Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fase Behavior af ladede vesikler symmetriske og asymmetriske løsning betingelser overvåges med Fluorescens mikroskopi

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56034
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

Summary

Eksperimenter på fase adskilt giant unilamellar vesikler (GUVs) ofte forsømmer fysiologiske løsning betingelser. Dette arbejde præsenterer tilgange for at studere effekten af høj-saltholdighed buffer på væske-væske faseadskillelse i opladet stand GUVs som en funktion af trans-membran løsning asymmetri og temperatur.

Abstract

Fase-adskilt giant unilamellar vesikler (GUVs) udstiller sameksisterende væske-bestilt og væske-uordnede domæner er en fælles biofysiske værktøj til at undersøge lipid tømmerflåde hypotese. Talrige undersøgelser, men forsømmer virkningen af fysiologiske løsning betingelser. På denne konto præsenterer den aktuelle arbejde effekten af høj-saltholdighed buffer og trans-membran løsning asymmetri på væske-væske faseadskillelse i ladede GUVs vokset fra dioleylphosphatidylglycerol, æg sphingomyelin og kolesterol. Virkningerne var studerede under isotermiske og varierende temperatur betingelser.

Vi beskriver udstyr og eksperimenterende strategier anvendes til overvågning stabiliteten af sameksisterende flydende domæner i opladet vesikler symmetriske og asymmetriske høj saltholdighed løsning betingelser. Dette omfatter en strategi for at forberede opladet stand GUVs i high-saltholdighed buffer ved høje temperaturer. Protokollen indebærer mulighed for at foretage en delvis udveksling af den eksterne løsning for en enkelt fortynding trin samtidig minimere vesikel fortynding. En alternativ tilgang er præsenteret, udnytter en mikrofluid enhed, der giver mulighed for en ekstern totalløsning udveksling. Effekterne løsning på faseadskillelse var også studerede under varierende temperaturer. Med henblik herpå præsenterer vi de grundlæggende design og nytten af en in-house indbygget temperatur kontrol kammer. Desuden vi reflektere vurdering af tilstanden GUV fase faldgruber forbundet med det og hvordan man kan omgå dem.

Introduction

Nogensinde siden observation af micron mellemstore domæner i væske-væske fase-adskilt giant unilamellar vesikler (GUVs) af Fluorescens mikroskopi, er GUVs blevet brugt som et modelsystem til at undersøge lipid tømmerflåde hypotese1,2 , 3 . Da området i deres fritstående tolagede ligger i intervallet af det biologiske celler, er de egnede efterligner af plasma membraner byder de hypotetisk flåder. Talrige undersøgelser på sådanne GUVs er blevet udført med vesikler spredt i rent vand, saccharose eller lav-saltholdighed løsninger4,5,6,7,8. Disse betingelser, dog afspejler ikke fysiologisk relevante eksponering for Biomembraner høj saltholdighed miljøer og trans-membran løsning asymmetri som er betingelserne for celler.

I dette arbejde og i en tidligere publikation fra vores gruppe9blev fase stater i opladet stand GUVs undersøgt som en funktion af tilstedeværelsen af salt og løsning asymmetri på tværs af membranen. GUVs blev fremstillet af blandinger af forskellige nøgletal for dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), æg sphingomyelin (eSM) og kolesterol (Chol) i enten rørsukkeropløsning (med osmolaritet 210 mOsm/kg) eller høj saltholdighed buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). Lipid valg var begrundet i de data, der allerede er opnået på fase diagram af denne blanding6,8.

En række metoder til fremstilling af GUVs findes i litteraturen10,11,12 (Bemærk at her, vi vil ikke betragte dem, der vedrører overførsel af lipider fra en olie-baserede til en vandig fase 13 , 14 på grund af farligheden af de resterende olierester i den membran, der kan påvirke fase adfærd). Forberedelse af GUVs i høj saltholdighed buffer er forbundet med særlige udfordringer. For løsninger af lav ionisk styrke præsenterer electroformation metode15,16 en hurtig måde at forberede GUVs i høje udbytter med lille fejl10,17. Metoden er baseret på deponere et lag af lipider på en ledende overflade (elektrode), tørring dem og fugtgivende dem med en vandig opløsning mens anvendelse en AC felt. Denne metode kræver imidlertid justeringer hvis salt er til stede i vandig opløsning18,19. Det antages, at den drivende kraft for vesikel vækst af electroformation er elektroosmose16 som er hæmmet på høj grænseledningsevner20. Electroswelling af GUVs i høj saltholdighed løsninger er derfor ikke en ligetil tilgang som det kræver optimering for forskellige salt koncentrationerne i opløsningen hævelse. Gel-assisteret vesikel hævelse21,22 er en potentiel alternativ til electroformation med endnu hurtigere dannelse gange. Denne tilgang bygger på øget lipid film hydrering når en gel (Agarosen eller polyvinylalkohol (PVA)) bruges som substrat. Disse tilgange, men kommer med risiko for membran kontaminering ved agarosegelelektroforese-baserede hævelse23 og/eller temperatur grænser som i tilfældet med PVA-baserede hævelse. Tilsvarende, en protokol til at vokse GUVs på cellulose papir substrat er for nylig blevet etableret24. Generelle spørgsmål om denne metode er manglen kontrol over substrat renhed samt brugen af store mængder af lipid. I dette arbejde, vil vi indføre og præsentere fordelene ved den mest traditionelle metode for GUV forberedelse, nemlig den spontane hævelse metode25,26. Det består af tørring et lipid lag på en lipophobic substrat, fugtende det i vanddamp atmosfære, og efterfølgende hævelse i den ønskede hævelse løsning (Se figur 1 og detaljer i afsnittet protokol). Denne metode giver ikke kontrol over vesikel størrelse distribution og resulterer i samlet set mindre vesikler i forhold til metoder, hvor produktionen er bistået af elektrisk felt, polymer substrat eller mikrofluid betyder. Men vesikel kvalitet og størrelse er passende til at undersøge tilstanden membran fase som udforskede her.

At skabe asymmetri mellem løsninger over vesikel membranen er forbundet med visse udfordringer. En almindeligt anvendt metode er direkte fortynding af vesikel suspension i ønskede eksterne løsning27,28. Dette falder dog også vesikel distribution tæthed. En anden strategi er langsomt udveksle den eksterne løsning omkring GUVs slog sig ned i bunden af en flow-celle, der giver mulighed for løsning ind - og udstrømningen. For at undgå at forstyrre eller endda miste vesikler med strømmen, er lav strømningshastigheder anvendt8, hvilket gør denne tilgang tid-ineffektive. Desuden, ingen af disse tilgange garanterer fuld ekstern løsning exchange. En indlysende løsning er at immobilisere vesikler for at undgå at miste dem under en ekstern løsning udveksling. For eksempel, kan biotinylated GUVs bindes op på en streptavidin-belagt overflade29. Men denne tilgang kan føre til kompositoriske variationer på den overholdt og dermed ikke overholdt membranen segmenter30,31. Anvendelsen af magnetiske eller elektriske felter til at fælde blærer resultater i at pålægge membran spænding32. Beskæftiger optiske pincet til at fælde en vesikel kræver at have en håndtaget fastgjort (dvs. en perle), mens brugen af optiske bårer kan involvere lokale varme33. Diffusering af GUVs kan også ske ved at dyrke dem på platin ledninger uden endelige detachement34. Dette giver dog vesikler som ikke er isoleret, og der er normalt forbundet med ledningerne eller andre vesikler af tynde lipid rør (bindsler).

Præsenteres arbejdet fremhæver strategier for at overvinde de førnævnte begrænsninger. Først præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af den spontane hævelse metode tilpasset og optimeret til produktion af GUVs i høj saltholdighed buffere. Vi præsentere to tilgange til at effektivt skabe asymmetriske løsning af simple fortynding eller udnyttelse af en mikrofluid enhed. Fordi vores mål er en analyse af tilstanden membran fase af GUVs i forskellige løsning betingelser, beskriver de efterfølgende afsnit kriterier for vellykket statistisk analyse og nuværende tips til at undgå falske kategorisering.

Analyser blev udført under isotermiske betingelser og under varierende temperaturer. Mens temperatur control er almindeligvis ansat, oplysninger om eksperimentel temperaturkontrol kamre er sjældent beskrevet. Her præsenteres en in-house bygget setup til at overholde GUVs ved forskellige temperatur betingelser.

Protocol

1. spontan hævelse af GUVs

NOTE: Chloroform er et skadeligt stof, som er meget svingende. Udføre alle operationer med chloroform under et stinkskab. Brug ikke plast labware såsom pipette tips eller plastbeholdere til overførsel og/eller opbevaring af chloroform løsninger. Chloroform opløser plast, hvilket forurener løsningen. Bruge glas sprøjter og glasaffald i stedet. Derudover arbejde så rene som muligt for at undgå indførelsen af urenheder, som de kan interagere med membraner. Bemærk, at typiske lipid koncentrationer i endelige GUV præparater er i området micromolar, urenheder i koncentrationsområde kan således stærk virkning på membran opførsel.

  1. Ud over det grundlæggende udstyr, have følgende ting klar.
    1. Forbered en polytetrafluorethylene (PTFE, almindeligvis kendt som Teflon) plade for lipid aflejring af størrelse ~1.5 cm x 1,5 cm og passende tykkelse. Slibe plade på den ene side med fint sandpapir.
      Bemærk: PTFE er lipophobic og vil ikke være chloroformvædet af chloroform løsninger hvis glat. Begge sider af PTFE plade kan være ru for at undgå forvirring om den korrekte side for lipid deposition. Pladetykkelse skal vælges for nem håndtering, fx at det ikke er alt for fleksibel og let kan dækkes af hydrering løsning (Se figur 1). Her brugte vi plader ~ 2 mm tykkelse. Når ru, PTFE plade kan genbruges til nye eksperimenter efter ordentlig rengøring (trin 1.3).
    2. Udarbejde en genlukkelig hætteglas af passende volumen (~ 15 mL) for den endelige lipid film hydrering og vesikel vækst.
    3. Udarbejde en genlukkelig glasbeholder som ~ 15 mL hætteglas passer; det skal bruges til at oprette en vand-mættede atmosfære for lipid film før hævelse, se figur 1.
  2. Forberede 4 mM lipid bestande i det ønskede forhold mellem 1,2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - phospho-(1 ' - rac - glycerol) (natriumsalt) (DOPG), sphingomyelin (eSM) og kolesterol (Chol), æg med yderligere 0,1 mol % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DiIC 18) til en samlet lipid koncentration af 4 mM. Bruge chloroform som opløsningsmiddel. Se Oversigt over materialer.
  3. Grundigt skylles PTFE plade og glasbeholder med kommercielle opvask detergent, ethanol og chloroform i denne rækkefølge og endelig tør dem.
  4. Bruger et glas sprøjte, depositum og jævnt fordelt 10-15 µL af lipid lager på den ru side af PTFE pladen til at skabe en ensartet lipid film. Bruge sprøjte nål til at sprede løsningen, hvis det er nødvendigt.
  5. Placer PTFE plade på en ren overflade og udtørre det sammen med deponerede lipid film i 2 timer ved 60 ° C for at fjerne chloroform. Af hensyn til bekvemmelighed, deponere pladen i rengjort og tætnet 15 mL glasbeholder under udtørring.
    Bemærk: Den høje temperatur sikrer, at lipid filmen er i en homogen single-flydende tilstand i denne og alle efterfølgende trin.
  6. Efter udtørring, udfylde den pre hævelse glasbeholder med deioniseret vand op til et niveau, der ikke tillader opdrift til at vælte ~ 15 mL hætteglas (~ 1 cm), se figur 1.
  7. Læg ~ 15 mL glas hætteglasset med PTFE pladen ind i beholderen og dække det, så en vand-mættede atmosfære kan opstå, se figur 1B.
    Bemærk: Kondenserede vand på de indvendige beholder vægge giver en god indikation for vellykket vanddamp mætning.
  8. Lad deponerede lipid film pre svulme op inde i den lukkede glasbeholder på 60 ° C i 4 timer. Inden for denne periode forberede den ønskede hævelse løsning.
    Bemærk: For vesikel præparater, som kan foregå ved lavere temperatur, denne gang kan ekstremt forkortes - ned til et par minutter - hvis varmt vand-mættede nitrogen eller argon bruges til før hævelse i stedet.
    1. Forbered 200 mM saccharose eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 justeret med HCl og opvarmes til 60 ° C for at gøre den hævelse løsning.
  9. Efter før hævelse, tage ~ 15 mL glas med PTFE pladen ud af beholderen. Med en sprøjte, der er tilsluttet et 0,45 µm filter, tilføje ~ 5 mL af opløsningen, hævelse i 15 mL hætteglas til at fugte lipid film.
    Bemærk: Fastsættelse af en nål til filter letter indsættelsen af den hævelse løsning. Før opvarmning sprøjte og filter kan være tilrådeligt at sikre en enkelt-flydende fase tilstand af lipid film samtidig tilføjer den hævelse løsning. Filtrering løsningen minimerer (in-) organiske forureninger af bakterier eller salt bundfald etc.
  10. segl ~ 15 mL hætteglas holde hydreret lipid film på PTFE pladen til at minimere fordampning. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge paraffin film til at forbedre forsegling. Lad filmens hydreret lipid ved 60 ° C natten over for endelige GUV hævelse.

2. Høst GUVs

NOTE: sammenlægning af GUVs hævede og løsrevet fra PTFE substrat resultater i en lille (~ 1 mm) cloud-lignende klump synlige med det blotte øje. Det ser ud hvidlig, hvor ingen fluorescens dye bruges. Ellers er det farvet ifølge fluorophore absorptionsspektrum. Tilføjelsen af DiIC 18 renders skyen pink (Se figur 2). Vesikler er koncentreret i den samlede og høst det maksimerer vesikel udbytte.

  1. Cool ned vesikler til stuetemperatur inden for ~ 1 h. Cut ~1/10 af den spidse ende af et stempel pipette plastik tip til klyngen eller samlet af vesikler til at passe gennem blænde.
    Bemærk: Den afkøling hastighed er især vigtigt, hvis fast-flydende faseadskillelse forventes som det ændrer størrelsen af solid domæner. Her, for at bremse køling, vi placeret prøven i kontakt med en metal blok i størrelse 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x W) der køles ned til stuetemperatur inden for 1 h.
  2. Pipette op klynge sammen med en passende mængde af hævelse løsning (Se figur 2). Genopslæmmes aggregeringen i den hævelse løsning til at skabe symmetrisk løsning, eller enhver ønsket iso-osmotisk løsning at oprette asymmetriske løsning betingelser.
    Bemærk: Den nedre grænse for volumen er begrænset af størrelsen af samlet høstes helt. Den eksterne løsning er fortyndet og for at vurdere den nøjagtige koncentration, mængden af vesikel løsning må tages i betragtning.

3. Observation af GUVs for fase stat vurdering ved hjælp af Fluorescens mikroskopi

Bemærk: The GUVs blev doteret med DiIC 18 som fluorescerende markør. Denne fluorophore fortrinsvis partitioner ind i væske-uordnede (Ld) fase. Dette giver mulighed for fluorescens mikroskopi observation af domæner som følge af faseadskillelse i GUVs. Vi udførte fase stat vurdering med epi-Fluorescens mikroskopi. I princippet er disse observationer også muligt ved hjælp af Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM), som også giver mulighed for signalet kvantificering (f.eks. at bestemme membran unilamellarity). Men CLSM kræver mere avanceret udstyr og (normalt) epi-fluorescens bemærkninger før scanning er nyttigt under alle omstændigheder.

