Summary
Esperimenti sulle vescicole unilamellari gigante di fase separati (GUV) trascurano frequentemente condizioni di soluzione fisiologica. Questo lavoro presenta approcci per studiare l'effetto del buffer ad alta salinità sulla separazione di fase liquido-liquido in carica GUV multicomponente come una funzione di trans-membrana soluzione asimmetria e temperatura.
Abstract
Vescicole unilamellari gigante fase separata (GUV) esibendo coesistenza liquido-ordinato e liquido-disordinata domini sono uno strumento comune di biofisico per indagare l'ipotesi di Zattera lipidica. Numerosi studi, tuttavia, trascurano l'impatto delle condizioni di soluzione fisiologica. Su quel conto, i lavori in corso presenta l'effetto di asimmetria di soluzione tampone e trans-membrana di alta salinità sulla separazione di fase liquido-liquido in carica GUV cresciuto da dioleylphosphatidylglycerol, uovo sfingomielina e colesterolo. Gli effetti sono stati studiati in condizioni di temperatura isotermici e variabili.
Descriviamo attrezzature e strategie sperimentali applicabili per il monitoraggio della stabilità di coesistenza liquidi domini in vescicole di caricate in condizioni di soluzione ad alta salinità simmetrica e asimmetrica. Questo include un approccio per preparare GUV multicomponente carica nel buffer ad alta salinità ad alte temperature. Il protocollo prevede la possibilità di eseguire un cambio parziale della soluzione esterna di un passo semplice diluizione, riducendo al minimo la diluizione della vescicola. Un approccio alternativo è presentato utilizzando un dispositivo microfluidico che consente di scambiare soluzione esterna completa. Gli effetti di soluzione sulla separazione di fase sono stati studiati anche sotto diverse temperature. A tal fine, vi presentiamo la progettazione di base e l'utilità di una camera di controllo temperatura costruito in-House. Inoltre, riflettiamo sulla valutazione dello stato di fase GUV, trabocchetti associato con esso e come aggirarli.
Introduction
Fin dall'osservazione del micron imprese domini in vescicole unilamellari gigante fase separata di liquido-liquido (GUV) mediante microscopia a fluorescenza, GUV sono stati utilizzati come sistema modello per studiare il lipido zattera ipotesi1,2 , 3 . Come la zona del loro bilayer autoportante si trova nella gamma di che da cellule biologiche, sono adatti mimici delle membrane del plasma con le zattere ipotizzate. Sono stati effettuati numerosi studi su tali GUV con vescicole dislocate in acqua pura, saccarosio o bassa salinità soluzioni4,5,6,7,8. Queste condizioni, tuttavia, non riflettono l'esposizione fisiologicamente rilevante dei biomembranes per ambienti ad alta salinità e trans-membrana soluzione asimmetria come sono le condizioni per le cellule.
In questo lavoro e in una precedente pubblicazione dal nostro gruppo9, gli Stati di fase di carica GUV multicomponente sono stati esaminati in funzione della presenza di asimmetria di sale e la soluzione attraverso la membrana. GUV sono stati preparati da miscele di differenti rapporti di dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), uovo sfingomielina (eSM) e colesterolo (Chol) nella soluzione di saccarosio (con osmolarità di 210 mOsm/kg) o buffer di alta salinità (NaCl 100 mM, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 mOsm/kg). La scelta del lipido è stata giustificata dai dati già acquisiti nel diagramma di fase di questa miscela6,8.
Una serie di metodi per la preparazione di GUV è disponibile nella letteratura10,11,12 (Nota che qui, non prenderà in considerazione quelli che comportano il trasferimento dei lipidi da una base di olio per una fase acquosa 13 , 14 a causa del pericolo inerente dei residui di olio rimanente nella membrana che possono influenzare il comportamento di fase). La preparazione del Guv nel buffer ad alta salinità è associata a specifiche sfide. Per le soluzioni di forza ionica bassa, il metodo di electroformation15,16 presenta un modo rapido per preparare GUV in alti rendimenti con piccoli difetti10,17. Il metodo si basa su depositando uno strato di lipidi su una superficie conduttiva (l'elettrodo), asciugarli e idratandoli con una soluzione acquosa durante l'applicazione di un campo di CA. Tuttavia, questo metodo richiede regolazioni se sale è presente in soluzione acquosa18,19. Si presume che la forza trainante per la crescita della vescicola di electroformation è elettroosmosi16 che è ostacolato a conducibilità alta20. Quindi, electroswelling di GUV nelle soluzioni ad alta salinità non è un approccio diretto, poichè richiede ottimizzazione per diverse concentrazioni saline presenti nella soluzione gonfiore. Gel-assistita vescicola gonfiore21,22 è un'alternativa potenziale per electroformation con ancora più veloci tempi di formazione. Questo approccio si basa sull'idratazione di pellicola lipidica migliorata quando un gel (agarosio o alcol polivinilico (PVA)) viene utilizzato come substrato. Questi approcci, tuttavia, vengono con il rischio di contaminazione della membrana nel caso basati su agarosio gonfiore23 limiti e/o temperatura come nel caso di gonfiore a base di PVA. Allo stesso modo, un protocollo di crescere GUV su un substrato di carta di cellulosa è stato recentemente stabilito24. Problemi generali di questo metodo sono la mancanza di controllo sopra la purezza di substrato, nonché l'utilizzo di grandi quantità di lipidi. In questo lavoro, vi presentiamo e presentare i vantaggi del metodo più tradizionale per la preparazione di GUV, vale a dire la spontanea gonfiore metodo25,26. Si compone di uno strato di lipidi su un substrato lipofobo, idratante e in atmosfera di vapore acqueo e conseguente gonfiore nella soluzione desiderata gonfiore di essiccazione (Vedi dettagli nella sezione protocollo e Figura 1 ). Questo metodo non offre controllo della distribuzione di dimensione delle vescicole e si traduce in generale più piccole vescicole rispetto ai metodi dove la produzione è assistita dal campo elettrico, substrato polimerico o microfluidici significa. Tuttavia, la qualità della vescicola e la dimensione è appropriato per esaminare lo stato della fase di membrana come esplorato qui.
Creazione di asimmetria tra le soluzioni attraverso la membrana della vescicola è associato con determinate sfide pure. Un approccio comunemente utilizzato è la diretta diluizione della sospensione della vescicola nella soluzione esterna desiderata27,28. Tuttavia, questo inoltre fa diminuire la densità di distribuzione della vescicola. Un'altra strategia è quello di scambiare lentamente la soluzione esterna intorno GUV si stabilirono nella parte inferiore di una cella di flusso che consente la soluzione in - e impiegano. Per evitare di disturbare o addirittura perdere le vescicole con il flusso, basse portate sono applicate8, che rende questo approccio inefficienti in termini di tempo. Inoltre, nessuno di questi approcci garantisce un cambio di soluzione completa esterna. Una soluzione ovvia è di immobilizzare le vescicole al fine di evitare di perderli durante uno scambio di soluzione esterna. Per esempio, può essere legato biotinylated GUV su una superficie rivestita con streptavidina29. Tuttavia, questo approccio può portare a variazioni composizionali presso l'aderito e quindi la membrana non aderito segmenti30,31. L'applicazione della magnetoterapia o campi elettrici per intrappolare risultati di vescicole in imponenti membrana tensione32. Che impiegano pinzette ottiche per intercettare una vescicola è necessario avere un manico attaccato (cioè una perlina), mentre l'uso di barelle ottiche può coinvolgere il riscaldamento locale33. Intrappolamento di GUV può essere effettuata anche coltivandoli su fili di platino senza distacco finale34. Questo tuttavia produce vescicole che non sono isolate e che sono di solito collegati ai cavi o altre vescicole di tubi sottili del lipido (attacchi).
Il lavoro presentato evidenzia strategie per superare le limitazioni di cui sopra. Presentiamo innanzitutto una descrizione dettagliata del metodo gonfiore spontanea adattato e ottimizzato per la produzione di GUV nei buffer di alta salinità. Introduciamo poi due approcci per creare in modo efficiente condizioni di soluzione asimmetrica mediante semplice diluizione o l'utilizzo di un dispositivo microfluidico. Perché il nostro obiettivo è l'analisi dello stato di fase della membrana del Guv in condizioni di soluzione diversa, le sezioni successive descrivono i criteri per l'analisi statistica successo e presenti suggerimenti per evitare false categorizzazione.
Le analisi sono state eseguite sotto condizioni isotermiche e sotto diverse temperature. Mentre la temperatura control è comunemente impiegato, i dettagli sulle camere di temperatura-controllo sperimentale sono raramente descritte. Qui, è presentata un'installazione costruita in-House per osservare GUV alle varie condizioni di temperatura.
Protocol
1. spontaneo gonfiore di GUV
Nota: cloroformio è una sostanza nociva, che è altamente volatile. Eseguire tutte le operazioni che coinvolgono il cloroformio sotto cappa aspirante. Non usare plastica da laboratorio quali puntali o contenitori di plastica per il trasferimento e/o conservazione delle soluzioni di cloroformio. Cloroformio si dissolve in plastica, che contamina la soluzione. Utilizzare siringhe in vetro e contenitori di vetro invece. Inoltre, lavoro più pulito possibile per evitare l'introduzione di impurità possono interagire con le membrane. Si noti che le concentrazioni nel lipido tipico in finale GUV preparati sono nella gamma micromolar, quindi impurità in tale intervallo di concentrazione possono avere un effetto forte sul comportamento della membrana.
- a parte la dotazione di base, hanno i seguenti elementi pronti.
- Preparare un politetrafluoretilene (PTFE, comunemente noto come Teflon) piastra per deposizione lipidica di dimensioni ~1.5 cm x 1,5 cm e spessore appropriato. Irruvidire la piastra su un lato con carta abrasiva fine.
Nota: PTFE è lipofobo e verrà non essere bagnata da soluzioni di cloroformio se liscia. Entrambi i lati della piastra PTFE possono essere irruviditi per evitare confusione sul lato corretto per la deposizione di lipidi. Lo spessore del piatto dovrebbe essere scelto per maneggevolezza, ad esempio che non è troppo flessibile e può essere facilmente coperto dalla soluzione di idratazione (Vedi Figura 1). Qui abbiamo utilizzato piastre di ~ 2 mm di spessore. Una volta irruvidito, la piastra PTFE possa essere riutilizzata per nuovi esperimenti dopo una corretta pulizia (punto 1.3). - Preparare un flaconcino di vetro sigillabili di volume appropriato (~ 15 mL) per la crescita del lipido finale idratazione e vescicola.
- Preparare un contenitore di vetro richiudibile in cui si inserisce la fiala in vetro ~ 15 mL; verrà utilizzato per creare un ambiente saturo d'acqua per pre-gonfiore di pellicola lipidica, Vedi Figura 1.
- Preparare un politetrafluoretilene (PTFE, comunemente noto come Teflon) piastra per deposizione lipidica di dimensioni ~1.5 cm x 1,5 cm e spessore appropriato. Irruvidire la piastra su un lato con carta abrasiva fine.
- Preparare 4 mM scorte di lipidi nel desiderato rapporto di 1,2 - dioleoyl - sn - glicero - 3 - fosfo-(1 ' - rac - glicerolo) (sale di sodio) (DOPG), uovo sfingomielina (eSM) e colesterolo (Chol), con ulteriori 0,1 mol % 1,1 ′ - Diottadecilbis - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiIC 18) ad una concentrazione di lipidi totali di 4 mM. Usare cloroformio come solvente. Vedere la tabella dei materiali.
- Sciacquare accuratamente la piastra PTFE e il contenitore di vetro con detersivo commerciale, etanolo e cloroformio in quella sequenza e infine asciugarle.
- Utilizzando una siringa di vetro, depositare e distribuire uniformemente 10-15 µ l di stock lipidica sul lato ruvido della piastra PTFE per creare un film lipidico uniforme. Utilizzare l'ago della siringa per diffondere la soluzione, se necessario.
- Collocare la piastra PTFE su una superficie pulita ed essiccare e insieme il film lipidico depositato per 2 ore a 60 ° C per rimuovere il cloroformio. Per motivi di convenienza, depositare la piastra nel contenitore di vetro puliti e non sealed 15ml durante dissecazione.
Nota: La temperatura elevata assicura che il film lipidico è in uno stato di singolo-liquido omogeneo in questo e in tutti i passaggi successivi. - Dopo il loro disseccamento, riempire il contenitore di vetro pre-gonfiore con acqua deionizzata fino ad un livello che non consente la galleggiabilità per battere sopra la fiala in vetro ~ 15 mL (~ 1 cm), Vedi Figura 1.
- Mettere il vetro ~ 15 mL fiala con la piastra PTFE nel contenitore e coprirlo in modo che può emergere un ambiente saturo d'acqua, cfr. Figura 1B.
Nota: Acqua di condensa alle pareti contenitore interno dà una buona indicazione per saturazione di vapore acqueo successo. - Let il film lipidico depositato si pre-gonfiano all'interno del contenitore di vetro chiuso a 60 ° C per 4 h. Entro questo periodo di tempo preparare la soluzione desiderata gonfiore.
Nota: Per le preparazioni di vescicole che possono essere condotti a temperatura più bassa, questa volta si estremamente abbrevia - pochi minuti - se caldo saturo d'acqua azoto o argon è usato per il pre-gonfiore invece.- Preparare 200mm saccarosio o NaCl 100 mM, 10 mM Tris, pH 7.5 regolato con HCl e riscaldare fino a 60 ° C per rendere la soluzione gonfiore.
- Dopo il pre-gonfiore, prendere il bicchiere di ~ 15 mL con la piastra PTFE fuori dal contenitore. Con una siringa collegata ad un filtro da 0,45 µm, aggiungere ~ 5 mL della soluzione di gonfiore nel flaconcino di vetro da 15 mL per idratare il film lipidico.
Nota: Fissare un ago al filtro facilita l'inserimento della soluzione gonfiore. Preriscaldare la siringa e il filtro può essere consigliabile per garantire uno stato di singolo-liquido fase del film lipidico durante l'aggiunta della soluzione di gonfiore. La soluzione di filtraggio riduce al minimo (in-) contaminazioni organiche di batteri o precipitato sale ecc - sigillare la fiala in vetro ~ 15 mL che tiene il film lipidico idratato sulla piastra PTFE per minimizzare evaporazione. Se necessario, utilizzare paraffina pellicola per migliorare la tenuta. Lasciare il film lipidico idratata a 60 ° C durante la notte per finale GUV gonfiore.
2. Raccolta GUV
Nota: l'aggregazione di GUV gonfie e staccato dai risultati di substrato PTFE in un ciuffo di tipo cloud piccolo (~ 1 mm) visibile dall'occhio. Sembra biancastro quando non viene utilizzata tintura di fluorescenza. In caso contrario, è colorato secondo lo spettro di assorbimento del fluoroforo. L'aggiunta di DiIC 18 rende la nuvola rosa (Vedi Figura 2). Le vescicole sono concentrate in forma aggregata e raccolta esso massimizza la resa di vescicola.
~1/10- cool giù le vescicole a temperatura ambiente all'interno ~ 1 h. taglio dell'aggregazione delle vescicole per adattarsi attraverso l'orifizio o fine punta della punta plastica di una pipetta a pistone per il cluster.
Nota: Il tasso di raffreddamento è particolarmente importante se la separazione di fase solido-liquido è previsto come si altera la dimensione dei domini solidi. Qui, per rallentare il raffreddamento, abbiamo messo il campione a contatto con un blocco di metallo di dimensioni 5 x 9,5 cm x 7.5 cm (H x L x P) che si raffreddi a temperatura ambiente entro 1 h. - Pipetta fino il cluster insieme ad un appropriato volume della soluzione di gonfiore (Vedi Figura 2). Risospendere l'aggregato nella soluzione gonfiore per creare condizioni di soluzione simmetrica, o qualsiasi desiderato soluzione isoosmotica per creare condizioni di soluzione asimmetrica.
Nota: Il limite inferiore del volume è limitato dalle dimensioni dell'aggregato ad essere vendemmiato completamente. La soluzione esterna viene diluita e al fine di valutare la concentrazione esatta, il volume della soluzione della vescicola deve essere presa in considerazione.
3. Osservazione di GUV per fase stato valutazione mediante microscopia a fluorescenza
Nota: The Guv erano drogate con DiIC 18 come un marcatore fluorescente. Questo fluoroforo tramezzi preferenzialmente nella fase liquido-disordinata (Ld). Questo permette l'osservazione di microscopia di fluorescenza di domini derivanti dalla separazione di fase nel GUV. Abbiamo effettuato la valutazione dello stato di fase con microscopia di epi-fluorescenza. In linea di principio, queste osservazioni sono anche realizzabili utilizzando confocale a scansione laser (CLSM), che permette anche per la quantificazione di segnale (ad esempio per determinare la membrana unilamellarity). Tuttavia, CLSM richiede attrezzatura più sofisticata e (solitamente) epi-fluorescenza osservazioni prima della scansione sono utili in ogni caso.
- Decidere su un obiettivo (ad es. 40 ingrandimenti con un 0,6 apertura numerica (NA) come usato qui) per osservare il GUV e utilizzarlo in modo coerente quando si confrontano gli Stati fase della stessa composizione in diverso solution condizioni. Utilizzare filtri di lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione appropriati per consentire osservazioni di fluorescenza con il fluoroforo utilizzato (ad es. eccitazione a 560 nm ± 40 e 630 ± 75 nm con un 585 divisore di fascio nm in mezzo come quello usato per DiIC 18).
Nota: I limiti di stato di fase all'interno di un diagramma di fase dipenderà la risoluzione che raggiunge l'obiettivo dato che definisce la dimensione minima della micro-domini per essere rilevato. - Per l'analisi, selezionare solo GUV che soddisfano i seguenti criteri di qualità.
- Garantire unilamellarity della membrana GUV di osservazione visiva delle diverse vescicole e confrontare la loro intensità; vescicole con la minima intensità di emissione di fluorescenza sono più probabile unilamellari.
Nota: Gonfiore spontanea può produrre lotti di vescicola dove una grande frazione di vescicole giganti non sono unilamellari. - Eseguire un ulteriore controllo di quantificare l'intensità di emissione di fluorescenza di presumibilmente unilamellari vescicole giganti e controllare il segnale corrispondente per diffusione all'interno della popolazione. Se non integer tra diversi GUV si osservano differenze, tutti loro sono suscettibili di essere unilamellari.
Nota: Se le vescicole sono preparate da lipidi convenzionali utilizzando un metodo stabilito come gonfiore spontanea, l'approccio descritto sopra per il rilevamento delle vescicole unilamellari è sufficiente. Se stabilire un nuovo protocollo di preparazione GUV o utilizzando i lipidi non convenzionali, studi più approfonditi dovranno confermare unilamellarity. Per esempio, i segnali di fluorescenza di membrana delle vescicole etichettati preparate da un nuovo protocollo potrebbero essere paragonati a quelli di GUV preparato da un metodo stabilito; o la membrana poro proteina α-emolisina può essere inserito in vescicola membrane 24. Colorante aggiunto all'esterno delle vescicole sarebbe quindi entrare loro interno o non, a seconda della presenza di uni - o vescicole multilamellari, rispettivamente. - Assicurarsi che il capo abbia un diametro minimo ragionevole per domini di essere ancora riconoscibile.
- Assicurarsi che il capo non ha (quasi) difetti quali parti sporgenti o aderite o le strutture interne.
- Garantire unilamellarity della membrana GUV di osservazione visiva delle diverse vescicole e confrontare la loro intensità; vescicole con la minima intensità di emissione di fluorescenza sono più probabile unilamellari.
- Trasferire un'aliquota di GUV sospensione su un vetrino da microscopio e sigillare correttamente. Preparare una camera di osservazione.
- Depositare il campione sul vetrino del microscopio. Lo circondano da un distanziatore in silicone con un ritaglio circolare centrale. Per evitare contaminazioni, accertarsi che il distanziale non è in contatto con il campione. Sigillare l'interno posizionando un coprioggetto sopra il distanziatore in silicone.
Nota: Anziché il silicone distanziatore uno possibile utilizzare grasso al silicone o distanziali polydimethysiloxane fatti in casa (PDMS). La camera di tenuta garantisce la minima evaporazione del campione e mantiene condizioni di iso-osmolari. - Lasciare il campione per ~ 5 min per riequilibrio dei possibili domini.
Nota: Lo stress meccanico da pipettaggio può mescolare i domini di membrana, che hanno bisogno di tempo per riforma. - Porre il vetrino del microscopio con il campione sul palco microscopio e analizzare lo stato della fase del GUV batch in un approccio statistico. Più di 30 GUV per ogni batch di osservare e determinare il loro stato di fase secondo i seguenti criteri per la valutazione dello stato di fase GUV con DiIC 18 ( Figura 3).
Nota: Dopo la loro crescita, le vescicole possono cambiare loro composizioni individuali a causa (per esempio) dominio in erba fuori o lo scambio di materiale della membrana tramite nanotubi. GUV pertanto mostrano variazioni composizionali entro la stessa partita 35. Fase- single-liquido o liquido-ordinato (Lo) o liquido-disordinata (Ld): assicurarsi che la forma complessiva GUV è sferica e liscia e DiIC 18 è distribuita omogeneamente nella membrana (prime immagini nei pannelli superiore e inferiore in < forte classe = "xfig" > figura 3).
- Stato di coesistenza di due fasi Lo + Ld: garantire che le vescicole presentano domini che appaiono circolari con contorni lisci; secondo la DiIC 18 partizionamento comportamento domini sono rosso brillante (Ld) o scuro rosso/nero (Lo) (secondo immagini in alto e pannello inferiore in Figura 3, in falsi colori). Verificare che i domini siano liberi di diffondere sulla superficie delle vescicole e possono fondersi.
- Bifase solido (S) + stato coesistenza liquido (S + Lo o S + Ld): assicurarsi che i domini possono apparire simili a dita o tondeggianti ma con i limiti angolari (terzi immagini nei pannelli superiore e inferiore nella Figura 3). Osservare i domini liquidi (rosso) su un solido background (nero) che non visualizzerà la diffusione. Al contrario, solido (nero) domini saranno liberi di diffondere su una priorità bassa liquida (rosso).
- Coesistenza trifase S + Lo + Ld: osservare tre tipi di domini che appare: (i) angolare neri domini (S), incorporato in (ii) dim (Lo) e (iii) luminoso (Ld) domini rossi.
- Attribuire la popolazione di GUV per lo stato della fase che è stato determinato per essere dominante tra un campione casuale, come negli esempi seguenti:
- 20 se si osservano GUV singolo-liquido e 15 Lo + Ld Guv, si consideri il batch per essere un singolo-liquido fase.
- Se 10 S + L Guv, 30 Lo + Ld GUV e 25 single-liquido GUV sono osservati, si consideri il batch per essere un LD Lo +.
4. GUV osservazione nel dispositivo microfluidico
Nota: innanzitutto fabbricare il dispositivo microfluidico; dettagli del design dei dispositivi microfluidici e dell'Assemblea sono state date altrove 36 , 37; vedere la Figura 4 per una breve descrizione.
- Preparare fresco GUV gonfiore solution (sale o saccarosio secondo punto 1.8.1) e filtrare attraverso un filtro da 0,45 µm.
Nota: Eventuali impurità nelle soluzioni che scorre può intasare il dispositivo microfluidico. - Pistone di taglio 200 µ l puntali in plastica per pipette e inserirli nei fori nella parte PDMS del dispositivo. Aggiungere 100 µ l e 5 µ l di fresca e filtrata gonfiore soluzione al serbatoio (vedere Figura 5A) e ciascuno del taglio dispensare consigli, rispettivamente. Centrifugare l'intero dispositivo a 900 x g per 10 min in una centrifuga di rotore swing per pre-compilare il dispositivo e rimuovere aria.
- Pre-riempire la siringa di vetro da 1 mL e collegato i tubi con la soluzione di gonfiore e spostare la posizione dello stantuffo a 0 mL.
- Inserire il tubo nella presa fluidico del dispositivo e posizionare la siringa nella pompa a siringa.
Nota: La scelta di siringa e siringa pompa marca non è importante. Tuttavia, siringhe in vetro sono più precisi e la pompa deve essere in grado di operare nel campo di flusso µ l/min. - Collegare un'unità di controllo di pressione personalizzati alle 8 insenature del controllo microfluidico strato (vedere Figura 5A). Impostare la pressione all'unità di controllo di pressione a 3 bar (aria, azoto o argon), ma impostare le valvole al dispositivo microfluidico nella posizione di chiusura.
- Posizionare il dispositivo microfluidico, ora collegato all'unità di controllo pressione e pompa siringa, su un palcoscenico di microscopio confocale rovesciato.
- Uso un obiettivo con lo stesso ingrandimento e NA come durante le osservazioni di massa. Controllare se le statistiche di stato di fase come spiegato nel passaggio 3,7 rimangono gli stessi, se un altro obiettivo è utilizzato per evitare artefatti di osservazione che si basano su differenti risoluzioni.
- Caricare il GUV nel dispositivo.
- Prima, pipetta via tutti tranne 25-50 µ l della soluzione che è rimasta nel serbatoio. Aggiungere 150 µ l della soluzione GUV (in saccarosio o sale secondo punto 1.8.1, ma di corrispondenza il soluzione utilizzata per precompilare il dispositivo al punto 4.1) per il serbatoio e mescolare pipettando delicato. Set di ritirare la siringa da 10 µ l/min di portata in modalità per circa 20 minuti o fino a più di 90% delle trappole sono occupati.
Nota: Il serbatoio non dovrebbe essere consentito di funzionare a secco. Se questo accade, le bolle d'aria entrerà i micro-canali. Aggiungere ulteriori GUV soluzione al serbatoior durante il caricamento ma fare attenzione a non introdurre bolle d'aria quando si pipetta nel dispositivo.
- Prima, pipetta via tutti tranne 25-50 µ l della soluzione che è rimasta nel serbatoio. Aggiungere 150 µ l della soluzione GUV (in saccarosio o sale secondo punto 1.8.1, ma di corrispondenza il soluzione utilizzata per precompilare il dispositivo al punto 4.1) per il serbatoio e mescolare pipettando delicato. Set di ritirare la siringa da 10 µ l/min di portata in modalità per circa 20 minuti o fino a più di 90% delle trappole sono occupati.
- Aprire tutte le valvole di unità di controllo pressione per chiudere le valvole di anello microfluidici intorno le trappole/GUV. Impostare la pompa a siringa 0 µ l/min. Dopo 1 h, osservare le GUV e registrare immagini confocale. Emozionare e rilevare il GUV secondo il fluoroforo utilizzato (ad es. eccitazione a 561 nm e rilevamento tra 580-620 nm per quanto riguarda DiIC 18). Utilizzare gli stessi criteri di selezione dal passaggio 3.6 , e prendersi cura di prendere nota della posizione di ogni GUV (cioè la colonna e riga numero, Vedi Figura 4)
- la soluzione di Exchange che circonda il Guv .
- Set pompa a siringa a 0 µ l/min e via tutti ma di 25 a 50 µ l della soluzione GUV dal serbatoio. Aggiungere 150 µ l della soluzione 2 ° (in saccarosio o sale secondo punto 1.8.1, a seconda della soluzione desiderata di fuori del Guv) serbatoio e mescolare pipettando delicato. Via tutti ma di 25 e 50 µ l di soluzione tampone dal serbatoio.
Nota: Questa soluzione deve essere filtrata con un filtro da 0,45 µm troppo.
- Set pompa a siringa a 0 µ l/min e via tutti ma di 25 a 50 µ l della soluzione GUV dal serbatoio. Aggiungere 150 µ l della soluzione 2 ° (in saccarosio o sale secondo punto 1.8.1, a seconda della soluzione desiderata di fuori del Guv) serbatoio e mescolare pipettando delicato. Via tutti ma di 25 e 50 µ l di soluzione tampone dal serbatoio.
- Ripetere il passaggio precedente, almeno 5 volte per sostituire completamente la soluzione nel serbatoio. Impostata la siringa 10 µ l/min di portata nel prelevare modalità per ~ 10 min sostituire la soluzione nei micro-canali.
- Ridurre la velocità di flusso da 1 µ l/min. aprire le valvole di unità controllo 8 pressione per 2 s e richiudi (con conseguente apertura e chiusura delle valvole anello microfluidica). Impostare nuovamente la portata a 0 µ l/min.
- Dopo 1 h, osservare le GUV e registrare immagini confocale. Ancora una volta, fare attenzione a notare la colonna e la riga della micro-camera dove si trova per consentire comparazioni del GUV stesso prima e dopo il cambio di buffer esterno ogni GUV.
5. Progettazione e calibrazione della camera temperatura-controllo
Nota: una camera adatta per controllo della temperatura può essere ottenuta commercialmente o autocostruite. Controllo della temperatura viene solitamente ottenuta da accoppiamento termico della camera con il campione GUV a bagno d'acqua o un elemento Peltier. Qui, descriviamo la progettazione e caratterizzazione di una camera di casa costruita-controllo della temperatura di funzionamento con un termostato esterno di acqua. Questi termostati sono disponibili in molti laboratori o possono essere recuperati da vecchie apparecchiature come il laser o spettrometri.
- Montare una camera di flusso di calore, qui, fatto di un blocco di alluminio, con connettori a bagno d'acqua come mostrato nella Figura 6. Sigillare le aperture nella parte superiore e inferiore e abilitare l'osservazione del campo luminoso del campione mediante incollaggio vetri di coperchio al blocco.
- Flip la camera di flusso sul lato dove il campione sarà posizionato e dispensare una goccia di circa 100 µ l della soluzione utilizzata negli esperimenti secondo punto 1.8.1. Opzionalmente, inserire una sonda in fibra ottica di temperatura (ad es. FISO FTI-10) o aggiungere un colorante sensibile alla temperatura in una concentrazione appropriata, ad esempio 500 µM rodamina B.
- Montare la camera di osservazione GUV utilizzando grasso al silicone depositato in forma di anello o alcuni altri distanziatore (PTFE o gomma) e sigillare con un vetro di copertura 0,17 µm. Garantire che la goccia non è a contatto con l'agente di tenuta o il distanziale per evitare l'introduzione di impurità.
- Lentamente raddrizzare la testa in giù e collegare il termostato acqua esterno con adeguata tubazione ad esso. Prestare particolare attenzione alle eventuali perdite d'acqua.
- Insieme la più bassa temperatura sul termostato esterno acqua desiderata e almeno fino a quando la lettura del sensore di temperatura è stabile di portare il sistema; il tempo necessario di equilibramento darà una stima del tempo di risposta minimo del sistema.
- Eseguire esperimenti di controllo almeno una volta prima di utilizzare la camera.
- Misurare la temperatura della soluzione (ad esempio con una sonda in fibra di vetro) e confrontarlo con la lettura del termostato sopra l'intervallo di temperatura di interesse.
- Cerca un offset minimo dalla lettura del termostato e la linearità delle temperature misurate.
- Si verifica per un gradiente di temperatura all'interno della camera di osservazione utilizzando un colorante sensibile di temperatura. Misurare la temperatura della soluzione tramite l'intensità di fluorescenza o fluorescenza lifetime imaging microscopia (FLIM) per distanze diverse dal fondo coprioggetto 40. Inoltre controllare se c'è qualsiasi gradiente di temperatura nella regione di osservazione GUV, come illustrato nella Figura 7.
6. GUV osservazioni a diverse temperature
Nota: in genere, per GUV cui membrane potenzialmente fase-separi e che sembrano essere omogenea alle osservazione temperatura T obs, separazione di fase sarà indotto sotto T obs (se che è osservata dipende dal campo di temperatura studiato). Viceversa, la fase separata vescicole dovrebbero diventare omogenee ad una temperatura superiore a T obs. Tuttavia, questo non deve necessariamente essere il caso per una composizione particolare del lipido (complesso) e potrebbe essere interessante analizzare sempre il tutto accessibile temperatura gamma 38. Il protocollo di osservazione e valutazione delle temperature di transizione di fase non si basa sul metodo specifico utilizzato per controllo di temperatura.
- Montare la camera di osservazione di temperatura secondo la sezione 5, omettendo la sonda ottica di fibra o il fluoroforo termosensibile.
- Impostare il bagno esterno di acqua a temperatura ambiente (23 ° C) e lasciare che il sistema equilibrare per 10-15 min.
- Contare il numero di vescicole di fase separati utilizzando i criteri dal punto 3.6; la fase complessiva dello stato della popolazione GUV darà un suggerimento circa la regione della temperatura di transizione del sistema. Se lo stato della fase in tutta la popolazione di vescicola è piuttosto eterogeneo, passare direttamente al punto 6.5.
- Aumentare (se la maggior parte delle vescicole sono fase separata) o diminuire (se la maggior parte delle vescicole è omogenea) la temperatura a intervalli grossolani (ad es. 1-2 ° C) e lasciare che il sistema equilibrare per circa 2 min ri-valutare lo stato della fase di la popolazione di GUV da significa di un casuale del campione e variare la temperatura fino a quando la popolazione di vescicola Mostra uno stato di fase eterogenea.
- Una volta che la popolazione è vicino al punto di transizione di fase (cioè la fase afferma tra GUV individuali sono piuttosto eterogenea), ridurre l'intervallo di temperatura (ad esempio 0,5 ° C) per aumentare la risoluzione. Lasciare che il sistema equilibrare per ~ 2 min e ri-valutare lo stato della fase della popolazione GUV per mezzo di un campione casuale.
- Una volta passato il punto di transizione di fase, tenere variando la temperatura fino a quando tutte le GUV ora sono omogenei o separazione di fase, rispettivamente.
- Verifica per isteresi valutare se i tempi di equilibrazione siano sufficienti.
- Cambiare la direzione della temperatura scan, io.e. se la scansione è stata eseguita per aumentare la temperatura, fare la scansione facendo diminuire la temperatura.
- Scegliere almeno un sottoinsieme delle temperature per valutare il rapporto di dichiarare GUV popolazione fase (ad esempio 80% fase separata).
- Se deviazioni notevoli tra entrambe le direzioni nel rapporto stato fase indicano isteresi, ridurre la dimensione di incremento di temperatura e/o aumentare il tempo di equilibrazione ai punti 6.4 e 6.5.
- Se non c'è nessuna isteresi indicato dai rapporti uguali, si consiglia di aumentare il tempo di dimensioni e/o di equilibrazione di passaggio.
- Tracciare i rapporti di stato fase contro la temperatura. Per la quantificazione, adattare i dati a un modello appropriato ( Figura 8).
Nota: Le curve di transizione di fase presentano comunemente una traiettoria sigmoidale e il modello di Boltzmann sigmoidale fornisce un set di parametri di montaggio appropriato:
y: frazione di uniforme/fase separata GUV
un 1: il valore della frazione iniziale
un 2: il valore della frazione finale
T: temperatura
T mescolare: temperatura a mezzo massima y
Poiché y è la frazione di GUV omogenea, A 1 e A 2 deve essere fissati a 0 e 1, rispettivamente. Come la miscibilità transizione è presupposto per essere sigmoidale, una volta che il valore della frazione è misurato per essere 0 ad una certa temperatura che tutti i valori di frazione di campo di temperatura qui sotto sono considerati 0. Viceversa, una volta che il valore della frazione è 1 ad una determinata temperatura, tutti i valori di frazione di campo di temperatura sono considerato uguale a 1.
Representative Results
GUV gonfiore
Con l'approccio di gonfiamento spontanea descritto qui, GUV composto DOPG, eSM, e Chol erano coltivati durante la notte a 210mm saccarosio o NaCl 100 mM, 10 mM Tris, pH 7.5 formando un'aggregazione visibile. L'aggregato di raccolta assicura alta vescicola rese. La risospensione nella soluzione gonfiore provocato da condizioni di soluzione simmetrica trans-membrana. Per creare condizioni asimmetriche, l'aggregato era risospesi in un iso-osmolari saccarosio o una soluzione ad alta salinità, rispettivamente (Figura 2). La diluizione risultante corrisponde a un cambio di soluzione quasi esterna, riducendo al minimo la diluizione del numero di GUV.
Mappatura di diagramma di fase del Guv utilizzando la microscopia a fluorescenza
La presenza di 0,1% in moli della fase-specifici DiIC18 nel GUV ammessi per l'osservazione dei loro Stati di fase tramite microscopia a fluorescenza grandangolari. Vescicole che esibiscono la separazione di fase S + L sono state osservate attraverso una x 63 / 1.2NA essere in grado di risolvere finemente strutturato barretta-come i dominii. Per tutti i restanti casi, un 40 x / 0,6 NA obiettivo è stata usata. Per evitare artefatti durante l'ispezione visiva di GUV e per massimizzare la riproducibilità, alcuni criteri sono stati impostati che determinato quali vescicole da considerare per l'analisi di stato di fase (fase di protocollo 3.6).
GUV preparato da DOPG/MES/Chol mischie ternarie di un'ampia gamma di rapporti gonfio in saccarosio o una soluzione ad alta salinità e osservato a temperatura ambiente hanno esibito la separazione di fase omogenea Lo o fasi Ld, Lo + Ld e S + L, vedere la Figura 3. Figura 9 Mostra vescicole esemplarmente difettose, che non dovrebbero essere inclusi nell'analisi dei dati e viene inoltre illustrato come identificare le vescicole multilamellari.
Dovuto la loro storia sconosciuta, GUV sono suscettibili di esporre all'interno del batch variazione compositiva35. Quindi, lo stato complessivo della fase di una particolare composizione è stato determinato in un approccio statistico. GUV popolazioni di una certa composizione lipidica sono stati attribuiti per lo stato della fase che è stato osservato per essere dominante in un campione casuale (protocollo passo 3.6). Eppure, composizioni vicino alla regione di coesistenza Lo + Ld ha reso spesso lotti dove lo stato della fase dominante è costituito da un'esigua maggioranza. Per tali casi vaghi, l'ispezione visiva è stata ripetuta con almeno tre campioni indipendenti. La frazione di vescicole con stato della fase identiche (ad esempio espositrici Lo + Ld separazione di fase) presente all'interno di campioni casuali era una media sopra il numero di prove che è stato preso come il risultato finale (Figura 10).
I protocolli descritti ha provocato una crescita sufficiente GUV sopra una vasta gamma di differenti rapporti di DOPG, MES e Chol nelle soluzioni ad alta salinità e saccarosio. Vaste regioni all'interno del diagramma di fase ternario possono essere mappate in condizioni di soluzione ad alta salinità simmetrica come pure asimmetrica (Figura 11). Le differenze nel comportamento di fase di vescicola osservati in condizioni diverse soluzioni sono state discusse altrove nel dettaglio9.
Osservazioni del comportamento di fase dopo scambio di buffer completo utilizzando il metodo di microfluidica
La creazione di condizioni di soluzione asimmetrica di diluizione provoca residui della soluzione gonfiore all'esterno. Il nostro approccio di microfluidica consente di scambiare soluzione esterna completa. Figura 5A Mostra il dispositivo di microfluidica completamente assemblato sul palco al microscopio confocale insieme fluidica saldi e insenature di controllo di pressione. Tubi sono collegati mediante tubi di metallo di 90 ° per permettere lo spazio per trasmesse imaging di luce dall'alto.
Per osservazione all'interno del dispositivo di microfluidica, un microscopio confocale con una x 63 / 1.2NA obiettivo obiettivo d'immersione in acqua è stato implementato. Come con le precedenti osservazioni in massa, è stato utilizzato DiIC18 a macchiare la membrana. Quando si effettuano osservazioni della fase stato di GUV intrappolato nel dispositivo, prestare attenzione a non interpretare erroneamente i dati. A causa della vicinanza del Guv ai post, i percorsi di luce di eccitazione e di emissione possono essere parzialmente ostruiti da PDMS che conduce la falsa apparenza di domini (Figura 12). Qui, il rilevamento della luce trasmesso è utile per controllare la posizione del Guv presso il post. Questo effetto indesiderato è particolarmente prominente per GUV piccoli di meno di 10 µm di diametro. In questi casi, i dati sono stati respinti. L'immagine confocale in Figura 13A Mostra una sezione planare vescicola che attraversa un dominio Lo presente sulla vescicola GUV. In questo caso, sezione trasversale planare esplorazioni ulteriormente sopra o sotto la sezione sarebbero hanno non hanno mostrato il dominio grazie alle sue piccole dimensioni rispetto a quello di Capo, che è perché esso sarebbe stato mancato e la vescicola considerato in uno stato di fase omogenea. Pertanto, è opportuno utilizzare uno z-stack confocale per ispezionare l'intera superficie GUV. Per microscopia grandangolari, questo potrebbe non essere un problema perché la vescicola intera può essere imaged in una sola volta.
Infine, sono riportati esempi di GUV prima e dopo la sostituzione della soluzione esterna dove è chiaro che la fase sono stati delle membrane (Figura 14). Ogni periferica dispone di 60 camere (ognuna con un paio di post per intrappolare un singolo GUV), permettendo di decine di esperimenti per ogni dispositivo (vedere la Figura 4). Tuttavia, alcuni GUV possono perdersi durante lo scambio di soluzione esterna. Questo può essere minimizzato mediante le seguenti fasi: 1) uso di albumina di siero bovino (BSA) rivestimento per prevenire GUV adesione/rottura presso i posti; rivestimento avviene esponendo le pareti della camera a 20 mg/mL BSA per 60 min e successivo risciacquo con il buffer di lavoro. Un'altra molecola adesiva che potrebbe essere utilizzata è poly(L-lysine)-innesto-poly(ethylene glycol)39. 2) attenta corrispondenza osmotica delle soluzioni interne ed esterne per evitare GUV flaccido, che potrebbe passare attraverso il centro dei post o scoppio GUV. 3) ottimizzare la procedura di preparazione GUV per ottenere vescicole più grande di ~ 8 µm di diametro per evitare il passaggio attraverso il centro dei pali.
Progettazione e caratterizzazione di camera a temperatura controllata per l'osservazione di GUV fase Stati
Abbiamo progettato una camera di flusso semplice, che offre collegamenti con il termostato dell'acqua esterna (Figura 6). Abbiamo ottenuto ilCamera di fresatura di un blocco di alluminio. In generale, il materiale non deve necessariamente essere calore conduttivo, come nell'esempio è accoppiato a bagno d'acqua per il vetro di copertura inferiore come mostrato nella Figura 6B e 6C.
Indipendentemente il disegno esatto, le prestazioni della camera dovrebbero essere valutata. In particolare abbiamo controllato per la linearità della temperatura del campione con la temperatura di set di esternamente, qualsiasi offset di temperatura sistematica e un gradiente di temperatura all'interno della camera. I primi due punti sono stati affrontati tramite la misura diretta della temperatura all'interno della camera da una sonda in fibra ottica di temperatura (ad es. FISO FTI-10). Abbiamo anche controllato per un gradiente di temperatura all'interno della sospensione GUV. Tale una sfumatura potrebbe derivare dal flusso di calore verso l'esterno della camera. Misure di temperatura risolte spazialmente può essere ottenuta da un fluoroforo sensibili di temperatura40, vedere la Figura 7.
Stampa di dati e raccordo per ottenere Tmix di separazione di fase Guv
Tramando la frazione di GUV omogenea sopra la gamma di temperature osservate ha provocato una traiettoria del punto di sigmoidally a forma di dati. Allestiamo i dati per il modello di Boltzmann (protocollo punto 6.8) da cui il Tmix potrebbe essere dedotta (Figura 8).
Figura 1: procedura sperimentale durante il protocollo gonfiore spontanea (pannello superiore) con corrispondenti della fase di crescita delle vescicole (pannello inferiore). (A) A omogenea del lipido film è stendere su una piastra PTFE irruvidita e secchi da qualsiasi solvente. (B) il lipido secco pellicola è quindi pre-gonfio in un ambiente saturo d'acqua all'interno di un contenitore chiuso con acqua per facilitare l'idratazione del doppio strato. La fiala in vetro sub contiene la piastra PTFE e rimane aperta durante questo passaggio di idratazione. (C) il lipido pre-gonfiato film infine diventa completamente idratata con l'aggiunta della soluzione desiderata gonfiore sulla piastra di PTFE rivestito del lipido all'interno del flacone di vetro. Per evitare l'evaporazione, la fiala in vetro è sigillata correttamente durante l'incubazione durante la notte. Per minimizzare le variazioni composizionali all'interno di un batch, tutte le operazioni devono essere eseguite a temperatura dove la miscela di lipidi è completamente miscibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: raccolta GUV. (A) A depositati film lipidico costituito da DOPG/MES/Chol a rapporti molari di 20/60/20 con 0.1 mol % DiIC18 era gonfio nel buffer ad alta salinità è composto da 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5. Il coperchio del contenitore di vetro inoltre è stato sigillato con la pellicola di paraffina. L'area ingrandita di interesse contiene l'aggregato GUV risultante. Il suo aspetto rosso è una conseguenza della presenza di DiIC18. (B) The Guv sono state raccolte con un puntale troncato. In questa immagine, l'aggregato è stato dispensato insieme con 50 µ l di soluzione, di gonfiore che sono stati trasferiti in un flacone di fresco. (C) creare asimmetrica trans-membrana soluzione condizioni, l'aggregato è stato diluito in un'altra soluzione isotonica esterna. Qui, l'aggregato insieme il 50 µ l di soluzione di gonfiore era risospesi in 950 µ l di soluzione di saccarosio risultante in una diluizione di 20x della soluzione gonfiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: GUV imaging. Largo campo immagini di fluorescenza di GUV drogato con 0.1 mol % DiIC18 preparato e osservato in acqua salata simmetrica o saccarosio composto da differenti rapporti di DOPG, MES e Chol (in tampone salino, da sinistra a destra: 40/20/40; 50/20/30; 30/60/10; in saccarosio, da sinistra a destra: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Le immagini raffigurano GUV in diversi Stati di fase (coesistenza), valutati secondo i criteri nel passaggio di protocollo 3.6. Qui, le vescicole erano imaged attraverso un 40 X / 0,6 obiettivo NA. Scala bar = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Layout di progettazione canali microfluidici. GUV inserire lo strato inferiore fluidico (profilati canali) tramite l'ingresso sotto un serbatoio. Un filtro blocca detriti indesiderati dal dispositivo. Essi quindi immettere una matrice di 60 camere (8 righe e 15 colonne) ogni post contenenti per cattura singola GUV (vedere Inserire). Ogni camera può essere isolato all'interno di un'anello valvola azionata da un livello di controllo (canali neri riempiti) sopra il livello fluidico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: dispositivo microfluidico. Fotografia (A) di un dispositivo microfluidico utilizzato per intrappolare GUV singola e completamente la soluzione esterna di exchange. Le etichette indicano il serbatoio per aggiungere soluzioni (1), le 8 x insenature di pressione collegato alla pressione controllo unità (2), e lo scarico della fluidico collegato alla siringa e pompa (3). Pannello (B) Mostra l'unità di controllo pressione con 8 valvole ciascuna regolazione 1 tubo collegato al dispositivo microfluidico. Qui valvole #1 e #2 sono aperti e quindi vengono chiuse le valvole di anello corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: camera di controllo temperatura. Camera di (A)prima del montaggio. (B) camera di assemblati (rivolto verso l'alto) con i vetri di copertura 2 mm incollata alla parte superiore e inferiore. Il distanziale in gomma arancione misura 0,5 mm di altezza ed è sigillato con un vetrino coprioggetto 0,17 mm per l'osservazione della sospensione GUV recintata. In questa immagine è inserita una sonda di temperatura per la calibrazione (fibra marrone uscita dalle camere sulla destra). (C) assemblaggio finale sul palco di un microscopio invertito senza la sonda di temperatura. Il distanziale in gomma arancione ora è rivolta verso il basso. La gomma è adesivo abbastanza per tenere il campione sul posto. Nota che la luce può essere trasmesso attraverso il campione sia che epi-fluorescenza per osservazioni in campo chiaro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: dati di temperatura risolte spazialmente all'interno della camera di osservazione ottenuti da misurazioni di FLIM di un colorante sensibile di temperatura (qui: 500 µM Rodamina B) 40. i punti dati ottengono a 0, 10, 30, 300 e 400 µm sopra il vetrino coprioggetto inferiore. I punti dati di rosso e blu sono stati misurati per la temperatura del bagnomaria impostato a 30 ° C e 12 ° C, rispettivamente. I punti neri indicano acqua vasca sinistra stabilizzare a temperatura ambiente. Piccole variazioni di temperatura durante l'alloggiamento sono state osservate ma siamo state inferiori a 0,5 ° C (barre grigie). L'altezza della camera totale è di circa 500 µm secondo lo spessore del distanziale (Vedi sopra). Le barre di errore indicano le deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: individuare la temperatura di miscibilità. Il grafico mostra i punti dati individuali di omogeneo (singolo-liquido dichiara) la frazione di GUV preparato da DOPG/MES/Chol in un rapporto 30/40/30 drogato con 0,1 mol % DiIC18 da tre campioni casuali indipendenti (N = 20-40). Barre di errore rappresentano errore standard dei mezzi. Punti dati erano montati sul modello di Boltzmann descritto al punto 6.8 (linea nera continua) dal quale è stato dedotto il dominio di temperatura Tmiscelazionemescolare (Segui rosso linea continua di ascissa) secondo il massimo mezzo del sigmoidale curva sull'ordinata (linea nera tratteggiata). Valori iniziali e finali (un1 e2) sono stati fissati a 0 e 1, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: vescicole difettose. Esempi di vescicole giganti preparato da 20/60/20 DOPG/MES/Chol e drogato con 0,1 mol % se DiIC18 che non soddisfano i criteri impostati nel passaggio 4.2 ripreso da microscopia di fluorescenza grandangolari. Intervalli di visualizzazione di intensità di singole immagini sono stati ottimizzati per l'intensità di fluorescenza della vescicola raffigurata ogni volta. A causa della presenza di materiale aggiuntivo della membrana e incapsulate più piccole vescicole, lo stato della fase della vescicola in (A) non può essere chiaramente definito. L'aspetto di questa gigante della vescicola non consente per qualsiasi ispezione visiva affidabile per lamellarity. Pannello (B) raffigura una vescicola di cui l'interno è affollata con materiale della membrana. Di conseguenza, il segnale di fluorescenza della membrana della vescicola esterna si sovrappone con relativo segnale interno, rendendo impossibile la visualizzazione delle lamellarity e potenziali domini. (C) le intensità di fluorescenza di tre diverse vescicole giganti sono mostrate in confronto diretto nello stesso intervallo di intensità di esposizione. Questa immagine mostra che le vescicole multilamellari giganti (1, 2) possono essere identificate dal loro segnale di aumento della fluorescenza rispetto al GUV (3). Qui, multilamellari, nonché mostre di gigante vescicole unilamellari separazione di fase Lo + Ld. Vescicole in tutte le immagini erano imaged attraverso un 40 x / 0,6 obiettivo NA. Scala bar = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: frazione della fase Lo + Ld separati GUV mediato su almeno tre campioni indipendenti. Le vescicole sono state composte di 30/40/30 DOPG/MES/Chol, vicino al confine della regione di coesistenza Lo + Ld. Le barre di errore per condizioni di saccarosio simmetrica illustrano la dispersione lotto. L'etichetta di ordinata descrive soluzioni interno/esterno le vescicole; saccarosio: saccarosio 210 mM; sale: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Barre di errore indicano le deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: diagramma di fase del Guv preparato da DOPG, eSM e Chol mappato in condizioni diverse soluzione utilizzando saccarosio 210 mM (saccarosio) e 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (sale). GUV fase dichiara sono stati esplorati in saccarosio/saccarosio (A; sezione superiore), saccarosio/sale (in/out) (A; inferiore sezione poligonale), sale (B; sezione superiore) e sale/saccarosio (B; sezione poligonale inferiore). Le vignette illustrano il modello di dominio dominante all'interno le sezioni evidenziate e le corrispondenti condizioni di soluzione. Stati di fase della vescicola rappresentati nelle sezioni poligonali inferiori sono stati osservati in condizioni di soluzione asimmetrica sulla diluizione di GUV x 20. Adattato da riferimento9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: manufatti in intrappolati GUV. Esempio di un piccolo GUV dove un dominio falso può essere visto a causa della vicinanza con i post (DOPG/MES/Chol 60/20/20). Il campo chiaro trasmesso luce immagine che mostra i post (grEY) viene sovrapposto all'immagine di fluorescenza confocale del GUV (arancione). I post sono visti per creare un modello di interferenza nell'immagine campo chiaro. Il segnale di fluorescenza nelle vicinanze i post (a destra) è ridotto dando l'apparenza di separazione di fase. Barra della scala = 5 µm.
Figura 13: esempi di due differenti GUV catturato dai messaggi PDMS dove gli Stati di fase sono chiaramente visibili. (A) Lo + Ld fase separata della vescicola di DOPG/MES/Chol 60/20/20. (B) una vescicola è composto da 40/30/30 che esibiscono Ld o Lo monofase. Uno z-stack confocale della vescicola intero è stato esaminato per confermare che non domini (out-of-focus) erano presente. I bordi dei post sono visibili sul lato destro delle immagini (grigio). Barra della scala = 5 µm.
Figura 14: comportamento di fase risultante dopo uno scambio fluidico completo utilizzando il dispositivo microfluidico. Lo stesso capo è indicato prima e dopo il cambio di soluzione per (A) simmetrica/sale (in/out) per sale/saccarosio (in/out) (DOPG/MES/Chol 60/20/20, barra della scala è di 2 µm) e (B) simmetrica saccarosio/saccarosio (in/out) al saccarosio/sale (in e out) (DOPG / MES/Chol 30/40/30, scala bar = 3 µm). Adattato da riferimento9.
Discussion
Produzione di successo di GUV per le osservazioni di stato di fase in condizioni di alta salinità simmetriche e asimmetriche
I protocolli presentati qui introduce una strategia per valutare l'influenza della asimmetria di buffer e soluzione di alta salinità sullo stato della fase di membrana di carica GUV sopra una vasta gamma di composizioni. Una delle sfide principali per raggiungere questo obiettivo era la produzione di carica GUV nei buffer di alta salinità.
Abbiamo prodotto con successo GUV nella soluzione di saccarosio e alta-soluzione salina tampone da un semplice approccio spontaneo gonfiore, che include un passaggio di pre-idratazione del film depositato del lipido e un passo finale idratazione durante la notte per la crescita delle vescicole. È importante notare che la deposizione di lipidi dovrebbe essere fatto su una piastra PTFE irruvidita per garantire dei lipidi anche diffondendo per produrre vescicole unilamellari. Inoltre, è essenziale per eseguire ogni passo durante la preparazione delle vescicole a temperatura dove il film lipidico è in uno stato di fase omogenea e fluida. Altrimenti, la popolazione di vescicola può essere polidispersi nella composizione e l'analisi dello stato di popolazione finale fase di polarizzazione. Il protocollo specifico per il gonfiore spontanea dei rendimenti GUV un ciuffo di vescicola che da un lato offre la possibilità di risospendere in piccoli volumi per ottenere altamente concentrato dispersioni della vescicola e d'altra parte fornisce soluzione asimmetrica condizioni attraverso la membrana riducendo al minimo la diluizione di vescicole8,28. È essenziale che durante la diluizione della vescicola o soluzione esterna scambiare, all'interno e all'esterno osmolarities restano abbinati come cambiamenti di morfologia causati da differenze di osmolarità possono indurre o prevenire Lo + Ld fase separazione41 o, in caso di ipotonico condizioni, può portare a rottura della vescicola.
Qui, tentativi di ottimizzare i protocolli di electroformation in soluzione alta salinità ha provocato la produzione di no GUV mentre gonfiore PVA-assistita ha reso vescicole multilamellari. Anche se richiede tempi più lunghi di preparazione e risultati in lotti della vescicola di inferiore qualità10,17, il successo della produzione di vescicole cariche di spontanea gonfiore è dotato di ulteriori vantaggi. Richiede uno sforzo minimo mentre con conseguente resa sufficiente per analisi statistica lotto e, a differenza di electroformation, senza attrezzature sofisticate o ottimizzazione sono stati richiesti. Inoltre, contaminazioni da ossidazione del lipido non sono stati osservati42,43. Secondo la letteratura ci sono differenze tra composizioni delle vescicole lipidiche e le scorte di corrispondente da cui essi erano cresciuti7,17. Inoltre, la formazione della vescicola su un substrato PTFE non richiede l'inserimento di eventuali contaminazioni in contrasto con metodi gonfiori gel-assistita dove molecole estranee possono essere introdotte dal substrato23. Electroformation è dotato di ulteriori svantaggi legati alla diluizione eccessiva della vescicola durante la creazione di condizioni di soluzione asimmetrica. GUV prodotto da electroformation sono solitamente presenti come una dispersione omogenea (in contrasto con la sospensione di vescicola altamente concentrato sotto forma di un ciuffo formata durante il gonfiamento spontanea). Qualsiasi diluizione della soluzione esterna diluirebbe sostanzialmente il numero delle vescicole pure. Inoltre, nel corso di questo lavoro che è stato osservato che DOPG/MES/Chol GUV prodotto da electroformation in saccarosio è diventato instabile se diluito in un tampone di alta salinità. Fluorescenza da patch del lipido sul vetrino da microscopio indicato che le vescicole sarebbero scoppiata prima loro ispezione visiva era possibile. Tale instabilità può essere ascritta a una tensione elevata membrana delle vescicole preparato da electroformation rispetto a quelli ottenuti da gonfiore spontanea10.
Anche se la diluizione della vescicola è un approccio semplice e veloce per creare condizioni di soluzione asimmetriche GUV, compie solo un cambio parziale soluzione esterna, seppur per un'alta frazione (qui: 95%, Figura 2), in quanto al momento di diluizione, tracce del gonfiore soluzione rimarrà. La scelta del grado di cambio la soluzione esterna è un compromesso tra il pipettaggio fino il ciuffo di vescicola insieme alla soluzione gonfiore (sezione 2) e non diluirla troppo. Quindi, abbiamo introdotto un approccio alternativo microfluidici discusso altrove in dettaglio37 che permette per un cambio veloce e completa soluzione esterna durante le osservazioni GUV fase stato di verificare le osservazioni dello stato fase per diluito vescicole. Le osservazioni delle variazioni di stato di fase quando cambia da simmetrica in condizioni di soluzione asimmetrica in effetti sono state osservate per essere d'accordo. Inoltre, entrambi i metodi per generare condizioni di soluzione asimmetrica mostrate qui sono relativamente veloci (confronta Rif.8) e venire con nessun rischi noti delle alterazioni di composizione locali (confrontare riferimenti30,31), aumentare la tensione della membrana (confronta riferimento32), o riscaldamento locale (confronta riferimento33), per quanto riguarda i metodi alternativi descritti nell'introduzione. Durante l'intrappolamento di microfluidica, un equilibrio osmotico tra esterno e interno delle vescicole non è solo essenziale per evitare artefatti di stato fase come accennato in precedenza, ma anche deflazione causata da condizioni di soluzione ipertonica potrebbe causare il GUV intrappolati a scivolare attraverso il post dopo un cambio di soluzione esterna.
Anche se il gonfiore spontanea è stata applicata correttamente per crescere uncharged vescicole da un sistema DOPC/MES/Chol, in altri casi, l'assenza di oneri possono compromettere GUV gonfiore a causa della mancanza risultante di repulsione tra i singoli strati lipidici44 . Proroga del periodo pre-gonfiore o introdurre headgroups ingombranti del lipido può ricambiare questo problema45. Inoltre, la stabilità della vescicola dopo la loro diluizione in soluzioni diverse da quella utilizzata per gonfiore può differire per composizioni diverse lipidiche e diluizione media, che non abbiamo studiato qui. Inoltre non abbiamo esplorato la possibilità di tuning il diametro GUV medio con il metodo di preparazione presentato qui. Ma parametri quali la composizione della vescicola e gonfiore soluzione sono suscettibili di influenzare i risultati. L'applicazione di metodi alternativi46 può produrre vescicole più grandi per i lipidi e le soluzioni utilizzati qui, tuttavia, possono venire con altri inconvenienti connessi con il metodo. L'approccio sopra descritto per produrre GUV in condizioni di alta salinità simmetriche e asimmetriche fornisce un potenziale strumento per ulteriori studi di vescicole costituito da composizioni lipidiche diversi e dispersi in diversi media. Come non abbiamo esplorato le possibilità, le prove future verranno mostrerà come generalmente possono essere applicati i metodi di preparazione e diluizione di GUV.
Osservando la separazione di fase a temperature variabili
Esistono diverse configurazioni sperimentali adatti a studiare GUV a temperature variabili. Mentre queste configurazioni non sono comunemente descritte in dettaglio all'interno della letteratura, il lavoro attuale presenta un assembly di base applicabile per tali studi.
controllo misurazioni mostrano che la temperatura di questo in-House progettata e costruita da camera è proprio controllata da un termostato e gradienti di temperatura all'interno della camera sono all'interno della risoluzione temperatura sperimentale. È accertato che le condizioni termiche sperimentali sono coerenti con la lettura del termostato.
Durante la valutazione degli Stati di fase GUV sopra un ampio intervallo di temperature, è importante che le vescicole osservate sono ben equilibrate dopo la temperatura è stata cambiata. Un possibile modo per garantire questo è per cercare di isteresi. Se l'isteresi sono presente, i passaggi di temperatura devono essere ridotta e/o tempi di equilibrazione aumentati. Come temperatura controllo in quest'opera è stabilito da un termostato a base d'acqua, la gamma di temperature di esercizio è idealmente limitata a 0 - 100 ° C. Questa gamma può essere espansa utilizzando altri liquidi controllo temperatura olio o che impiegano altre configurazioni, ad esempio un dispositivo Peltier. In pratica, la temperatura di lavoro è limitata anche dalla possibile la condensazione o l'evaporazione. Inoltre, per temperature lontano dalla temperatura ambiente, la presenza di un gradiente di temperatura allo stato stazionario attraverso la camera di osservazione diventa più probabile. Inoltre, le apparecchiature di imaging possono essere danneggiata a temperature estreme. Per intervalli di temperatura tipici appropriati per studi di vescicola del lipido (~ 10-50 ° C7,9) danni all'apparecchiatura di osservazione dovrebbero essere considerato ma in genere non sono previsto.
Artefatti di osservazione di dominio della vescicola
Ci sono una serie di fonti per manufatti di osservazione utilizzando la microscopia a fluorescenza grandangolari. Prima di tutto, uno dovrebbe essere consapevole che la risoluzione massima r dell'oggetto applicato per l'ispezione visiva della vescicola fase stati determina il limite di rilevamento di domini lipidici secondo:
dove λ è la lunghezza d'onda di emissione, e NA è l'apertura numerica dell'obiettivo. Un tipico obiettivo con un 40x ingrandimento e un NA di 0,6 che rileva l'emissione verde chiaro intorno 560 nm avrebbe raggiunto una risoluzione ottica di ~0.6 µm. quindi, studi che confrontano gli Stati di fase delle vescicole fatto da miscele di particolare lipidi tra diversi condizioni devono utilizzare lo stesso obiettivo per la stessa miscela di lipidi.
Un altro elemento è la presenza di domini lipidici come conseguenza di foto-ossidazione del lipido a causa di una lunga esposizione alla luce di eccitazione41. Foto-danno si verifica preferenzialmente su molecole di idrocarburo insaturo del lipido. Infatti, per alcune composizioni del lipido, tale formazione di dominio delle vescicole inizialmente omogenee è stato osservato qui dopo un lungo periodo di esposizione alla luce di eccitazione (~ 30 s). Per contrastare tale problema, la luce di eccitazione è stata mantenuta focalizzata in un campo di vista per solo pochi secondi per la valutazione dello stato della fase. Quindi, DiIC18 era adatto per i nostri scopi. Altri coloranti, tuttavia, possono essere molto più sensibile e potrebbero essere necessario essere gestita a bassa intensità di eccitazione e con tempi di esposizione alla luce di eccitazione.
Sollecitazione meccanica dal trasferimento delle vescicole pipetta mescola potenzialmente domini temporaneamente, quindi falsare il comportamento di fase di apparente della vescicola. Per alcune partite, diverse vescicole hanno mostrato comportamenti differenti di fase 0 min e 5 min dopo pipetta trasferire sul microscopio coprivetrino. Anche la sollecitazione di taglio indotta dal flusso del fluido nel dispositivo microfluidico ha dimostrata di provocare il dominio47di miscelazione. Vescicole dovrebbero essere lasciate indisturbate per un sufficiente lasso di tempo di equilibramento prima dell'osservazione. All'interno di questo studio, vescicole intrappolate sul dispositivo microfluidico sono rimasti indisturbate per 1 h dopo il caricamento della vescicola e gli scambi di soluzione prima dell'osservazione.
Per evitare alcune delle suddette difficoltà così come la restrizione imposta dal limite di diffrazione della luce, metodi alternativi come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare48 o super risoluzione microscopia tecniche49 potrebbe essere impiegato.
Conclusioni e prospettive
Il lavoro presentato dimostra un insieme di metodi che permette l'analisi dell'influenza delle condizioni di alta salinità soluzione simmetrica e asimmetrica sulla separazione di fase della membrana. Tutti i metodi presentati sono adatti per altre applicazioni. Il dispositivo microfluidico, ad esempio, fornisce una piattaforma per studiare la cinetica di formazione di dominio e scomparsa dopo l'induzione dell'asimmetria di soluzione. Inoltre, aspetto di dominio in funzione della concentrazione di sale potrebbe essere esaminato in questo modo. Tutti i metodi potrebbero essere utilizzati anche per all'influenza il comportamento di fase utilizzando qualsiasi altre soluzioni di interesse.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro fa parte del Consorzio MaxSynBio, che è finanziato congiuntamente dal Ministero federale dell'educazione e ricerca di Germania e della Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
| chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
| cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
| Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
| NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
| HCl (37 %) | Roth | ||
| Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
| Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
| Parafilm | |||
| Threaded vial 45x27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
| pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
| Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
| Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
| Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
| Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
| Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
| Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
| Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
| 0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |
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