fluide. Sinon, la population de vésicule soient polydispersés en composition et biaiser l’analyse d’état de phase finale de la population. Le protocole spécifique pour le gonflement spontané des rendements GUVs un bouquet de vésicules qui d’une part offre la possibilité de réactiver en petits volumes pour obtenir très concentrée de dispersions de vésicule et fournit d’autre part la solution asymétrique conditions à travers la membrane tout en minimisant la dilution des vésicules8,28. Il est essentiel qu’au cours de la dilution de la vésicule ou solution externe échanger, l’intérieur et extérieur osmolarities restent appariées comme des changements de morphologie causées par la désadaptation de l’osmolarité peuvent induire ou prévenir Lo + Ld phase séparation41 ou, en cas de hypotonique conditions, peut conduire à l’éclatement de la vésicule.

Ici, tentatives d’optimiser les protocoles d’electroformation en solution forte salinité ont débouché sur la production d’aucun GUVs alors que PVA assistée par un gonflement des vésicules multilamellaires. Même si elle exige plus longs temps de préparation et des résultats dans des lots de la vésicule de basse qualité10,17, le succès de la production de vésicules chargées par spontanée gonflement est livré avec des avantages supplémentaires. Il exige un minimum d’effort tout en permettant des rendements suffisants pour les analyses des lots de statistiques et, contrairement à electroformation, aucun matériel sophistiqué ou optimisation ont été requis. En outre, aucun des contaminations par l’oxydation des lipides n’ont été observées42,43. Selon la littérature il n’y a aucune différence entre la composition lipidique des vésicules et les stocks correspondants où elles ont été cultivées7,17. En outre, la formation de vésicules sur un substrat PTFE n’invite pas l’inclusion de toute contamination par opposition aux méthodes gonflements gel assistée où les molécules étrangères peuvent être introduits par le substrat23. Electroformation est livré avec les autres inconvénients associés à dilution de vésicule excessive lors de la création des conditions de solution asymétrique. GUVs produites par electroformation sont habituellement présents sous forme une dispersion homogène (contrairement à la suspension de la vésicule hautement concentré sous la forme d’une touffe formée durant le gonflement spontané). Toute dilution de la solution externe affaiblirait considérablement le nombre de vésicules ainsi. En outre, au cours de ce travail, Qu'on a fait observer que DOPG/eSM/Chol GUVs produites par electroformation en saccharose est devenu instable si dilué dans un tampon forte salinité. Fluorescence de plaques de lipides sur la lame de microscope a indiqué que les vésicules auraient éclaté avant leur inspection visuelle n’a été possible. Cette instabilité peut être attribuée à une tension élevée membrane de vésicules préparé par electroformation par rapport à ceux obtenus par gonflement spontané10.

Bien que la dilution de la vésicule est une approche simple et rapide de créer des conditions de solution GUV asymétriques, il accomplit seul un échange partiel solution externe, bien qu’à une fraction élevée (ici : 95 %, Figure 2), après dilution, trace de la gonflement des solution restera. Le choix du degré de l’échange de la solution externe est un compromis entre le pipetage jusqu'à la touffe de la vésicule avec la solution de gonflement (section 2) et il dilue ne pas trop. Par conséquent, nous avons introduit une approche alternative microfluidique discutée ailleurs en détail37 qui permet un échange rapide et complet de solution externe lors d’observations de GUV phase État pour vérifier les observations d’état de phase pour dilué vésicules. Les observations de variations d’état de phase lorsqu’on change de symétrique aux conditions de la solution asymétrique ont été observées en effet à être d’accord. En outre, les deux méthodes pour générer des modalités de solution asymétrique indiquées ici sont relativement rapides (Réf.8à comparer) et viennent avec aucun risque connu de modifications de la composition locale (comparer les références30,,31), augmentation de la tension de membrane (Comparez référence32), ou chauffage local (Comparez référence33), en ce qui concerne les méthodes alternatives discutées dans l’Introduction. Durant le piégeage de la microfluidique, un équilibre osmotique entre l’intérieur de la vésicule et l’extérieur n’est pas seulement essentielle pour éviter les artefacts d’état de phase comme mentionné ci-dessus, mais aussi déflation causée par une solution hypertonique conditions pourrait causer les GUVs piégés à glisser à travers les postes après un échange de solution externe.

Même si gonflement spontané a été appliqué avec succès pour se développer sans inculpation des vésicules d’un système DOPC/eSM/Chol, dans d’autres cas, l’absence de charges qui risqueraient de GUV gonflement faute résultant de répulsion entre les bicouches individuels44 . Prolongation de la période pré gonflement ou d’introduire des encombrants lipides polaires peut-être contrer ce numéro45. En outre, la stabilité de la vésicule après leur dilution dans les solutions différentes de celui utilisé pour le gonflement peut être différent pour compositions lipidiques différentes et le milieu de dilution, qui nous n’avons pas étudié ici. Nous n’avons pas aussi exploré la possibilité de régler le diamètre moyen de GUV avec la méthode de préparation présentée ici. Mais les paramètres tels que la composition de la vésicule et le gonflement de solution sont susceptibles d’influencer les résultats. L’application de méthodes alternatives46 peut donner de grandes vésicules pour les lipides et les solutions utilisées ici, cependant, ils peuvent venir avec d’autres inconvénients liés à la méthode. L’approche décrite ci-dessus pour produire GUVs dans des conditions de forte salinité symétriques et asymétriques fournit un outil potentiel pour poursuivre ses études de vésicules constitué de compositions lipidiques différentes et dispersées dans différents milieux. Comme nous n’avons pas exploré ces possibilités, futurs essais montrera comment en général, les méthodes de préparation et de la dilution de GUV peuvent être appliquées.

Séparation des phases d’observation à différentes températures

Il existe différentes configurations expérimentales appropriées étudier GUVs à différentes températures. Alors que ces configurations ne sont pas communément décrites en détail dans la littérature, les travaux en cours présente un assemblage de base applicable à de telles études.

contrôle mesures montrent que la température interne conçu et construit la chambre est précisément contrôlée par un thermostat et gradients de température à l’intérieur de la chambre sont dans la résolution de la température expérimentale. Il est veillé à ce que les conditions thermiques expérimentale sont conformes à la lecture du thermostat.

Lors de l’évaluation des États de phase GUV sur une gamme de température large, il est important que les vésicules observées sont bien équilibrés après que la température a été changé. Une façon possible de s’en assurer est de vérifier pour hystérésis. Si l’hystérésis est présent, les mesures de température devraient être réduites et/ou temps d’établissement a augmenté. Comme la température contrôle dans cet ouvrage est établi par un thermostat à base d’eau, la plage de températures de travail est idéalement limitée à 0 - 100 ° C. Cette gamme peut être étendue à l’aide d’autres liquides de contrôle de température tels que l’huile ou en employant d’autres configurations, par exemple un dispositif Peltier. Dans la pratique, la température d’utilisation est également limitée par la condensation éventuelle ou évaporation. En outre, pour des températures loin de la température ambiante, la présence d’un gradient de température de l’état stationnaire dans l’ensemble de la chambre d’observation devienne plus probable. En outre, l’équipement d’imagerie peut-être être lésé à des températures extrêmes. Pour les plages de température typique appropriés pour les études de vésicules lipidiques (~ 10-50 ° C7,,9) dommage à l’équipement d’observation doit être considérée mais n’est généralement pas attendu.

Artefacts de vésicule domaine d’observation

Il y a un certain nombre de sources pour les artefacts d’observation à l’aide de la microscopie de fluorescence de grand champ. Tout d’abord, il faut être conscient que la résolution maximale r de l’objet appliqué pour l’inspection visuelle des États de phase de vésicule détermine la limite de détection de domaines lipidiques selon :
Equation 2
où λ est la longueur d’onde d’émission, et NA est l’ouverture numérique de l’objectif. Un objectif typique avec un 40 x grossissement et un NA de 0,6, ce qui permet de détecter des émissions verte clair environ 560 nm atteindrait une résolution optique de ~0.6 µm. ainsi, les études qui comparent les États de phase de vésicules issus de mélanges de lipide particulier entre les différents conditions doivent utiliser le même objectif pour le même mélange de lipides.

Un autre artefact est la présence de domaines lipidiques suite photo-oxydation des lipides en raison d’une exposition prolongée à l’excitation lumineuse41. Photo-dommage survient préférentiellement sur les fractions lipidiques hydrocarbure insaturé. En effet, pour certaines compositions lipidiques, la telle formation domaine de vésicules initialement homogènes a été observée ici après une longue période d’exposition à la lumière excitation (~ 30 s). Pour contrer ce problème, la lumière d’excitation a été gardée pendant quelques secondes seulement pour l’évaluation d’état de phase focalisée à un champ de vision. DiIC18 était donc convenable pour nos besoins. Autres colorants, cependant, peuvent être beaucoup plus sensibles et devrez peut-être être manipulé à des intensités plus faibles d’excitation et avec des temps d’exposition à la lumière excitation plus courts.

Contrainte de cisaillement mécanique provenant du transfert de la pipette des vésicules mélanges potentiellement domaines temporairement, ainsi fausser le comportement de phase de vésicules apparentes. Pour certains lots, vésicules différents ont montré des comportements différents de phase 0 min et 5 min après la pipette de transfert sur la lamelle de microscope. Aussi la contrainte de cisaillement induite par l’écoulement du fluide dans le dispositif microfluidique s’est avérée de domaine mélange47. Vésicules devraient être laissées intactes pour une durée suffisante pour équilibration avant l’observation. Dans cette étude, vésicules piégés sur le dispositif microfluidique sont restés intacts pendant 1 h après chargement de la vésicule et les échanges de solution avant l’observation.

D’éviter les difficultés susmentionnées ainsi que la restriction imposée par la limite de diffraction de la lumière, des méthodes alternatives telles que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire48 ou super résolution microscopy techniques49 pourraient être employés.

Conclusion et perspectives

Le travail présenté illustre un ensemble de méthodes permettant l’analyse de l’influence des conditions de forte salinité des solution symétrique et asymétrique sur la séparation de phase de membrane. Toutes les méthodes présentées ne conviennent pas pour d’autres applications. Par exemple, le dispositif microfluidique fournit une plate-forme pour étudier la cinétique de formation du domaine et la disparition après l’induction de l’asymétrie de la solution. Aussi, apparition de domaine en fonction de la concentration en sel pourrait être examinée comme ça. Toutes les méthodes pourraient également servir à regarder l’influence sur le comportement de phase en utilisant d’autres solutions d’intérêt.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail fait partie du consortium MaxSynBio, qui est financé conjointement par le ministère fédéral de l’éducation et de recherche d’Allemagne et de la Société Max Planck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt Avanti Polar Lipids 840475C abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860061 abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %) Avanti Polar Lipids 700000 abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Molecular Probes D-282 abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) Merck
NaCl (> 99.8 %) Roth
HCl (37 %) Roth
Tris (≥ 99.9 %) Roth
Sucrose (≥ 99.5 %) Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL Kimble Soda flat bottom, white screw cap
pH meter Mettler Toledo MP220
Osmometer Gonotec Osmomat030
Epi-fluorescence microscope Zeiss Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA Zeiss LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA Leica 506174
Objective 63x, 0.9 NA Leica 506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläaser
Parafilm "M" Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL Braun
0.45 µm syringe filter GVS North America Cameo 25AS, 1213723 Acetate, sterile

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Chimie numéro 128 vésicules unilamellaires géant chargé des membranes spontanées gonflement méthode microfluidique domaines membranaires asymétrie transmembranaire solution liquide désordonné phase liquide classés en phase coexistence de phase triangle de Gibbs température de miscibilité de fluorescence et de microscopie confocale
Comportement de phase des vésicules chargées dans des Conditions de Solution symétrique et asymétrique suivies avec la microscopie en Fluorescence
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Kubsch, B., Robinson, T., Steinkühler, J., Dimova, R. Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56034, doi:10.3791/56034 (2017).

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