  1. Beslutter på et mål (f.eks. 40 X forstørrelse med en 0,6 numerisk blænde (NA) som anvendt her) at iagttage GUVs og bruge det konsekvent, når man sammenligner fase stater af samme sammensætning af forskellige løsningn betingelser. Brug passende excitations- og bølgelængde filtre til at aktivere fluorescens observationer med fluorophore bruges (fx excitation på 560 ± 40 nm og 630 ± 75 nm med en 585 nm beam splitter i mellem som anvendes til DiIC 18).
    Bemærk: Fase stats grænser inden for en fase diagram vil afhænge af den beslutning, som målet opnår som det definerer den minimale størrelse af mikro-domæner til at blive opdaget.
  2. For analyse, kun vælge GUVs, som opfylde følgende kvalitetskriterier.
    1. Sikre unilamellarity i GUV membran ved visuel observation af forskellige vesikler og sammenligne deres intensitet; vesikler med den laveste fluorescens emission intensitet er mest sandsynligt unilamellar.
      Bemærk: Spontan hævelse kan give vesikel partier hvor en stor del af gigantiske vesikler ikke er unilamellar.
    2. Udføre en supplerende kontrol af kvantificere fluorescens emission intensiteten af angiveligt unilamellar kæmpe vesikler og check det tilsvarende signal til spredning i befolkningen. Hvis ingen heltal forskelle blandt forskellige GUVs overholdes, alle af dem er sandsynligvis unilamellar.
      Bemærk: Hvis blærer er fremstillet af konventionelle lipider ved hjælp af en etableret metode som spontane hævelse, fremgangsmåden ovenfor påvisning af unilamellar vesikler er tilstrækkelig. Hvis oprettelse af en ny GUV forberedelse protokol eller ved hjælp af utraditionelle lipider, mere detaljerede undersøgelser vil være forpligtet til at bekræfte unilamellarity. For eksempel, kunne membran fluorescens signaler af mærket vesikler udarbejdet af en ny protokol sammenlignes med de af GUVs udarbejdet af en etableret metode; eller membran pore protein α-hemolysin kan indsættes i vesikel membraner 24. Farvestof føjes til ydersiden af blærer vil derefter indtaste deres indre eller ej, afhængigt af tilstedeværelsen af uni- eller multilamellar vesikler, henholdsvis.
    3. Sikre, at GUV har en rimelig mindste diameter for domæner stadig være genkendeligt.
    4. Sikre, at GUV har (næsten) ingen defekter såsom fremspringende eller overholdt dele eller interne strukturer.
  3. En alikvot del af GUV suspension på et objektglas og forsegle det ordentligt. Forberede en bemærkning afdeling.
  4. Deponere prøven i mikroskop diaset. Omgive det med en silikone spacer med en central cirkulære udskæring. For at undgå kontaminering, sikre at spacer ikke er i kontakt med prøven. Forsegle indre ved at placere en cover slip på toppen af silikone spacer.
    Bemærk: I stedet for silikone spacer, man kan bruge silikone fedt eller hjemmelavet polydimethysiloxane (PDMS) afstandsstykker. Forsegling salen sikrer minimum fordampning af prøven og vedligeholder iso-osmolar betingelser.
  5. Forlader prøven for ~ 5 min til fornyet ækvilibrering muligt domæner.
    Bemærk: Den mekaniske stress fra pipettering kan blande membran-domæner, der har brug for tid til reform.
  6. Placere objektglas med prøve på mikroskop scenen og analysere tilstanden fase af GUV batch i en statistisk metode. Observere mere end 30 GUVs pr. batch og bestemme deres fase tilstand efter følgende kriterier for GUV fase stat vurdering med DiIC 18 ( figur 3).
    Bemærk: Efter deres vækst, blærer kan ændre deres individuelle kompositioner (for eksempel) domæne spirende eller udveksling af membran materiale via nanorør. GUVs udviser derfor kompositoriske variationer inden for den samme batch 35.
    1. Single-flydende fase at være enten væske-bestilt (Lo) eller væske-uordnede (Ld): sikre, at den overordnede GUV form er kugleformet og glat og DiIC 18 er ensartet fordelt i membranen (første billeder i øverste og nederste paneler i < stærk class = "xfig" > figur 3).
    2. To faser Lo + Ld sameksistens tilstand: sikre at vesikler udviser domæner der synes cirkulære med glatte grænser; ifølge den DiIC 18 partitionering adfærd domæner er lyse rødt (Ld) eller mørk rød/sort (Lo) (anden billeder i øverste og bunden paneler i figur 3, i falske farver). Kontrollere, at domænerne er gratis til diffus på vesikel overflade og kan coalesce.
    3. To faser fast (S) + flydende (S + Lo eller S + Ld) sameksistens tilstand: sikre, at domænerne kan vises finger-lignende eller rundet, men med kantede grænser (tredje billeder i øverste og nederste paneler i figur 3). Observere flydende domæner (røde) på en solid (sort) baggrund, der ikke viser diffusion. Tværtimod, solid (sort) domæner vil være gratis at diffuse på en flydende baggrund (red).
    4. Tre-faset S + Lo + Ld sameksistens: observere tre typer af domæner vises: a kantede sorte domæner (S), integreret i (ii) dim (Lo) og (iii) lyse (Ld) rød domæner.
  7. Tilskrive befolkningen i GUVs fase staten, der har været fast besluttet på at være dominerende blandt en stikprøve, som i følgende eksempler:
    1. Hvis 20 enkelt-flydende GUVs og 15 Lo + Ld GUVs overholdes, overveje at massebogføre at være en Single-flydende fase.
    2. Hvis 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs, og 25 single-væske GUVs er observeret, overveje at massebogføre at være en Lo + Ld.

4. GUV Observation i mikrofluid enhed

NOTE: først fremstille mikrofluid enhed; detaljer om mikrofluid enhed design og forsamling har fået andetsteds 36 , 37; Se figur 4 for en kort beskrivelse.

  1. Forberede frisk GUV hævelse løsning (enten salt eller saccharose ifølge trin 1.8.1) og filtreres gennem et 0,45 µm filter.
    Bemærk: Urenheder i de strømmende løsninger kan blokere enheden mikrofluid.
  2. Skære 200 µL stempel afpipetteres plastik tips og placere dem i hullerne i PDMS del af enheden. Tilsæt 100 µL og 5 µL af den friske og filtrerede hævelse løsning at reservoiret (Se figur 5A) og hver af snittet afpipetteres tips, henholdsvis. Centrifugeres hele enheden ved 900 x g i 10 min. i en swing rotor centrifuge pre fylde enheden og fjerne luft.
  3. Pre fylde 1 mL glas sprøjte og knyttet slangen med den hævelse løsning og flytter den stemplet til 0 mL.
  4. Placere slangen i en fluidic stikkontakt af enheden og læg sprøjten i sprøjten pumpe.
    Bemærk: Valget af sprøjten og sprøjten pumpe mærke er ikke vigtigt. Imidlertid glas sprøjter er mere præcis og pumpen bør være i stand til at operere i området µL/min. flow.
  5. Tilslut en brugerdefineret pres styreenheden til de 8 fjorde i kontrolelementet mikrofluid lag (Se figur 5A). Indstil trykket til styreenheden trykket til 3 bar (luft, nitrogen eller argon), men sæt ventiler til mikrofluid enheden til lukket stilling.
  6. Placere mikrofluid enheden, nu tilsluttet sprøjten pumpe og pres styreenheden på en inverteret Konfokal mikroskop scenen.
    1. Brug en målsætning med samme forstørrelse og NA som under bulk observationer. Kontrollere hvis fase stat statistikker som forklaret i trin 3.7 forbliver det samme hvis et andet mål anvendes for at undgå observation artefakter, som er baseret på forskellige resolutioner.
  7. Indlæse GUVs i enheden.
    1. Første, pipette væk alle, men 25 til 50 µL af den løsning, der er forblevet i reservoiret. Tilsæt 150 µL af opløsningen GUV (enten saccharose eller salt efter trin 1.8.1, men matcher den løsning bruges til at pre fylde enheden i trin 4.1) til reservoir og blanding af blid pipettering. Sæt sprøjten 10 µL/min strømningshastigheden i trække tilstand for ca 20 min eller indtil mere end 90% af fælderne er besat.
      Bemærk: Reservoiret bør ikke være tilladt at løbe tør. Hvis dette sker, træder luftbobler mikro-kanaler. Tilføje flere GUV løsning til reservoir under lastning men passe på ikke for at indføre luftbobler når pipettering i enheden.
  8. Åbne alle trykreguleringsventiler enhed at lukke mikrofluid ring-ventiler omkring fælder/GUVs. Sæt sprøjten pumpe til 0 µL/min. Efter 1 time, observere GUVs og optage Konfokal billeder. Excite og registrere GUVs ifølge fluorophore bruges (fx excitation på 561 nm og påvisning mellem 580-620 nm som DiIC 18). Bruge de samme udvælgelseskriterier fra trin 3,6 , og tage sig for at bemærke placeringen af hver GUV (dvs. kolonnen og række nummer, se figur 4)
  9. udveksle løsningen omkring GUVs .
    1. Sæt sprøjten pumpe til 0 µL/min og tilsæt væk alle men 25 til 50 µL af opløsningen GUV fra reservoiret. Tilsæt 150 µL af den 2nd løsning (i enten saccharose eller salt efter trin 1.8.1, afhængigt af den ønskede løsning uden for GUVs) til reservoir og mix af blid pipettering. Afpipetteres væk alle men 25 til 50 µL stødpudeopløsning fra reservoiret.
      Bemærk: Denne løsning har til filtreres ved hjælp af et 0,45 µm filter også.
  10. Gentag forrige trin, mindst 5 gange grundigt erstatte løsning i reservoiret. Sæt sprøjten til 10 µL/min strømningshastighed i trække tilstand for ~ 10 min til at erstatte løsningen i mikro-kanaler.
  11. Reducer flow til at 1 µL/min. åbner 8 enhed trykreguleringsventiler til 2 s og Luk igen (hvilket resulterer i åbning og lukning af mikrofluid ring ventiler). Indstille flowet til 0 µL/min igen.
  12. Efter 1 h, observere GUVs og optage Konfokal billeder. Igen, sørge for at bemærke den kolonne- og mikro-kammer hvor hver GUV ligger kan foretage sammenligninger af den samme GUV, før og efter eksterne buffer exchange.

5. Design og kalibrering af temperaturkontrol kammer

NOTE: et egnet kammer for temperaturkontrol kan være enten fremstillet kommercielt eller hjem-bygget. Temperaturkontrol er normalt opnås ved termisk kobling af kammer med GUV prøven vandbad eller en Peltier element. Her, beskrive vi design og karakterisering af et hjem-bygget temperaturkontrol kammer opererer med en ekstern vand termostat. Sådanne termostater fås i mange laboratorier eller kan reddes fra gamle udstyr såsom lasere eller spektrometre.

  1. Samle en varme-flow kammer, her lavet ud af en aluminium blok med stik til et bad med vand som vist i figur 6. Forsegle åbninger i top og bund og aktiverer lysfelt observation af prøven ved at lime dække briller til blokken.
  2. Flip flow salen på den side hvor prøven placeres og tilsæt en dråbe af omkring 100 µL af opløsningen forsøgsdyr ifølge trin 1.8.1. Du kan eventuelt indsætte en fiber optic temperatur sonde (f.eks. FISO FTI-10) eller tilføje et temperatur-følsomme farvestof i en passende koncentration, fx 500 µM rodamin B.
  3. Samle GUV observation kammeret ved hjælp af silikone fedt deponeret i ring form eller nogle andre spacer (PTFE eller gummi) og forsegle det med en 0,17 µm dækslet glas. At faldet ikke er i kontakt med den tætningsmiddel eller spacer at undgå indførelsen af urenheder.
  4. Langsomt skru forsamlingen hovedet og Tilslut eksterne vand termostat med passende slangen det. Være særlig opmærksom på utætheder vand.
  5. Sæt den laveste ønskede temperatur på den eksterne vand termostat og lade systemet reagensglasset indtil læsning af Temperaturføleren er stabil, den nødvendige tid til ækvilibrering vil give et skøn over minimal responstiden for systemet.
  6. Udføre kontrol eksperimenter mindst én gang før du begynder at bruge salen.
    1. Måle løsning temperatur (f.eks. med et glas fiber sonde) og sammenligne det med læsning af termostaten over Temperaturinterval for interesse.
    2. Check for en minimal forskydning fra termostat læsning og lineariteten af de målte temperaturer.
    3. Kontrollere, om en temperaturgradient inde observation kammeret ved hjælp af en temperatur følsom farvestof. Måle løsning temperaturen via fluorescens intensitet eller fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) for forskellige afstande fra bunden dække slip 40. Desuden kontrollere, hvis der er nogen temperaturgradient i regionen i GUV observation, som vist i figur 7.

6. GUV observationer ved varierende temperaturer

Bemærk: typisk, for GUVs hvis membraner potentielt fase-separat og der synes at være homogen på observation temperatur T obs, faseadskillelse bliver induceret nedenfor T obs (uanset om der er observeret afhænger temperaturområde undersøgt). Omvendt fase adskilt vesikler bliver homogen ved en temperatur højere end T obs. Men dette behøver ikke at være tilfældet for en bestemt (komplekse) lipid sammensætning og det kunne være interessant altid scanne hele tilgængelige temperatur rækkevidde 38. Protokol for observation og vurdering af fase overgang temperaturer ikke stole på den specifikke metode brugt til temperaturkontrol.

  1. Samle temperatur observation salen ifølge afsnit 5, udelade fiber optic temperatur sonde eller temperatur-følsomme fluorophore.
  2. Sæt den eksterne vandbad til stuetemperatur (23 ° C) og lade systemet Blandingen henstår i 10-15 min.
  3. Tæller antallet af fase adskilt blærer ved hjælp af kriterier fra trin 3.6; den generelle fase stat med befolkningens GUV vil give et vink om regionen overgang temperaturen af systemet. Hvis tilstanden fase over vesikel befolkning er temmelig heterogene gå direkte til trin 6.5.
  4. Øge (hvis størstedelen af vesikler er fase-adskilt) eller sænke (hvis størstedelen af vesikler er homogen) temperatur i grove intervaller (f.eks. 1-2 ° C) og lad systemet reagensglasset for ca. 2 min. revurdere fase tilstand GUV befolkning af betyder for en tilfældig prøve og varierer temperaturen indtil vesikel befolkningen viser en heterogen fase tilstand.
  5. Når befolkningen er nær point af fase overgang (dvs. fasen hedder blandt individuelle GUVs er temmelig heterogene), mindske temperatur interval (f.eks. 0,5 ° C) for at øge opløsningen. Lad systemet Blandingen henstår i ~ 2 min og revurdere den fase stat med befolkningens GUV ved hjælp af en tilfældig stikprøve.
  6. Når punktet af fase overgangen er bestået, holde varierende temperatur, indtil alle GUVs er nu homogen eller fase-adskilt, henholdsvis.
  7. Indskrive nemlig hysterese at vurdere om ækvilibrering gange er tilstrækkelige.
    1. Ændre retningen af temperaturen scanning, jeg.e. hvis scanningen blev gjort for at øge temperaturen, gøre scanningen ved at sænke temperaturen.
    2. Vælge mindst en delmængde af temperaturerne at vurdere GUV befolkning fase stat ratio (f.eks. 80% fase-adskilt).
    3. Hvis væsentlige afvigelser mellem begge retninger i fase stat forholdet angiver hysterese, reducere temperaturen trin størrelse og/eller øge ekvilibreringstid i trin 6.4 og 6.5.
    4. Hvis der er ingen hysterese angivet med lige store forholdstal, overveje at øge trin størrelse og/eller ækvilibrering tid.
  8. Plot fase stat nøgletal mod temperaturen. For kvantificering, passer dataene til en passende model ( figur 8).
    Bemærk: Fase overgang kurver almindeligt indslag en sigmoide bane og sigmoide Boltzmann modellen giver et passende sæt af passende parametre:
    Equation 1
    y: brøkdel af uniform/fase-adskilt GUVs
    en 1: den oprindelige brøkværdi
    en 2: den endelige brøkværdi
    T: temperatur
    T mix: temperatur på halv-maksimal y
    Y er fraktion af homogen GUVs, fastsættes A 1 og A 2 til 0 og 1, henholdsvis. Som blandbarhed antages overgang for at være sigmoide, når brøkværdi er målt til 0 ved en bestemt temperatur alle brøkdel værdier af temperaturområde nedenfor anses at være 0. Omvendt, når brøkværdi er 1 ved en bestemt temperatur, alle brøkdel værdier af de ovenfor temperaturområde er antages for at være 1.

Representative Results

GUV hævelse

Med den spontane hævelse fremgangsmåde beskrevet her, GUVs bestående af DOPG, eSM, og Chol blev dyrket natten over i 210 mM saccharose eller 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 danner en synlig aggregat. Høst aggregeringen sikrer høj vesikel udbytter. Resuspension i den hævelse løsning resulterede i symmetrisk trans-membran løsning betingelser. Du kan oprette asymmetriske forhold, var samlet genopslemmes i en iso-osmolar saccharose eller høj saltholdighed løsning, henholdsvis (figur 2). Den resulterende fortynding svarer til en kvasi eksterne løsning exchange samtidig minimere fortyndingen af antallet af GUVs.

Fase diagram kortlægning af GUVs ved hjælp af Fluorescens mikroskopi

Tilstedeværelse af 0,1 mol % af de fase-specifikke DiIC18 i GUVs tilladt for observation af deres fase stater via wide-felt Fluorescens mikroskopi. Vesikler udstiller S + L faseadskillelse blev observeret gennem en 63 x / 1.2NA at blive købedygtig løse fint struktureret finger-lignende domæner. For alle resterende tilfælde, en 40 x / 0,6 NA mål blev brugt. At undgå artefakter under besigtigelse af GUVs og maksimere reproducerbarhed visse kriterier blev sat der bestemmes som vesikler at overveje for fase stat analyse (protokol trin 3.6).

GUVs fremstillet af ternære DOPG/eSM/Chol blandinger af en lang række nøgletal hævede i saccharose eller høj saltholdighed løsning og observeret ved stuetemperatur udstillet homogen Lo eller Ld faser, Lo + Ld og S + L faseadskillelse, se figur 3. Figur 9 viser eksemplarisk defekte blærer, som ikke bør indgå i dataanalyse og også hvordan at identificere multilamellar vesikler.

På grund af deres ukendt historie er GUVs tilbøjelige til at udstille i batch kompositoriske variation35. Derfor blev tilstanden samlede fase af en bestemt sammensætning fastlagt i en statistisk metode. GUV populationer af en visse lipid sammensætning blev tilskrevet tilstanden fase, der blev observeret for at være dominerende i en tilfældig stikprøve (protokol trin 3.6). Endnu, kompositioner tæt på Lo + Ld sameksistens region ofte givet partier, hvor den dominerende fase stat består et snævert flertal. For disse vage tilfælde blev besigtigelsen gentaget med mindst tre uafhængige prøver. Brøkdel af vesikler med identiske fase tilstand (f.eks. udstillende Lo + Ld faseadskillelse) stede i stikprøverne var et gennemsnit over det antal forsøg, som blev taget som det endelige resultat (figur 10).

De beskrevne protokoller resulterede i tilstrækkelig GUV vækst over en bred vifte af forskellige nøgletal for DOPG, eSM og Chol i høj saltholdighed og saccharose løsninger. Omfattende regioner inden for ternære fase diagram kunne knyttes betingelser, symmetrisk samt asymmetriske høj saltholdighed løsning (Figur 11). Forskelle i vesikel fase adfærd observeret forskellige løsning betingelser blev diskuteret andetsteds i detalje9.

Observationer af fase adfærd efter komplet buffer udveksling ved hjælp af metoden mikrofluid

Oprettelse af asymmetriske løsning betingelser ved fortynding resultater i rester af den hævelse løsning uden for. Vores mikrofluid tilgang giver mulighed for en ekstern totalløsning udveksling. Fig. 5A viser mikrofluid enheden helt samlet på stadiet Konfokal mikroskop fluidic outlet og tryk kontrol fjorde. Rør er forbundet via 90 ° metalrør at give plads til overføres light imaging ovenfra.

For observation i mikrofluid enheden, en Konfokal mikroskop med en 63 x / 1.2NA vand fordybelse mål linse blev gennemført. Som med de tidligere bemærkninger i bulk, blev DiIC18 brugt til at plette membranen. Når du foretager observationer af fase tilstand af GUVs fanget i enheden, skal pleje tages ikke til fejlfortolker data. På grund af nærhed af GUVs til stillingerne, kan de excitations- og lys kurver delvist blokeret af PDMS fører til falske udseendet af domæner (figur 12). Her er transmitteres lys påvisning nyttigt at tjekke for placeringen af GUVs på stillingerne. Denne uønskede virkning er særligt fremtrædende for små GUVs på mindre end 10 µm i diameter. I disse tilfælde afvistes data. Konfokal billedet i Figur 13 viser et planar vesikel afsnit, der krydser en Lo domæne stede på GUV vesikel. I dette tilfælde ville planar tværsnit scanninger yderligere over eller under afsnittet have ikke viste domæne på grund af sin lille størrelse i forhold til, af GUV, hvilket er hvorfor det ville have været savnet og vesikel anses for at være i en homogen fase. Derfor bør en Konfokal z-stakken bruges til at inspicere hele GUV overfladen. For wide-felt mikroskopi, kan dette ikke være et problem, fordi den hele vesikel kan være afbildet på én gang.

Endelig gives der eksempler på GUVs før og efter udvekslingen af den ydre løsning hvor det er klart, hvad den fase af membraner er (Figur 14). Hver enhed har 60 afdelinger (hver med et par indlæg til at fælde en enkelt GUV), giver mulighed for snesevis af eksperimenter pr. enhed (Se figur 4). Men nogle GUVs kan få tabt under den eksterne løsning udveksling. Dette kan minimeres ved følgende trin: 1) bruger bovint serumalbumin (BSA) belægning til at forhindre GUV vedhæftning/brud på stillingerne; belægning sker ved at udsætte kammer vægge til 20 mg/mL BSA i 60 min og efterfølgende skylning med arbejdende buffer. En anden klæbende molekyle, der kan anvendes er poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)39. 2) omhyggelig osmotisk matching af de indre og ydre løsninger for at undgå slatne GUVs, som kunne passere gennem midten af indlæg eller sprængningen af GUVs. 3) optimere GUV forberedelse procedure for at opnå vesikler større end ~ 8 µm i diameter til at forhindre passage gennem centrum af stillingerne.

Design og karakterisering af temperatur-kontrolleret kammer til observation af GUV fase stater

Vi har udviklet en simpel flow kammer, som byder på forbindelser til eksterne vand termostat (figur 6). Vi fik denkammeret ved fræsning af en aluminium blok. Generelt er behøver kammer materialet ikke at være varme ledende, som prøven er koblet til et vandbad ved en lavere dækning glas som vist i figur 6B og 6 C.

Uafhængigt af den nøjagtige design, bør udførelse af salen evalueres. Specielt tjekkede vi for lineariteten af prøven temperatur med eksternt-sæt temperaturen, nogen systematisk temperatur forskydning og en temperaturgradient inden for sal. De første to punkter blev behandlet af direkte temperaturmåling i kammeret af en fiber optic temperatur sonde (f.eks. FISO FTI-10). Vi har også tjekket for en temperaturgradient inden for GUV suspension. Sådan et forløb kunne stamme fra varme flow til ydersiden af salen. Rumligt løst temperaturmålinger kan opnås ved en temperatur følsom fluorophore40, se figur 7.

Afbildning af data og passende at opnå Tmix af fase-separeret GUVs

Plotte brøkdel af homogen GUVs over den observerede temperaturområde resulteret i en sigmoidally formet data punkt bane. Vi passer data til Boltzmann model (protokollen afsnit 6.8) hvorfra TBland kunne udledes ()figur 8).

Figure 1
Figur 1: eksperimenterende trin under den spontane hævelse protokol (toppanelet) med den tilsvarende scene af vesikel vækst (nederste panel). (A) A homogen lipid film er spredt på en ru PTFE tallerken og tørret fra opløsningsmidler. (B) den tørrede lipid film er så præ hævede i en vand-mættede atmosfære inde i en lukket beholder med vand for at lette tolagede hydrering. Den ugyldige hætteglas indeholder PTFE plade og forbliver åbne under trinnet hydrering. (C) den pre hævede lipid film bliver endelig fuldt hydreret ved tilføjelse af de ønskede hævelse løsning på lipid-belagt PTFE pladen inde i hætteglasset. For at undgå fordampning, er hætteglasset forseglet korrekt i natten inkubation. For at minimere kompositoriske variationer inden for en batch, skal alle trin udføres ved en temperatur, hvor lipid blandingen er fuldt blandbar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: GUV høst. (A) A deponeret lipid folie bestående af eSM-DOPG-Chol på molære forhold af 20/60/20 med 0,1 mol % DiIC18 var opsvulmet i høj saltholdighed buffer består af 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. Låget af glasindsatsen var desuden forseglet med paraffin film. Det forstørrede område, indeholder den resulterende GUV samlede. Dens røde udseende er en følge af tilstedeværelsen af DiIC18. (B) den GUVs var høstet med en afkortet pipette spids. I dette billede, var samlet pipetted op sammen med 50 µL af hævelse løsning, som blev overført til en frisk hætteglas. (C) at oprette asymmetriske trans-membran løsning betingelser, samlet blev fortyndet i en anden isotonisk eksterne løsning. Her, samlet sammen med 50 µL hævelse løsning var genopslemmes i 950 µL rørsukkeropløsning resulterer i en 20 x fortynding af hævelse løsningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: GUV imaging. Bred feltet fluorescens billeder af GUVs doteret med 0,1 mol % DiIC18 forberedt og observeret i symmetrisk salt eller saccharose løsninger bestående af forskellige nøgletal for DOPG, eSM og Chol (i salt buffer, fra venstre mod højre: 40/20/40; 30/50/20; 30/60/10; i saccharose, fra venstre mod højre: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Billeder skildrer GUVs i forskellige (sameksisterende) fase stater vurderet ud fra kriterierne i protokollen trin 3.6. Her, vesikler blev afbildet gennem en 40 X / 0,6 NA mål. Skalere barer = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Layout af mikrofluid kanaldesign. GUVs Angiv de lavere fluidic lag (skitserede kanaler) via indløb under et reservoir. Et filter blokerer uønsket snavs fra enheden. De derefter indtaste en matrix af 60 kamre (8 rækker og 15 kolonner) hver indeholdende indlæg for enkelt GUV capture (Se Indsæt). Hver afdeling kan isoleres inden for en ring ventil aktiveres af en kontrol lag (fyldt sorte kanaler) over det fluidic lag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: mikrofluid enheden. (A) fotografi af en mikrofluid enhed, der bruges til at fælde enkelt GUVs og fuldt udveksle den ydre løsning. Etiketten reservoir til at tilføje løsninger (1), 8 x pres indløb tilsluttet den pres kontrol enhed (2), og det fluidic outlet tilsluttet sprøjte og pumpe (3). Panel (B) viser pres styreenheden med 8 ventiler hver regulering 1 rør forbundet til mikrofluid enhed. Ventiler #1 og #2 er her åben og dermed de tilsvarende ring ventiler er lukkede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: temperatur kontrol afdeling. (A) kammerfør montering. (B) samlet kammer (opad) med 2 mm cover glas limet til toppen og bunden. Orange gummi spacer måler 0,5 mm i højden og er forseglet med en 0,17 mm dække slip til iagttagelse af de lukkede GUV suspension. I dette billede indsættes en temperatur sonde til kalibrering formål (brun fiber forlader salen til højre). (C) afsluttende montage på scenen i en inverteret mikroskop uden temperatursonden. Orange gummi spacer nu vender nedad. Gummi er selvklæbende nok at holde prøven på plads. Bemærk, at lyset kan overføres gennem prøven giver både epi-fluorescens og lysfelt observationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: rumligt løst temperatur data inde i bemærkning afdeling fremstillet af FLIM målinger af en temperatur følsom farvestoffet (her: 500 µM rodamin B) 40. datapunkter fremstillet på 0, 10, 30, 300 og 400 µm over bunden dække slip. De røde og blå datapunkter blev målt til temperaturen i vandbad indstillet på 30 ° C og 12 ° C, henholdsvis. De sorte datapunkter viser vand bad venstre til Reagensglasset stuetemperatur. Små temperatur variationer i hele salen blev observeret men opholdt sig under 0,5 ° C (grå søjler). Den samlede kammer højde er ca. 500 µm ifølge spacer tykkelse (se ovenfor). Fejllinjer angive standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: lokalisering blandbarhed temperatur. Grafen viser individuelle datapunkter i homogene (single-flydende tilstand) brøkdel af GUVs fremstillet af DOPG/eSM/Chol i forholdet 30/40/30 doteret med 0,1 mol % DiIC18 fra tre uafhængige stikprøver (N = 20-40). Fejllinjer udgør standard fejl af midler. Datapunkter blev monteret Boltzmann modellen beskrevet taktfast 6.8 (kontinuerlig sort streg) hvorfra de domæne blanding temperatur Tmix var udledes (Følg røde optrukne linje til abscissen) Ifølge den sigmoide halv maksimalt kurve på ordinat (stiplede sorte linie). Oprindelige og endelige værdier (A1 og A2) blev fastsat til 0 og 1, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: defekte vesikler. Eksempler på kæmpe vesikler forberedt fra 20/60/20 DOPG/eSM/Chol og dopet med 0,1 mol % hvis DiIC18 , der ikke opfylder kriterierne angivet i trin 4.2 afbildet af wide-felt Fluorescens mikroskopi. Intensitet display intervaller af de enkelte billeder var optimeret til fluorescens-intensiteten af den afbillede vesikel hver gang. På grund af tilstedeværelsen af ekstra membran materiale og indkapslet mindre vesikler, kan ikke fase delstaten vesikel i (A) være klart defineret. Udseendet af denne kæmpe vesikel tillader ikke nogen pålidelig besigtigelse for lamellarity. Panel (B) skildrer en vesikel, hvor interiøret er overfyldt med membran materiale. Som en konsekvens, er fluorescens signal af den udvendige vesikel membran overlejret med sin indre signal, rendering en visualisering af lamellarity og potentielle domæner umuligt. (C) Fluorescens-intensiteten af tre forskellige kæmpe vesikler er vist i direkte sammenligning inden for den samme interval for visning af intensitet. Dette billede viser, at giant multilamellar vesikler (1, 2) kan identificeres ved deres øgede fluorescens signal i forhold til GUV (3). Her, multilamellar samt unilamellar kæmpe vesikler udstille Lo + Ld faseadskillelse. Vesikler i alle billeder blev afbildet gennem en 40 x / 0,6 NA mål. Skalere barer = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: brøkdel af Lo + Ld fase adskilt GUVs gennemsnit over mindst tre uafhængige prøver. Vesikler bestod af 30/40/30 DOPG/eSM/Chol tæt på grænsen til regionen Lo + Ld sameksistens. Fejllinjer for symmetrisk saccharose betingelser illustrere batch til batch spredning. Etiketten for at koordinere beskriver løsninger inde i/uden blærer; saccharose: 210 mM saccharose; salt: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5; Fejllinjer angive standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: fase diagram af GUVs fremstillet af DOPG, eSM, og Chol tilknyttet forskellige løsning betingelser ved hjælp af 210 mM saccharose (saccharose) og 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (salt). GUV fase hedder blev udforsket i saccharose/saccharose (A; øverste del), saccharose/salt (ind/ud) (A; lavere polygonal afsnit), salt/salt (B, øverste del) og salt/saccharose (B, lavere polygonal afsnit). Tegningerne illustrere den dominerende domæne mønster inden for de markerede sektioner og de tilsvarende løsning betingelser. Vesikel fase stater er repræsenteret i de lavere polygonal afsnit blev observeret betingelser asymmetriske løsning på 20 x GUV fortynding. Tilpasset fra reference9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: artefakter i fanget GUVs. Eksempel på en lille GUV, hvor en falsk domæne kan ses på grund af nærhed med stillingerne (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Lysfelt transmitteres lys billede som viser stillingerne (grey) er belagt med Konfokal fluorescens billedet af GUV (orange). Stillingerne er set til at skabe et interferensmønster i lysfelt billedet. Fluorescens signalet tæt indlæg (til højre) er reduceret giver udseende af faseadskillelse. Skalalinjen = 5 µm.

Figure 13
Figur 13: eksempler på to forskellige GUVs fanget af PDMS indlæg hvor fase stater er klart synlige. (A) Lo + Ld fase adskilt vesikel lavet af eSM-DOPG-Chol 60/20/20. (B) en vesikel lavet af 40/30/30 udstiller Ld eller Lo enfasede. En Konfokal z-stak af den hele vesikel blev undersøgt for at bekræfte, at ingen (out-of-fokus) domæner var til stede. Kanterne af stillingerne der ses i højre side af billeder (grå). Skalalinjen = 5 µm.

Figure 14
Figur 14: resulterende fase adfærd efter en komplet fluidic udveksling ved hjælp af enhedens mikrofluid. Den samme GUV er vist både før og efter løsning exchange for (A) symmetrisk salt/salt (ind/ud) til salt/saccharose (ind/ud) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, skalalinjen er 2 µm) og (B) symmetrisk saccharose/saccharose (ind/ud) til saccharose/salt (ind/ud) (DOPG / eSM/Chol 30/40/30, skala bar = 3 µm). Tilpasset fra reference9.

Discussion

Vellykket produktion af GUVs til fase stat bemærkninger under symmetriske og asymmetriske high-saltholdighedsforhold

Protokollerne præsenteres her introducerer en strategi til at vurdere høj saltholdighed buffer og løsning asymmetri indflydelse på tilstanden membran fase af ladede GUVs over en bred vifte af kompositioner. En af de største udfordringer for at nå dette mål var produktionen af ladede GUVs i high-saltholdighed buffere.

Vi produceret med succes GUVs i rørsukkeropløsning og høj-saltvand buffer af en enkel spontan hævelse tilgang, som omfatter en forudgående hydrering skridt af deponerede lipid film og en overnight endelige hydrering skridt for vesikel vækst. Det er vigtigt at bemærke, at lipid depositionen bør ske på en ru PTFE plade at sikre selv lipid spredning for at give unilamellar vesikler. Derudover er det vigtigt at udføre hvert skridt under vesikel forberedelse ved en temperatur, hvor filmens lipid er i en homogen og flydende fase. Ellers, vesikel befolkning kan være polydisperse i sammensætning og bias endelige befolkning fase stat analyse. Den angivne protokol for den spontane hævelse af GUVs udbytter en vesikel klump, som på den ene side giver mulighed for at suspendere det i små mængder til at opnå stærkt koncentreret vesikel dispersioner, og på den anden side giver asymmetriske løsning forhold på tværs af membranen samtidig minimere fortyndingen af vesikler8,28. Det er vigtigt at under vesikel fortynding eller eksterne løsning udveksle, inde og uden for osmolarities forbliver matchede som morfologi ændringer forårsaget af osmolaritet uoverensstemmelser kan fremkalde eller forhindre Lo + Ld fase adskillelse41 eller, i tilfælde af hypotonic betingelser, kan føre til vesikel brister.

Her, resulterede forsøg på at optimere electroformation protokoller i høj saltholdighed løsning i produktionen af nogen GUVs mens PVA-assisteret hævelse givet multilamellar vesikler. Selv om det kræver længere forberedelse gange og resultater i vesikel partier af lavere kvalitet10,17, den vellykkede produktion af ladede vesikler af spontan leveres hævelse med ekstra fordele. Det kræver minimal indsats mens medfører tilstrækkelig udbytter til analyser, statistiske batch, og i modsætning til electroformation, ingen sofistikeret udstyr eller optimering var påkrævet. Derudover observeret ingen forureninger af lipid oxidation42,43. Ifølge litteraturen er der ingen forskelle mellem lipid kompositioner af vesikler og de tilsvarende bestande, hvorfra de blev dyrket7,17. Derudover vesikel dannelsen på en PTFE substrat ikke om optagelse af eventuelle forureninger i modsætning til gel-assisteret hævelse metoder hvor udenlandske molekyler kan indføres af substrat23. Electroformation leveres med yderligere ulemper relateret til overdreven vesikel fortynding ved oprettelse af asymmetriske løsning betingelser. GUVs produceret af electroformation er som regel til stede som en homogen spredning (i modsætning til stærkt koncentreret vesikel suspensionen i form af en klump, der dannes i spontane hævelse). Enhver fortynding af den eksterne løsning ville væsentligt fortyndet antallet af vesikler så godt. Desuden, i løbet af dette arbejde, det blev observeret, DOPG/eSM/Chol GUVs produceret af electroformation i saccharose blev ustabil, hvis fortyndes i høj saltholdighed buffer. Fluorescens fra lipid patches på objektglas angivet at vesikler ville briste før deres besigtigelse var muligt. Sådan ustabilitet kan tilskrives en forhøjet membran spænding af vesikler udarbejdet af electroformation i forhold til dem, der opnås ved spontan hævelse10.

Selvom vesikel fortynding er en nem og hurtig metode til at oprette asymmetriske GUV løsning betingelser, det kun udretter en ekstern delløsning exchange, omend i en høj brøkdel (her: 95%, figur 2), som efter fortynding, spor af det hævelse løsning vil forblive. Valget af graden af den eksterne løsning exchange er et trade-off mellem pipettering op vesikel klump sammen med den hævelse løsning (afsnit 2) og ikke udvande det alt for meget. Derfor indførte vi en alternativ mikrofluid tilgang diskuteret andetsteds i detaljer37 , der giver mulighed for en hurtig og fuldstændig eksterne løsning exchange under GUV fase stat observationer at kontrollere fase stat bemærkninger for fortyndet vesikler. Observationer af fase stat variationer når du skifter fra symmetrisk til asymmetriske løsning betingelser var faktisk observeret for at være enige. Derudover begge metoder til at generere asymmetriske løsning betingelser vises her, er sammenligneligt hurtig (Sammenlign Ref.8) og kommer med ingen kendte risici af lokale sammensætning ændringer (Sammenlign referencer30,31), stigning i membranen spænding (Sammenlign henvisning32), eller lokal varme (Sammenlign henvisning33), hvad angår de alternative metoder omtalt i indledningen. Under diffusering mikrofluid er en osmotiske balance mellem vesikel interiør og eksteriør ikke kun afgørende for at undgå fase stat artefakter som nævnt ovenfor, men også deflation forårsaget af hypertonisk løsning betingelser kan forårsage de fangne GUVs at glide gennem stillingerne efter en ekstern løsning udveksling.

Selv om spontan hævelse har været anvendt med succes til at vokse tomt kan vesikler fra en DOPC/eSM/Chol system, i andre tilfælde, fraværet af gebyrer forringe GUV hævelse på grund af den deraf følgende manglende frastødning mellem de enkelte dobbeltlag44 . Forlængelse pre hævelse eller indfører pladskrævende lipid headgroups kan imødegå dette problem45. Derudover kan vesikel stabilitet efter deres fortynding i løsninger adskiller sig fra den, der anvendes for hævelse variere for forskellige lipid kompositioner og fortynding medier, som vi ikke har undersøgt her. Vi har også ikke undersøgt muligheden for tuning GUV gennemsnitsdiameteren med metoden forberedelse præsenteres her. Men parametre som vesikel sammensætning og hævelse løsning er tilbøjelige til at påvirke resultaterne. Anvendelsen af alternative metoder46 kan give større vesikler for lipider og løsninger, der anvendes her, men de kan komme med andre ulemper forbundet med metoden. Den ovenfor beskrevne metode til at producere GUVs i symmetriske og asymmetriske high-saltholdighedsforhold giver en potentiel værktøj for yderligere undersøgelser af vesikler består af forskellige lipid kompositioner og spredt i forskellige medier. Da vi ikke har udforsket mulighederne, vil fremtidige forsøg vise hvordan generelt GUV forberedelse og fortynding metoder kan anvendes.

Observere faseadskillelse på varierende temperaturer

Der findes forskellige eksperimentelle opsætninger egnet til at studere GUVs ved forskellige temperaturer. Mens disse opsætninger der ikke almindeligvis er beskrevet indgående i litteraturen, præsenterer det nuværende arbejde en grundlæggende forsamling gældende for sådanne undersøgelser.

kontrol målinger viser, at temperaturen i dette in-house designet og bygget kammer er netop kontrolleret af en termostat og temperatur forløb inde i kammeret er inden for den eksperimentelle temperatur beslutning. Det sikres at de termiske forsøgsbetingelser er konsistent med læsning af termostaten.

Under vurderingen af GUV fase stater over et bredt temperaturinterval er det vigtigt, at de observerede vesikler godt ekvilibreres når temperaturen er blevet ændret. En mulig måde at sikre dette er at kontrollere, om hysterese. Hvis hysterese er til stede, temperatur skridt bør være faldet og/eller ækvilibrering gange øget. Som temperatur er kontrol i dette arbejde etableret af en vandbaseret termostat, rækken af arbejdende temperaturer er ideelt set begrænset til 0 - 100 ° C. Dette interval kan udvides ved hjælp af andre temperatur kontrol væsker såsom olie eller ved at ansætte andre opsætninger, f.eks. en Peltier enheden. I praksis, er at arbejdstemperatur også begrænset af mulige kondens eller fordampning. Derudover for temperaturer langt væk fra stuetemperatur bliver forekomsten af en steady state temperaturgradient på tværs af bemærkning afdeling mere sandsynligt. Også, den imaging udstyr kan skades ved ekstreme temperaturer. For typiske temperaturområder passende for lipid vesikel undersøgelser (~ 10-50 ° C7,9) skader til observation udstyr bør overvejes men er typisk ikke forventes.

Vesikel domæne observation artefakter

Der er en række kilder til observation artefakter ved hjælp af wide-felt Fluorescens mikroskopi. Først og fremmest bør man være opmærksom på at den maksimale opløsning r for objektet ansøgt om besigtigelse af vesikel fase stater bestemmer detektionsgraensen for lipid domæner i henhold til:
Equation 2
hvor λ er emission bølgelængde, og NA er numerisk blænde af målet. En typisk mål med en 40 x forstørrelse og en NA på 0,6, som registrerer grøn udledning lyse omkring 560 nm ville nå en optisk opløsning af ~0.6 µm. dermed, undersøgelser, der sammenligner fase stater af vesikler fremstillet af særligt lipid blandinger blandt forskellige betingelser skal bruge det samme mål for samme lipid blandingen.

En anden genstand er forekomsten af lipid domæner som følge af lipid foto-oxidation skyldes en udvidet eksponering for excitation lys41. Foto-skade forekommer fortrinsvis på umættede carbonhydrider lipid fraspaltning. I virkeligheden, for nogle lipid kompositioner, sådan domæne dannelsen af oprindeligt homogene vesikler blev observeret her efter en længere periode af excitation lys eksponering (~ 30 s). For at imødegå dette problem, var excitation-lyset holdt fokuseret på én synsfelt for kun et par sekunder for fase stats vurdering. Derfor var DiIC18 egnet til vores formål. Andre farvestoffer, men kan være meget mere følsomme og skal måske håndteres på lavere excitation intensiteter og med kortere excitations lys eksponering gange.

Mekanisk shear stress fra pipette overførsel af vesikler blander potentielt domæner midlertidigt, dermed fordreje tilsyneladende vesikel fase adfærd. For nogle partier, forskellige vesikler viste forskellige fase adfærd 0 min og 5 min efter pipette overføre på mikroskop-coverslip. Også har den shear stress induceret af den flydende flow i mikrofluid enheden vist sig at resultere i domæne blanding47. Vesikler bør stå uforstyrret i et tilstrækkeligt tidsrum for ækvilibrering før observation. Inden for denne undersøgelse, blev vesikler fanget på mikrofluid enhed efterladt uforstyrret i 1 time efter vesikel lastning og løsning udvekslinger før observation.

At undgå nogle af de ovennævnte vanskeligheder samt begrænsning af lys diffraktion grænse, alternative metoder såsom Kernemagnetisk resonans-spektroskopi48 eller super opløsning mikroskopi teknikker49 kunne være ansat.

Konklusion og outlook

Det præsenterede arbejde viser et sæt af metoder, der giver mulighed for analyse af høj saltholdighed symmetriske og asymmetriske løsning betingelser indflydelse på membran faseadskillelse. Alle de præsenterede metoder er velegnede til andre anvendelser. Mikrofluid enheden giver for eksempel en platform for at studere kinetik af domæne opståen og forsvinden ved induktion af løsning asymmetri. Domænet udseende som en funktion af saltkoncentration kunne også undersøges måde. Alle metoder kan også bruges til at kigge på indflydelse på fase adfærd ved hjælp af enhver anden løsninger af interesse.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er en del af MaxSynBio-konsortiet, der er i fællesskab finansieret af Forbundsministeriet for uddannelse og forskning af Tyskland og Max Planck Society.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt Avanti Polar Lipids 840475C abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860061 abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %) Avanti Polar Lipids 700000 abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Molecular Probes D-282 abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) Merck
NaCl (> 99.8 %) Roth
HCl (37 %) Roth
Tris (≥ 99.9 %) Roth
Sucrose (≥ 99.5 %) Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL Kimble Soda flat bottom, white screw cap
pH meter Mettler Toledo MP220
Osmometer Gonotec Osmomat030
Epi-fluorescence microscope Zeiss Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA Zeiss LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA Leica 506174
Objective 63x, 0.9 NA Leica 506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläaser
Parafilm "M" Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL Braun
0.45 µm syringe filter GVS North America Cameo 25AS, 1213723 Acetate, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63 (2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172 (2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438 (2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105 (2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Tags

Kemi spørgsmålet 128 giant unilamellar vesikler opkrævet membraner spontane hævelse metode transmembrane løsning asymmetri mikrofluidik membran domæner flydende uordnede fase flydende bestilt fase fase sameksistens Gibbs trekant blandbarhed temperatur fluorescens og konfokal mikroskopi
Fase Behavior af ladede vesikler symmetriske og asymmetriske løsning betingelser overvåges med Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubsch, B., Robinson, T.,… More

Kubsch, B., Robinson, T., Steinkühler, J., Dimova, R. Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56034, doi:10.3791/56034 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter