Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i Xenopus

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/56035

Summary

Gener som är nödvändig för överlevnad utgöra tekniska hinder för att skapa mutant linjer. Bli ledande kringgår dödlighet genom att kombinera genomet redigering med primordiala könsceller transplantation till skapa vildtyp djur som bär könsceller mutationer. Bli ledande tillåter också effektiv generering av homozygot null mutanter i F1 generationen. Här demonstreras steget transplantation.

Abstract

Skapandet av muterade linjer genom gen editering accelererar genetisk analys i många organismer. CRISPR/Cas9 metoder har anpassats för användning i afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, långvariga modellorganism för biomedicinsk forskning. Traditionell avel system för att skapa homozygot muterad linjer med CRISPR/Cas9-riktad mutagenes har flera tidsödande och mödosamma steg. För att underlätta skapandet av muterade embryon, särskilt för att övervinna de hinder som är associerad med knackar ut gener som är viktiga för embryogenes, utvecklades en ny metod som kallas bli ledande. Denna teknik utnyttjar robustheten i Xenopus embryon att ”klippa och klistra” embryologiska metoder. Bli ledande använder tredjeparts överföring av primordiala könsceller (PGCs) från effektivt-mutagenized givare embryon till PGC-uppföljningsstudien vildtyp syskon. Denna metod möjliggör effektiv mutationen av viktiga gener genom att skapa chimära djur med vildtyp somatiska celler som bär en mutant könsceller. När två F0 djur som bär ”leapfrog transplantationer” (dvs, mutant könsceller) är intercrossed, de producerar homozygot eller sammansatt heterozygot, null F1 embryon, vilket sparar en hel tid att skaffa fenotypiska data. Bli ledande ger också en ny metod för att analysera maternell effekt gener, som är refraktära mot F0 fenotypiska analys efter CRISPR/Cas9 mutagenes. Detta manuskript Detaljer metoden för bli ledande, med särskild tonvikt på hur man lyckas utföra PGC transplantation.

Introduction

Hur genotyp kodar fenotyp har varit en stor fråga i biologi eftersom återupptäckten av Mendels lagar. En förståelse för gener, deras reglering och växelverkan inom genen nätverk roller och funktioner kodade produkter löften att ge verktyg för avtäckning nya biologi och ameliorating sjukdomstillstånd. För mer än hälften en talet1, har afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, varit en ledande modell för studier på en mängd olika ämnen i grundläggande biologi och biomedicin, inklusive genetisk kontroll av utveckling. Historiskt har de flesta forskning om Xenopus har använt allotetraploid grodan, X. laevis, men mer nyligen, på grund av dess diploidy, X. tropicalis har utvecklats som en amfibie genetisk modell. Hela genomet sekvenser har samlats från både Xenopus arter2,3. Gemenskapens ”groda” är nu vid en vändpunkt där grundläggande genomet ändring teknik tillåter studier av geners funktion, praktiskt taget på kommer. Programmerbara CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenicitet gener högeffektiva, med biallelic mutation möjligt i de flesta celler av djur4,5,6,7, 8,9,10,11. Dessa studier, ministerkvartetten Bhattacharya et al. 12 och Shigeta o.a. 13, har visat att många geners funktion kan studeras av mutagenicitet i F0 mosaik djur. Detta tillvägagångssätt har många fördelar; Cas9-sgRNA-microinjected embryon visas dock ofta variabla fenotyper på grund av ofullständig förlust av funktion (LOF). Mer påtagligt, generering av muterade linjerna är mycket fördelaktigt för vissa program – i synnerhet när man studerar gener som har ett moderns mRNA-bidrag. Maternell mRNA och proteiner och deras påverkan på epigenetik, kvarstår under en längre period i embryogenes14,15,16, rendering tidigt utvecklings bidrag från många gener eldfasta F0 analyser. Därför krävs andra LOF tillvägagångssätt.

När man vill skapa mutant linjer, har sökvägen till att erhålla homozygot LOF embryon flera hinder. Första, effektiv mutagenes att producera biallelic mutationer kan vara ofördelaktigt eftersom förlust av viktiga genen funktioner resulterar i fel att överleva till könsmognad, störa produktionen av en livskraftig linje. En gemensam lösning är försiktig titrering av mängden Cas9-sgRNA levereras. Här är målet att uppnå en balans mellan att minska dödlighet samtidigt också maximera könsceller mutagenes effektivitet. Ett andra problem uppstår från systemet med standard avel, där fenotypiska analyser är uppskjuten tills den F2 generationen. Med standardmetoden, könsmogna F0 djur som överför mutant alleler genom könsceller är outcrossed för att producera F1 heterozygot ”bärare”, som odlas sedan till könsmognad. Två F1 heterozygoter är sedan intercrossed för att producera F2 mutant embryon i förväntade Mendelian frekvens på 25%. Två generationer av avel är således nödvändiga för analys av muterade fenotyper. Muterade djur kan vara antingen homozygoter eller sammansatta heterozygoter (dvs avkomma som innehåller två olika muterade alleler, vilket beror på genotyperna av de föräldra djur som används i den F1 intercross).

Dessa hinder kan övervinnas genom att begränsa programmerbara nuclease-medierad mutagenes att könsceller, som ligger bakom en ny metod som kallas utvecklingssprång17. Bli ledande har två huvudsakliga komponenter: (1) Mikroskop Cas mRNA tillsammans med sgRNA eller nuclease-sgRNA komplex (eller, i princip, TALENs eller zink finger nukleotider) på encelliga scenen för att effektivt mutagenize embryonala genomen, följt av (2) transplantation av PGCs till vildtyp syskon embryon, där de endogena PGCs togs bort. När båda stegen är effektiv, komplett könsceller ersättning med muterade könsceller kan erhållas. Blackler visade i början av 1960 att Xenopus PGCs kunde transplanteras mellan embryon på den sena neurula och tidig tailbud arrangerar18,19. För att bli ledande, ändrades Blacklers strategi genom att utföra transplantationerna på blastula etapp17, när PGCs är lokaliserade i vegetal stången av embryo20,21. Transplantation före gastrulation har två huvudsakliga fördelar. Först, engraftment transplantationer och efterföljande normala utveckling befanns vara effektivare när transplantation görs i ett skede blastula (opublicerade observationer). Andra, genom att utföra blastula-scenen transplantationer strax efter zygotic transkription har börjat, kan man undvika den dödlighet som följd utvecklingsmässiga genen mutationer som stör gastrulation eller som annars leder till missbildade sena neurulae. PGC transplantation räntebärande (”leapfrogged”) embryon odlas till könsmognad och intercrosses mellan dessa F0 djur har visat att, i många fall 100% av F1 avkomman visar LOF fenotypen (de flesta som är sammansatta heterozygoter), som anger komplett könsceller ersättning med de rikta mutationerna.

Det förväntas att bli ledande kommer att påskynda genetiska metoder i Xenopus. Bli ledande föreskrivs också ett alternativ till ”host överföring” metod22 LOF analysen av mödra-effekt gener (opublicerade observationer). I den aktuella publikationen presenteras en detaljerad beskrivning av metoden, med särskilt fokus på PGC transplantation, i X. tropicalis (med smärre ändringar för X. laevis). Transplantation av PGCs demonstreras här för att underlätta en snabbare överföring av denna teknik till andra laboratorier som arbetar med Xenopus. Principerna för denna metod bör vara framgångsrika i andra groddjur (t.ex. urodeles), och organism-specifika ändringar i metodik bör möjliggöra för att många andra djur som effektiv mutagenes kan åstadkommas och PGCs är lätt transplanterbara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of California, Irvine.

1. förberedelser för PGC Transplantation

  1. Förbereda dissektion verktyg i förväg, som tidigare beskrivits23.
    Obs: Ögonbryn hår knivar används för att göra snitt med hjälp av en hår slinga att stabilisera embryot medan du utför operationerna. Ögonbryn hår och hår slingor är limmade i borosilikatglas Pasteur-pipetter som först har dragits i en låga och bruten på den tunnas delen (se figur 1A, pilspets) att skapa en kortare, smalare spets (figur 1B) för större fingerfärdighet När du utför operationer.
  2. Generera sgRNAs använda förfaranden tidigare beskrivna24 .
    Obs: Kort, kort DNA mallar som kodar för sgRNAs skapas med överlappande deoxyoligonucleotides innehållande 5' bacteriophage T7 initiativtagare, som är glödgas och ”fyllt i” genom en felfri, termostabila DNA-polymeras. In vitro sgRNA syntes reaktioner inkuberas i flera timmar till över natten (beroende på satsen används). Reaktioner är DNAS-behandlade ta bort mallen. SgRNAs renas av standardmetoder för fenol/kloroform utvinning och ammonium acetat/isopropanol-nederbörd, enligt kit tillverkarens instruktioner24.
  3. Strax innan du utför microinjections, förbereda Cas9-sgRNA komplex av första denatureringen ~ 250 ng av sgRNA i en 3 µL total volym av RNAse-fri (diethylpyrocarbonate-behandlade) H2O vid 60-65 ° C i 5 min, följt av snabb-kylning på is för 5 min. Centrifugera sgRNA i några sekunder, tillsätt 1 µL av 1 µg/µL Cas9 protein och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C att främja komplexa bildande.
    Obs: Efter denna inkubation, röret kan förvaras på is medan du förbereder embryon för Mikroskop.
  4. X. tropicalis embryon genom in vitro- befruktning med vanliga metoder, som tidigare beskrivits25. De jelly25,26 embryona på 10 min efter befruktning.
    Obs: Befruktningtiden anses tiden efter den spermier tillsätts äggen och skålen är översvämmad med 1/9thX Marcs modifierade Ringers (MMR)26. För X. tropicalis25, till skillnad från X. laevis, utföra den de Geléskapande i 1/9 x MMR som innehåller 3% cystein fria basen (inte HCl salt), pH justeras till 7,8-8,0, följt av flera tvättar i 1/9 x MMR. Överföra embryon till en agaros (1%)-belagda maträtt som innehåller 1/9 x MMR vid rumstemperatur.
  5. Omedelbart överföra embryona som injiceras till en 1% agaros-belagd maträtt som innehåller 1 x MMR använda en Pasteur-pipett.
  6. Injicera i 1-cellstadie. Se referenser26,27 för detaljerade beskrivningar av Xenopus Mikroskop metoder.
    1. Injicera varje embryo på en enda sajt i den djur Polen, med 4 nL Cas9-sgRNA komplex (slutliga belopp = 1 ng Cas9 och ~ 250 pg av sgRNA; se diskussion)24. Efter 10-20 min injektion webbplats helande, överföra embryon till en agaros-belagd maträtt som innehåller 1/9 x MMR och inkubera vid 25 ° C. Också skapa en maträtt av uninjected syskon embryon som kommer att tjäna som transplantat mottagare.
  7. Förbereda Petri plattor (60 mm) som innehåller en ~ 5 mm-tjockt lager av 1% agaros som gjort under 0,3 x MMR, om transplantationer i X. tropicalis, eller 1 x MMR för X. laevis.
    1. Skapa fördjupningar ~ 3-4 mm djup genom att infoga en 3-x 4-väl mögel (skapas genom att skära en PCR-plattan med 96 brunnar) i smält Agarens när hälla plattorna (se figur 1 c och D). Håll formen flera millimeter ovanför botten av petriskål med hjälp av en klämma bifogas en ring stå tills Agarens har stelnat.
    2. Se dessutom en 24-well platta hus enskilda embryon genom beläggning brunnarna med ett tunt lager av 1% agaros som gjort under 1/9 x MMR.
      Obs: Odlingssubstratet tillsätts dessa brunnar är 1/9 x MMR kompletteras med 50 µg gentamycin sulfat/mL.

2. transplantation av PGCs

  1. När embryon bara nå Nieuwkoop och Faber28 blastula etapp 9 (figur 2A), ~4.5 h efter befruktning (hpf) för X. tropicalis, ta bort dem från 25 ° C inkubatorn och tillåta dem att temperera vid rumstemperatur för ytterligare 0,5 h.
  2. Att börja transplantation vid 5 hpf (figur 2B), använda en Pasteur-pipett för att överföra ett PGC givare embryo (injiceras med Cas9-sgRNA) till 60 mm agaros skålen som innehåller fördjupningar (skapade i steg 1,7) i 0,3 x MMR (eller 1 x MMR om använder X. laevis). Även överföra ett uninjected syskon embryo, transplantat mottagaren, att denna maträtt.
    Obs: Det är viktigt att identiteterna för var och en av dessa embryon inte är förväxlas.
  3. Manuellt ta bort vitelline kuverten från varje embryo med pincett och rotera båda embryon så att deras vegetal polacker är i se och tillgänglig för kirurgi.
    Obs: En beskrivning av manuell de-vitellination av embryon har tidigare varit beskrivs26.
  4. Använda den skarpa spetsen av ett ögonbryn hår kniv, göra fyra grunda snitt i form av en kvadrat på vegetal stolpe av mottagarens embryot, inuti zonen där framtida flaska celler som markerar blastopore kommer att bilda. Göra snitt genom att sätta spetsen av ögonbryn hår kniven i embryot, strax under ytan, och göra uppåt skivning rörelser samtidigt stabilisera embryot med hår slingan.
    Obs: Figur 2 visar vegetal utsikt över ett embryo på halv-timme från 4,5-7,0 hpf att Visa Cellstorlek och ge en guide för att uppskatta där flaskor cellerna bildar (streckad vit cirkel). Syftet är att göra snitt där rutan svart streckad indikeras.
  5. När de fyra sidorna av torget är avgränsad av snitt, fördjupa varje snitt med ögonbryn hår kniven med liknande skärande rörelser till ett djup av cirka 1/3 till 1/2 av avståndet till golvet blastocoel.
  6. Gratis den vegetal vävnad explant från mottagarens embryot (figur 3A och B) genom att göra en horisontell (parallell med vegetal ytan) cut(s) i regionen djupt vegetal.
    Obs: Storleken på den PGC-innehållande vegetabiliska explant är cirka 0,4-0,45 mm per sida och 0,25-0.3 mm i djup. Detta vegetal explant från mottagarens embryot längre behövs inte och därför bör avsättas till kasseras.
  7. Arbeta snabbt, upprepa proceduren (steg 2,4-2,6) på PGC givare embryot att skapa ett liknande storlek vegetal vävnad fragment för transplantation.
    Obs: Det är viktigt att utföra denna andra dissektion med lite fördröjning att minimera tiden för mottagarens embryot att läka dess öppna sår.
  8. När vävnaden som innehåller PGCs avlägsnas från givare embryot, Använd ögonbryn hår kniv och hår slingan för att flytta denna explant i position i öppningen skapade i mottagarens embryot.
    Obs: Den inre ytan av givare transplantat måste vara vänd inre av mottagarens embryot. Det är inte nödvändigt att matcha riktlinjerna från den dorsala-ventrala och vänster-höger axeln av graften med mottagarens embryot.
  9. Använd den långa kanten på axeln av ögonbryn hår kniven, hölls parallellt med ytan av graften, försiktigt trycka transplantat i öppningen i mottagarens embryot vegetal yta.
  10. När transplantat har placerats, Använd en hairloop eller skaftet på en ögonbryn hår kniv försiktigt glida ”stommen” givare embryots över agaros ytan och in i en agaros depression. Se till att det öppna såret av kadavret är vänd bulk vätskan. Om inte, Använd ögonbryn hår kniven för att rotera embryot för att uppnå denna orientering.
  11. Skjut mottagarens embryot, med transplantat healing på plats, i en intilliggande depression och jämväl se till att den ympade vegetal pole vävnaden är vänd bulk vätskan.
  12. Upprepa denna procedur (steg 2.1-2.11) med ett annat par av givare och mottagare embryon för att skapa en annan transplantation/kadavret par; överföra dessa till Tom fördjupningar.
    Obs: Det är viktigt att en gör beteckningssystem att hålla reda på matchade par av slaktkroppar och transplantation-bärande embryon. Givare slaktkroppar ska användas som en proxy för effektiviteten av Cas9-sgRNA-inducerad mutagenes i de transplanterade PGCs, som inte kan analyseras enkelt tills de transplantation-bärande djur når könsmognad (se steg 3.3, nedan, och diskussion ).
  13. Fortsätta att göra transplantationer tills embryona når cirka gastrula tidigt 10, vilket är cirka 6,5 hpf i X. tropicalis (se figur 2E).

3. helande efter hand om embryon

Obs: Ympkvistar läka på plats inom ~ 30 min, och det är normalt att iaktta vissa yolky skräp från cellen lysis avsöndrats från embryot (figur 3 c).

  1. När läkt, Använd en Pasteur-pipett mycket försiktigt överföring embryon från fördjupningar i enskilda brunnar av en agaros-belagd 24-bra platta. Exsudat blir bort (figur 3D) av vätska blanda under överföringen.
    1. Rotera embryona så att de placeras vegetal-pole upp, inför bulk lösningen. Igen, placera givaren slaktkroppar och ympa mottagare i intilliggande brunnar att hjälpa till att hålla koll på embryo par; spela in denna information.
  2. Överföra 24-väl plattan som innehåller embryon till en 25 ° C inkubator för övernattning kultur.
    Obs: Nästa dag, embryon har nått tailbud stadier.
  3. Flytta transplantat mottagarna att rengöra agaros-belagd 6-väl plattor som innehåller 1/9 x MMR kompletteras med 50 µg gentamycin sulfat/ml, med 1 embryo per brunn. Ha en tydlig förteckning över givare slaktkroppar som matchar dessa mottagare av transplantat.
  4. För att bedöma mutagenes effektivitet genom sekvensering PCR-amplikoner5,17,24 eller använda andra metoder som förlitar sig på PCR-amplikoner (se diskussion), flytta enskilda slaktkroppar till 0,2 mL PCR-strip rören. Ta bort de flesta av medium och homogenisera i 100 µL lysis buffert24 innehållande proteinas K (PK) av upprepade up-and-down pipettering med P200 pipett.
  5. Utföra embryo lysis24 vid 56 ° C i 6 h till över natten för att tillåta PK matsmältningen. Inaktivera PK genom att värma det till 90-95 ° C i 10 min, följt av snabb kylning till 4 ° C. Använda lysates utan ytterligare rensning steg till utsäde PCR reaktioner för att få kort amplikoner för direkta Sanger DNA sekvensering24. Lagra lysates vid-20 ° C.
    Obs: Inom några dagar, grodyngel kommer nå utfodring stadier (stadium ca 45-46) och kan matas en suspension av plankton pulver (sera Micron).
  6. Efter ~ 1 vecka, med dagliga förändringar som odlingssubstrat att upprätthålla renlighet och minimera mikrobiell överväxt, flytta grodyngel till små tankar i ett cirkulerande akvatiska system med dropp flöde. Använda sekvensering data för att segregera grodyngel med mycket effektivt mutagenized PGCs från grodyngel med lägre mutagenes effektivitet. När metamorfos är klar, flytta Veracruz till det vuxna akvatiskt systemet i labbet.
    Obs: Regimer som utvecklats av nationella Xenopus resursen (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) ger en guide med stegvisa anvisningar för grodyngel utfodring29 och vuxen groda underhåll30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter transplantation, kvalitativ bestämning av effekten av CRISPR/Cas9 mutagenes bör utföras innan spilla ansträngningen i djurhållning att växa och behålla djuren till könsmognad. Eftersom djur som bär leapfrog transplantationer är somatically vildtyp och könsceller är svårt att få tillgång till direkta mätningar, blir det viktigt att spara slaktkroppar av givare embryon. DNA-analys från slaktkroppar fungerar som en proxy för omfattningen av mutagenes som uppstår i den transplanterade könsceller17.

En metod att bedöma framgången av mutagenicitet är direkt PCR-amplikoner som spänner över regionen genomisk riktade sekvens. Detta blir särskilt kostsamma och ineffektiva om ett önskemål att sekvensera talrika individuellt klonade DNA fragment från många djur. Sekvensering amplikoner heterogena på målwebbplatsen, som de härrör från genetiskt mosaik embryon, i stället används för att bedöma mutagenes effektivitet i varje embryo19. Visualisering av kromatogram visar den wild type-sekvensen (toppar) uppströms målet sekvens och toppar blir ”äggröra” (dvs, samtidig förekomst av toppar som motsvarar flera baser som förekommer på varje nukleotid position) nedströms webbplatsen för Cas9-katalyseras dubbel-strand avbrottet. Exempel på sådana profiler kan hittas i figur S1 av Blitz et al. 17. noggrann kvantitering av omfattningen av mutagenes representeras av dessa kodade toppar kan erhållas med hjälp av en sekvens nedbrytning algoritm, TIDE (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Screening enskilda embryon med denna teknik ger förtroende att varje embryo var ordentligt injiceras och måltavlan för mutagenicitet. Spårämne, såsom en fluorescently märkta dextran, kan användas för att bekräfta lyckad injektion24 och kan också stöd i att fastställa att en tadpole faktiskt bär den transplanterade vävnaden (opublicerade data). Det är viktigt att notera att den formella möjligheten att coinjection av en fluorescerande dextran tillsammans med Cas9-sgRNA kan ändra Cas9 mutagenes effektivitet inte har undersökts. Någon ”leapfrogged” embryon som innehåller transplantationer från dåligt eller unmutagenized givare kan kasseras.

Bli ledande kringgår behovet F2 generation analys i standard genetiska avel system, genom att tillåta effektiv fenotypiska analyser i F1 embryon. När du använder standardmetoden för att mutera viktiga gener, krävs noggrann titrering av Cas9-sgRNA dos för att säkerställa lönsamhet grundare embryon, vilket resulterar i en minskad mutagenes effektivitet. Överlevande F0 är djur från detta standard system sedan outcrossed med wildtypes att få livskraftiga F1 embryon, som undersöks för att identifiera bärare. Slutligen, dessa F1 heterozygoter odlas till könsmognad och intercrossed för att erhålla homozygot F2 individer visar mutant fenotyper. Däremot eftersom bli ledande producerar djur som har fullständig ersättning av deras germlines med muterade alleler, producerar intercrossing dessa F0 djur mutant fenotyper i F1 generationen. Blitz o.a. 17 rapporterade att en majoritet av F0 djur riktar det tyrosinase (tyr) locus, som krävs för pigmentering av melanocyter och näthinnan, visade 100% könsceller transmission (mätt genom korsningar med Tyr- / - albino djur) av givare-derived mutant genom (se tabell 1och Figur 4A-B ). Således skulle intercrossing två djur produceras av bli ledande ge homozygot eller sammansatt heterozygot mutant F1 embryon.

Liknande resultat erhölls17 av intercrossing F0 leapfrogged djur som bär mutationer i den homeobox (kodning den DNA-bindande homeodomain) av goosecoid (gsc) genen (se figur 4A, C-H). Knockdowns av generalsekretariatet uttryck med morpholino antisense oligonukleotider i X. laevis föreslog att generalsekretariatet genen är nödvändiga för en fullständig utveckling av den främre huvud32, och Cas9-sgRNA injiceras grodyngel också Visa embryonala dödliga fenotyper17. Men leapfrogged F0 djuren, att vara somatically vildtyp, är livskraftig och robust och den F1 intercross producerade embryon med identiska LOF fenotyper dem publicerade i X. laevis knockdowns17. Dessa uppgifter genetiska styrkande av morpholino fenotypen, såväl som ett bevis på principen att bli ledande kan användas för att övervinna embryonala dödliga fenotyper.

Figure 1
Figur 1: material behövs för transplantation. (A) borosilikatglas Pasteur-pipetter används för att göra ögonbryn hår knivar och hår öglor för mikrokirurgi på tidiga embryon. Rita ut glaset med hjälp av en bunsenbrännare möjliggör en smalare slutet för införande av håret. Den röda pilspetsen markerar ungefärliga position att glaset går sönder. (B) ett exempel på ett ögonbryn hår kniv (överst) och hår slinga (botten), fast i pipetter med snabbtorkande lim. (C), en del av en PCR-plattan med 96 brunnar används för att skapa fördjupningar i en agaros plattan genom att låta den 1% agarosen stelna runt mögel (agaros görs i 0.3 x eller 1 x MMR, beroende på huruvida transplantationerna utförs i X. tropicalis eller X. laevis, respektive). Tjockleken på Agarens är ~ 5 mm, med 3-4 mm-djupa brunnar. (D) ett exempel på en agaros platta för transplantation, med 12 fördjupningar, som visas i panelen C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: morfologi av vegetal stången under den sena blastula gastrula tidigt och strategin för dissektion. (A-F) Xenopus tropicalis embryon visas i vegetal se på halv-timme tidsintervall, från början av blastula etapp 9 (4.5 hpf) till tidig gastrula etapp ~10.25 (7 hpf). Före 5 hpf, blastomerer är stora och lättare skadad. Vita, streckad cirkel markerar beräknade position av flaska cell formation under gastrulation, vilket kan ses som början på ryggsidan (överst) i paneler (E och F). Bli ledande, fyra snitt görs inom en kvadrat, avbildad med svarta streckade linjer, med en final cut görs parallellt med ytan av vävnaden (inte illustreras) gratis den vegetal explant. Skalstapeln = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Transplantation. (A) ett exempel på ett ~5.5 hpf embryo efter avlägsnande av vegetal PGC-innehållande vävnaden. De svart streckad ruta och vit streckad cirkel är samma relativa mått som de som visas i figur 2. (B) den vegetal explant bort från embryot i panel A, inre ytan mot betraktaren, är cirka 0,4-0,45 mm per sida och 0,25-0.3 mm i djup. (C) ett embryo med transplanterade vegetal vävnaden. Bilden förvärvades ~ 10 min efter transplantation. (D) 30 min efter transplantation, den vegetal vävnad ses att har läkt på plats (försiktig omskakning med ett ögonbryn hår kniv ovan embryot användes för att skapa en virvel som svepte bort skräp sett i panel C). Efter överföring till 1/9 x MMR och inkubation vid 25 ° C komplett de flesta embryon gastrulation normalt. Skalstapeln = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Könsceller överföring från F0 djur produceras av bli ledande. (A) för att bli ledande, riktade två gener av CRISPR/Cas9, tyrosinase (överst) och goosecoid (nederst). Tyr genen var riktade4,5 inom kodning sekvensering (blå skuggning) för en N-terminal signal peptid (SP, röd skugga), medan gsc genen var riktade17 inom kodande sekvens på den början av homeobox (röd skuggning), som delas mellan två exoner. Oöversatta 5' och 3' exonic regioner är nedtonad. (B) alla 160 F1 grodyngel från (se även tabell 1) en parning av en leapfrogged F0 manlig (LF1) och en albino (tyr-/-) kvinnliga var albino, vilket tyder på att det hela könsceller från leapfrogged hanen hade varit ersatt med tyr mutant könsceller. Infällt visar en vildtyp grodyngel med normala retinal och melanocyte pigmentering. (C-H) F1 embryon härrör från en intercross mellan två F0 leapfrogged Xenopus inriktning homeobox genen generalsekretariatet. Cirka 2/3rds av embryona var fenotypiskt mutant för generalsekretariatet, med fenotypen är varierande grad av främre trunkering av huvudet (E-H). Hälften av mutanter var antingen cyclopic eller hade tätt radavstånd ögon (F), medan den andra hälften var eyeless (H). Genotypning visade dessa vara homozygoter eller sammansatta heterozygoter. 1/3rd av embryon visar vildtyp fenotyp (C, D) var antingen homozygot vildtyp eller heterozygoter. In situ hybridisering för otx2 (en markör av framhjärnan, mellanhjärnan och ögon), egr2 (en markör för hindbrain rhombomeres 3 och 5, och en ström av neural crest) och hoxb9 (en markör av ryggmärgen) visar att förlust av generalsekretariatet funktion påverkar bara den främre delen av domänen otx2 . Dessa uppgifter återges från Blitz o.a. 17 med tillåtelse från företaget av biologerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cross Hane Kvinna Albino Vildtyp Totalt % Albino
1 LF1 Tyr-/- 160 0 160 100
2 LF2 Tyr-/- 148 0 148 100
3 Tyr-/- LF3 409 0 409 100
4 Tyr-/- LF4 0 519 519 0
5 Tyr-/- LF5 223 0 223 100
6 LF6 Tyr-/- 493 703 1196 41,2
7 Tyr-/- LF7 1 94 95 1.1
8 Tyr-/- LF8 125 0 125 100
9 Tyr-/- LF9 0 417 417 0
10 Tyr-/- LF10 252 0 252 100

Tabell 1: Effektiv könsceller ersättning av leapfrog transplantationer transporterar mutationer i tyrosinas. Inriktning tyrosinase, transplantation-bärande djur av båda könen erhölls. Dessa djur var korsat med albinos, som är homozygot tyr- / -, att testa för effektiviteten av könsceller överföring av muterade alleler och procent av F1 embryon som visade albinism var analyseras på tadpole scenen. Poster i kolumnerna märkt ”manliga” och ”kvinnliga” anger vilken förälder är antingen tyr- /- eller försöksdjur härrör från utvecklingssprång (LF). Procent av embryon i en cross som visar den albino fenotypen är angiven under ”% Albino”. Observera att 6 av 10 djur med leapfrog transplantationer visade fullständig (100%) ersättning med muterade alleler. Denna tabell återges från Blitz o.a. 17, med tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för transplantation av vegetal vävnad innehållande PGCs. Transplantation av PGCs används i samband med editering teknik (t.ex. CRISPR/Cas9) för att ändra könsceller av djur medan att behålla nästan alla dess somatiska vävnader som genetiskt vildtyp. För att bli ledande för att lyckas, finns det ett antal kritiska faktorer att överväga innan du utför utför transplantationer.

För att säkerställa fullständig ersättning av könsceller med muterade alleler, rekommenderas det att man först bestämmer i vivo effektivitet sgRNAs. Erfarenheten visar att de flesta sgRNAs designad av CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) eller CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) är effektiva när de används vid 250 pg/embryo. Dock i vissa fall kan det vara nödvändigt att använda högre koncentrationer (t.ex., den gsc sgRNA utgiven av Blitz et al17, krävs ~ 1 ng/embryo). Att bedöma effektiviteten i mutagenes på målwebbplatsen är viktigt och användningen av TIDE tillåter en kvantitativ bedömning31. Medan metoden betonas här använder den direkta Sanger har sekvensering av PCR-amplikoner (som representerar befolkningen av muterade alleler i F0 embryon), många andra metoder använts i litteraturen editering för detta ändamål. Andra till-måttlig-billiga metoder som vanligen används innehålla fragment längd polymorfism analys använder antingen förlusten av restriktionsenzym33 eller Cas9/TALEN klyvning platser34, T7 Amiiiiin 135 och lantmätare 36 analyser, de heteroduplex rörlighet assay37, de högupplösta smälta assay38, fragment analys av kapillärelektrofores39,40, och qPCR-baserade metoder41, 42.

En annan punkt är valet av målplats inom målgenen. För att möjliggöra effektiv återvinning av muterade fenotyper i F1 generation, är det viktigt att maximera chansen för komplett LOF alleler. När du gör mutant linjer med klassiskt tillvägagångssätt är det en gemensam strategi att rikta Cas9 klyvning nära 5' slutet av kodande regioner, för att framkalla prematur översättning uppsägning nära början av proteinet kodande regionen. F1 heterozygoter skulle identifieras med frameshift-mutationer, och dessa djur skulle väljas för ytterligare arbete eftersom de förväntas bära null-alleler. Eftersom strategin utvecklingssprång använder F0 intercrosses, skulle att närma sig av inriktning 5' slutet av kodande sekvens vara mycket ineffektiv. F0 embryon har mosaik germlines, och intercrossing resultat i populationer av F1 mutanter som är mest sammansatta heterozygoter17. Eftersom storskalig analys bekräftar att, i genomsnitt förväntade ~1/3rd av mutationer som produceras av dubbel-strand raster är i-frame43, skulle de flesta F1 embryon produceras på detta sätt ha minst en allel med en i-frame mutation som skulle behålla vilda typ verksamhet. Därför behövs en annan strategi för att säkerställa att även dessa i-frame muterade alleler kommer sannolikt att vara null-värden. Inriktning dubbel strand raster inom proteinveckning domäner som är nödvändiga för normal proteinfunktion förväntas resultera i en större chans att komplett LOF (null-alleler)17,44. Noga överväga de atomnivå styrstrukturen protein domäner, kan när det är tillgängligt, hjälpa till att identifiera regioner av sekundära struktur som, även när som innehåller en enda aminosyra i-frame borttagning, kan förväntas störa domän struktur ( t.ex., Δ3bp mutationen i generalsekretariatets utgiven av Blitz et al17). Om CRISPR/Cas9 mål platser kan identifieras inom dessa regioner, har en en större chans att framgångsrikt skapa null-alleler. Lilla borttagningar inom lösningsmedel-exponerade slingor mellan protein sekundära strukturella komponenter är mindre önskvärt eftersom mutationer i mer flexibla regioner kan fortfarande leda till funktionella proteiner.

En tredje faktor för bli ledande är effektiviteten i PGC borttagning från mottagarens embryot. Detta steg måste vara effektiv för att säkerställa fullständig könsceller ersättare. Det är för närvarande oklart om alla transplantat mottagarens embryon produceras av den metod som beskrivs här har fullständig borttagning av deras PGCs. hela-berget i situ hybridizations Visa variabilitet i lokaliseringen av PGC markörer i blastula-scenen embryon. I många fall alla eller nästan alla signalen hittas nära vegetal-mest slutet av embryot och skulle därför avlägsnas genom operationen beskrivs här (Blitz et al.17 och referenser däri). Några embryon visar dock PGC markör uttryck i några celler närmare till blastocoel golvet. Grodden plasm först coalesces vid vegetal Polen efter befruktning och sedan sveps längs klyvning fåror under tidig Klyvningar. Vissa groddar plasm får bli distribueras i celler i mitten på vegetal halvklotet och avlägsnas inte effektivt utan att använda transplantationer som sträcker sig till blastocoel. Det är dock också viktigt att notera att dessa djupa celler som innehåller bakteriecellen markörer inte skulle bidra till könsceller, som mikroRNA kallas att rensa PGC mRNA från kroppsceller45,46. Dessa djupa celler färgning positivt för PGC markörer kan vara somatiska celler som genomgår sådana clearance. Metoder för att säkerställa fullständig PGC borttagning från mottagarens embryon utvecklas för närvarande.

Slutligen är det också viktigt att överväga hur många F0 djur att generera genom bli ledande. Som ett varierande antal djur inte kommer att överleva till könsmognad, rekommenderas det att mer än 20 embryon som innehåller transplantationer skapas. Det kommer att vara nödvändigt att ha tillräckligt överlevande djur för att garantera (1) att tillräckligt antal båda könen kommer att erhållas och (2) att dessa överför muterade alleler på en tillräckligt hög frekvens för att vara lämplig för de analyser som planeras av forskaren.

Med hjälp av protokollet som beskrivs här, med lite övning, bör amfibie embryologer kunna behärska PGC transplantationer tekniken med lite övning. Bli ledande bör vara möjligt, inte bara i andra groddjur, men också andra organismer som innehåller PGCs som är lätt transplanterbara mellan individer i tidiga skeden av embryogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete utfördes med stöd av anslaget, 5R21HD080684-02, från National Institute of Child Health och mänsklig utveckling. Författaren vill tacka Ken Cho för hans fortsatta entusiasm och stöd. Författaren vill också erkänna Bruce Blumberg för användning av sin kamera, Rebecka Charney, för den kritiska behandlingen av manuskript, och Sean McNamara och Marcin Wlizla på den nationella Xenopus resursen (RRID:SCR_013731), för värdefullt samtal om X. tropicalis utfodring och djurvård regimer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife Homemade
Hair loop Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass Fisher Scientific 13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) Elmer's Products, Inc. KG581 To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered Integrated DNA Technologies Custom ordered Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit Ambion/ThermoFisher AM1334 Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Chemical Co. D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal PNA Bio, Inc. CP01 Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates Falcon 351007
24-well plates Falcon 3047
L-Cysteine Sigma Chemical Co. C7352-100G Free base, not HCl salt
Proteinase K Roche 03 115 828 001 Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron sera Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Tags

Fråga 132 genetik Xenopus genetik mutanter CRISPR/Cas9 TALEN editering mutagenes förlust av funktion
Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i <em>Xenopus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blitz, I. L. Primordial Germ CellMore

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J. Vis. Exp. (132), e56035, doi:10.3791/56035 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter