Summary
Protokoller for å studere embryonale og perinatal murine aorta bruker i vivo klonal analyse og skjebne kartlegging, aorta explants og isolert glatt muskel celler er beskrevet her. Disse ulike tilnærmingene lette etterforskningen av morphogenesis av embryonale og perinatal aorta i normal utvikling og patogenesen ved sykdom.
Abstract
Aorta er den største arterien i kroppen. Aorta veggen består av et indre lag av endotelceller, en midterste laget av vekslende elastisk lamellae og glatte muskelcellene (SMCs) og et ytre lag av fibroblaster og ekstracellulær matrix. I motsetning til den omfattende studien av patologisk modeller (f.eks aterosklerose) i voksen aorta, er mye mindre kjent om embryonale og perinatal aorta. Her vi fokusere på SMCs og gi protokoller for analyse av morphogenesis og patogenesen av embryonale og perinatal aorta SMCs i normal utvikling og sykdom. Spesielt fire protokollene inkludert er: jeg) i vivo embryonale skjebne kartlegging og klonal analyse; II) explant embryonale aorta kultur; III) SMC isolasjon fra perinatal aorta; og iv) subkutan osmotisk mini pumpe plassering i gravid (eller ikke-gravid) mus. Dermed lette disse etterforskningen av origin(s), skjebne og klonal arkitektur SMCs i aorta i vivo. De tillater modulerende embryonale aorta morphogenesis i utero med kontinuerlig eksponering for farmakologisk agenter. I tillegg isolert aorta vev explants eller aorta SMCs kan brukes til å få innsikt i rollen som bestemte genet mål i grunnleggende prosesser som muscularization, spredning og overføring. Disse hypotese-generering eksperimenter med isolert SMCs og explanted aorta kan deretter vurderes i sammenheng i vivo gjennom farmakologiske og genetisk tilnærminger.
Introduction
Sirkulasjons systemer av multicellular organismer funksjonen å levere næringsstoffer og oksygen til cellene som er ikke i kontakt med det ytre miljøet og fjerne avfallsstoffer og karbondioksid fra disse cellene. I virveldyr består primære sirkulasjonssystemet av hjertet, som pumper blod gjennom en rekke blodkar. Veggene i store blodkar, som arteries og årer, består av tre lag: jeg) den intima, eller indre laget av endotelceller; II) i media og midterste laget av vekslende circumferentially langstrakt glatte muskelcellene SMCs og elastisk lamellae; og iii) i adventitia, eller ytre laget av bindevev og fibroblaster. Det store flertallet av studier i vaskulær biologi fokus på endotelceller, undersøker dannelsen av nye endothelial celle-lined rør gjennom angiogenese. Sammenligning motta SMCs relativt liten oppmerksomhet. Men er SMCs en kritisk celle type i byggingen av normal arterieveggen og vaskulær patologi.
Aorta er den største kaliber arterien i kroppen, mottar cardiac utgang fra venstre ventrikkel hjertet. Det er rammet av ulike menneskelige sykdommer, inkludert åreforkalkning og aneurisme disseksjon. I voksen organismer, er aortabuen og dens store grener intenst undersøkt i modeller av vaskulær sykdom. For eksempel høy fett diett matet musene som null for genet koding low-density lipoprotein reseptor eller apolipoprotein E, utvikle åreforkalkning og skjebne kartlegging studier indikerer at eksisterende SMCs gi opphav til flere celletyper i den aterosklerotisk plakk1. I aortaaneurismer inkluderer patologiske forandringer SMC apoptose og ekstracellulær matrix remodeling2,3.
Betydelig mindre er kjent om SMC morphogenesis og patogenesen i embryonale og perinatal perioder. Her gir vi protokoller for å studere embryonale perinatal aorta SMCs og i vivovev explants og isolert celler. For eksempel, delineates den første delen av protokollen skjebne kartlegging og klonal analyse i embryonale mus. Grobunn recombinase uttrykt under kontroll av en celle-spesifikke promoter muliggjør merking av bestemte celler og deres avkom4,5,6; Imidlertid kan timelige kontroll av celle-spesifikke merking være utfordrende under embryonale utviklingen i mus. I denne sammenheng gir med embryo uttrykke den betingede CreER under en pådriver i SMCs (e.g.,Myh11 eller Acta2) og en grobunn reporter, vi metoder for injeksjonsbruk tamoxifen eller den aktive metabolitten 4-OH-tamoksifen i gravid dammer og for å analysere merket cellene i embryo eller postnatal avkom. Videre, i motsetning til skjebnen kartlegging studier, som hovedsakelig bruke grobunn journalister med et enkelt reporter fluorophore1,7, klonal analyse er vesentlig forbedret med multi-farge grobunn journalister.
Den andre og tredje delen av protokollen beskriver metoder for å isolere og dyrking embryonale aorta explants og aortic SMCs fra nyfødte, henholdsvis. Disse metodene tillater for manipulering av signalveier, spesielt i aorta explants eller SMCs, og analysere de direkte virkningene av farmakologiske agenter. Dermed kan rollen til bestemte gener i vevet rundt bli vist i en langt raskere måte enn gjennom tradisjonelle genetisk manipulasjon i mus. I tillegg isolert SMC studiene forenkle analysen av celle migrasjon og vedheft, som er teknisk begrenset i vivo.
Endelig delineates den fjerde protokoll delen plasseringen av en subcutaneous osmotisk mini pumpe lastet med farmakologiske agenter i gravid (eller ikke-gravid) mus. Denne metoden muliggjør analyse av effekten på embryonale utvikling forårsaket av agenter som krever kontinuerlig infusjon på grunn av rask metabolisme. Alternativ hyppige injeksjoner er ikke praktisk for mange agenter og bør unngås, det kan forårsake betydelig ubehag i den gravide demningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle mus protokoller er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Yale University.
1. I Vivo embryonale skjebne kartlegging og klonal analyse
Merk: vi har brukt disse metodene mye for å evaluere opprinnelsen til celler og deres klonal arkitektur i utvikling og sykdom modeller 7 , 8 , 9 , 10.
- satt opp parring mellom mus med en CreER og mus med en grobunn reporter.
Merk: En CreER brukes for SMC merking; Myh11-CreERT2 eller Acta2-CreERT2 mus 11 , 12 brukes vanligvis for dette formålet. Vi har brukt ROSA26R-CreERT2 mus 13 bredt merking embryonale vev.- For klonal analyse, bruker en multi-farge grobunn reporter (f.eks konfetti eller Rainbow [Rb] mus) 8 , 14 , 15 og skjebne kartlegging, bruker en én farge grobunn reporter (f.eks ROSA26R-YFP mus 16) eller dobbel-farge grobunn reporteren ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Merk: Denne avl-ordningen bruker voksen mus som 2-6 måneder gammel (vanligvis ~ 30 g) og genererer embryo med en CreER og en grobunn reporter.
- For klonal analyse, bruker en multi-farge grobunn reporter (f.eks konfetti eller Rainbow [Rb] mus) 8 , 14 , 15 og skjebne kartlegging, bruker en én farge grobunn reporter (f.eks ROSA26R-YFP mus 16) eller dobbel-farge grobunn reporteren ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Sjekk for vaginal plugger i morgen med et metall undersøke og vurdere middag på dagen av plugg som embryonale (E) 0,5.
- Skille kvinnelige fra hannen når en plugg oppdages.
- Forberede 4-OH-tamoxifen og tamoxifen arbeider løsninger.
- For 4-OH-tamoxifen, oppløses 5 mg i 50 µL av 100% etanol, vortex i 2 minutter og deretter legge til 450 µL maisolje. På is, sonicate på nivå 2 for 10 s sykluser med hvile mellom sykluser før prøven kjøles ned. Når prøven er fullstendig oppløst (vanligvis ~ 4-5 sykluser av sonication), tar 200 µL sonicated løsning og løse opp i 1800 µL maisolje gjøre siste fungerende løsning (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
- For tamoxifen, fortynne til 50 mg/mL i 100% etanol og vortex til det er oppløst. Fortynne i maisolje siste fungerende løsning (tamoxifen, 10 mg/mL) og rør på 45 ° C for å sikre at det er fullstendig oppløst.
- For tidlig embryonale induksjon, injisere 4-OH-tamoxifen intraperitoneally i en gravid dam.
- Bruker 4-OH-tamoxifen injeksjoner (opp til ~ 150 µg per gravid mus, eller omtrent 5 mg/kg kroppsvekt) på E5.5 og deretter som de gir levedyktig dam og embryo pups.
- Bruk tamoxifen ved doser på 0,5 - 1,5 mg (eller 17-50 mg/kg) for dammer gravid med embryoer på ~ E9 og deretter. Bruk en 30G-nål for alle injeksjoner.
Merk: Filtrering gjennom et 0.22 µm filter brukes vanligvis til å sterilisere alle blandinger før injeksjon.
- For klonal analyse, bruke intraperitoneal injeksjoner av høye doser av 4-OH-tamoxifen (f.eks, 5 mg/kg) eller tamoxifen (f.eks, 50 mg/kg) merke flere celler.
- å merke individuelle celler, sjarmere ned 4-OH-tamoxifen eller tamoxifen dosen slik at vev rundt (dvs. aorta), nesten alle embryoer analysert (som beskrevet under på slutten av denne delen) har enten ingen celler merket eller bare celler i én farge; Dette er terskelverdien dosen.
- å merke celler i midten slutten svangerskapsdiabetes perioden og å spore deres skjebne eller clonality i postnatal musen, injisere progesteron i intraperitoneal hulrom gravid dammen samtidig med tamoksifen i et 1:2 (progesteron: tamoxifen) dose forholdet.
Merk: Tamoxifen doser er 17-50 mg/kg og progesteron doser er 8.5-25 mg/kg (dvs., halvparten av tamoxifen doser). Progesteron injeksjon kan forsinke arbeid med ~ 1-2 dager. - Euthanize demningen gravid med embryoene til en ønsket alder bruker en åpen slipp, der dammen er plassert i en beholder som inneholder bomull og gasbind fuktet med ufortynnet isoflurane. Bekrefte død ved å åpne brysthulen å indusere pneumothorax, ved å fjerne den vitale organer eller ved å utføre cervical forvridning.
- Renset magen med 70% etanol. Bruk saks til å kutte åpne magen og dissekere ut livmoren. Fjerne embryoene fra livmoren og forsiktig skille embryoene fra morkaken og plommesekken ved hjelp av pinsett.
- Euthanize embryo E15 eller eldre ved å utføre enten cervical forvridning eller halshogging med kirurgisk saks eller en skarp kniv.
Merk: Embryo yngre enn E15 dør raskt etter euthanasia mor og/eller fjerning av embryoer fra mor. - Plasserer embryoene i iskalde PBS og klippe et lite stykke halen med saks til genotype for CreER og grobunn reporteren.
- Fikse embryoene i 4% paraformaldehyde på 4 ° C i 2 h. vask embryo tre ganger på PBS og deretter ruge embryo i 30% sukrose i PBS i 15-mL rør, vente til de synke, som kan ta opptil to dager.
- Fylle plast frysing former opp til 2/3 av maks med optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte. Plasser hver embryoet loddrett i mold, helt neddykket i oktober Incubate i 10 min ved romtemperatur (RT) for å minimere bobler.
- Sted frysing vev kvartaler stående i en tørris, 70% etanol bad fryse. Lagre blokkene på-80 ° C.
- Angi kryostaten temperaturen-22 ° c og skjær blokker for å generere tverrgående deler gjennom hele aorta, 10-20 µm tykk. Tørr lysbildene på RT i 30 min før du lagrer dem på-80 ° C.
- Tine skliene i RT, beskyttet fra lys å unngå bleking fluorophores. Vask lysbildene med PBS-Tween20 0,1%.
- For klonal analyse, beis lysbilder for kjerner (DAPI, 5 mg/mL) og direkte image andre fluorophores i Rainbow grobunn reporteren (Cerulean: 433-nm eksitasjon max, 475-nm utslipp max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Bruk følgende filtre for å oppdage fluorophores med en oppreist fluorescerende mikroskop: DAPI (eksitasjon max/båndbredde 350/50 nm, utslipp max/båndbredde 460/50 nm), Cerulean (eksitasjon 436/20 nm, utslipp 480/40-nm) texas rød (eksitasjon 560 / 40 nm, utslipp 630/75 nm) og tilpasset filter til å skille mCherry fra mOrange (eksitasjon 577/10 nm, utslipp 630/50 nm).
- For skjebnen kartlegging med mTmG grobunn reporter, oppdage GFP (484 nm, 510 nm), enten ved direkte imaging eller immunostaining. Bruke filtere GFP (eksitasjon 470/40-nm, utslipp 525/50 nm) bildebehandling med en oppreist fluorescerende mikroskopet.
- For immunostaining, ruge seksjoner med primære antistoffer overnatting på 4 ° C, vask med 0,1% Triton X-100 i PBS og deretter ruge med sekundær antistoffer for 1 h. Bruk anti-CD31 (siste konsentrasjon 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0.006 mg/mL) og Cy3-direkte konjugert anti-SMA (1:500 siste fortynning) primære antistoffer og bruk sekundær antibodies direkte konjugert til fluorophores (1:500 siste fortynning) (se Tabell av materialer).
- For klonal analyse, beis lysbilder for kjerner (DAPI, 5 mg/mL) og direkte image andre fluorophores i Rainbow grobunn reporteren (Cerulean: 433-nm eksitasjon max, 475-nm utslipp max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Bilde lysbilder med en oppreist fluorescerende mikroskopet (forstørrelse: 4 X - 20 X) eller AC confocal mikroskop (10 X-63 X). Forstørring, bruke en AC confocal tenkelig 63 x oljeobjektiv med en numerisk blenderåpningen på 1,4-0.6 og en rammestørrelse 1024 x 1024 piksler.
2. Explant embryonale Aorta kultur
Merk: denne tilnærmingen ble tidligere brukt til å vurdere rollen integrin beta3 i stenose i den explanted Eln (- / -) embryonale aorta 9 , 18.
- euthanize en tidsbestemt-gravide dam på E15.5 av overflødig isoflurane innånding, som steg 1.8, ovenfor.
- Harvest og euthanize embryoer, per trinn 1,9-1.10, ovenfor.
- Plasser embryoet supinely og feste utvidet lemmer disseksjon styret. Visualiser med en disseksjon stereoscope og bruk saks til å klippe en loddrett snitt fra magen gjennom sternum til øvre thorax. Dissekere unna thymus, trachea, lunger, spiserøret, liver og tarmen.
- Forsiktig trekke hjertet ventrally ved hjelp av pinsett og bruk saks for å dissekere aorta fra dorsal aspektet av thoracic og abdominal hulrom. For å løslate aorta, kutt den proksimale roten og distale abdominal stillingene.
- Sett aorta i iskalde sterilt PBS i celle kultur hette. Overføre aorta til en 24-vel plate og kultur det i DMEM med 0,5% FBS opptil 24 h på 37 ° C.
Merk: Kultur medium kan suppleres med en blokkering antistoff (f.eks anti-integrin αvβ3 antistoff 0.02 mg/mL 9, se Tabellen for materiale) eller en farmakologisk agent. - Vask aorta to ganger med PBS og deretter fastsette den med 4% paraformaldehyde i 20 min.
- Vask tre ganger med PBS og overføre aorta til en 1.5-mL tube med 30% sukrose i PBS. Etter aorta synker, gjøre frossent blokker, kutt inndelinger og immunostai, som beskrevet i trinn 1.13-1.15, ovenfor.
3. SMC isolasjon fra Perinatal Aorta
Merk: Dette brukes til å sammenligne biologi av aorta SMCs isolert fra Eln (- / -) og wildtype perinatal mus.
- Euthanize en Trouble pup på postnatal dag (P) 0,5 ved cervical forvridning eller ved halshogging med kirurgisk saks eller en skarp kniv, som beskrevet i trinn 1,10, ovenfor.
- Utfører trinn 2.3 og deretter etter åpne thorax og buk, punktering venstre ventrikkel med 23G nål. Bruk plast slangen koble nålen til sterilt PBS inneholder sprøyte holdt vertikalt i en opphøyet posisjon slik at PBS munner venstre ventrikkel av tyngdekraften. La infusjon av sterile PBS i venstre ventrikkel til leveren blanches.
- Bruk tang til å fjerne adventitial vev på utsiden av aorta og dissekere aorta som beskrevet i trinn 2.4.
- Fordøye aorta i én enkelt løsning av DMEM (500 µL) supplert med 225 U/mL collagenase, 2,25 U/mL elastase og 1 x antibiotika-antimycotic for 45 min på 37 ° C. manuelt riste røret hvert 5-10 min.
- i sterilt celle kultur panseret, titurate fordøyd vev av pipettering opp og ned med en 200-µL pipette generere en enkeltcelle suspensjon. Overføre encellede suspensjon til en 15-mL tube legge 2 mL DMEM og sentrifuge 920 x g i 5 min på 25 ° C.
- Kaste nedbryting. Resuspend celle pellet i 3 mL SMC kultur medium (DMEM inneholder 10% FBS supplert med 1 µg/mL rhFGF, 10 µg/mL rhEGF, 100 U/mL penicillin/streptomycin og 2,5 µg/mL amfotericin B). Overføre til en 35 mm kultur plate.
Merk: Ved første isolasjon, ~ 400.000 celler er Hentet fra en enkelt P0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 til disse cellene er SMCs. - Kultur cellene på 37 ° C og endre til frisk SMC kultur medium hver tredje dag. Bruke standard teknikker med trypsin, passasje cellene når confluent. Eksperimenter, bruke celler fra avsnitt 3-7.
4. Subkutan osmotisk mini pumpe plassering i gravid (eller ikke-gravid) mus
Merk: denne tilnærmingen var tidligere pleide kontinuerlig levere en farmakologisk agent (f.eks integrin β3 og β5 inhibitor cilengitide) til embryo i livmoren 9. Pumpen ble satt inn i den gravide demningen på E13.5 og vedlikeholdes til fødsel.
- Bedøve mus med 2-5% isoflurane i oksygen (strømningshastighet på 1 L/min) for induksjon og 1-3% for vedlikehold. Bruk det toe-klype refleks overvåke nivået av anestesi, og justere bedøvende agent etter behov. Administrere subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) for analgesi.
- Barbere korsryggen med avklipt. Bruke sterilt gardiner, hansker og instrumenter og vedlikeholde mus på en kirurgisk varmeplaten under operasjonen.
- Plasserer hver musen i utsatt posisjon og skrubb ryggen med betadine etterfulgt av isopropyl alkohol. Ca 3-5 cm rostral til bunnen av halen i korsryggen, bruke en skalpell for å gjøre en horisontal huden snitt 0,5 - 1.0 cm i lengden uten å skade den underliggende muskelen.
- En hemostat inn i snitt og lage en subcutaneous lomme rostrally for pumpen implantasjon ved åpning og lukking hemostat kjever.
- Fylle en osmotisk mini pumpe med agent valgfrihet, ifølge produsenten ' s retningslinjer (se Tabell for materiale). Sett inn fylt pumpen i lommen og stenger incision med klipp eller 6-0 ikke-absorberbare suturer. Kontroller at kirurgisk totaltiden er mindre enn 10 min.
- Post-operatively, overvåke musene hvert 15 min før de har gjenopprettet fra sternal recumbency. Administrere subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) hver 6-12 h 48 h. Når mus har helt tilbake fra narkose, overvåke dem daglig. Fjerne klipp eller suturer 7-10 dager etter operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en representant klonal analyse av SMCs i embryo mutant for Eln (genet koding ekstracellulær matrix proteiner elastin), Eln(+/-), Acta2-CreER-T2 mus var koblet til Eln(+/-) mus også bærer den multi-farge ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Som beskrevet i trinn 1, plugger ble sjekket, gravid demninger ble indusert med en enkelt tamoxifen injeksjon (1.5 mg) på E12.5, og de ble ofret ved E18.5. Embryo var høstes, fast, frossen og genotyped. Tverrgående synkende aorta cryosections ble kuttet. Inndelinger fra Eln(+/-), Acta2-CreER-T2, ROSA26R(Rb / +) embryo indikerer at overflødig indre laget SMCs som akkumuleres i Eln-null mus (starter etter E15.5) er preget av flere farger ( Figur 1) og derav avlede fra flere alpha-glatt muskel utgangen (SMA)+ celler som finnes på ~ E12.5. I E12.5 aorta er SMA+ celler begrenset til tunika media.
Generere Eln(- / -) embryonale aortas for explants, mannlige og kvinnelige Eln(+/-) mus ble paret. Bruke metodene som er beskrevet i trinn 2, plugger ble sjekket og gravid Eln(+/-) damer ble ofret ved E15.5. Aortas ble isolert fra Eln(- / -) embryo og kultivert for 0 eller 18 h i nærvær av en anti-integrin β3 blokkerer antistoff eller en IgG1-kontroll. Aortas ble deretter fast, frosset, og cryosectioned, og cryosections var farget for SMA (SMC markør), CD31 (endothelial celle markør), og kjerner (DAPI) (figur 2). Resultatene viser at i 18 h dyrking, E15.5/Eln(- / -) aorta blir hypermuscular og stenotic. Denne prosessen er svekket av en anti-integrin β3 blokkerer antistoff.
SMCs ble isolert fra aortabuen wildtype mus på P0.5. Som beskrevet i trinn 3, SMCs ble isolert fra dissekert neonatal aorta av enzymet fordøyelse og var kulturperler. Cellene ble passaged og passering 3 celler var farget for SMC markører (dvs. SMA, glatt muskel myosin tunge kjede (SMMHC) eller transgelin (også kjent som SM22α)), CD31 og kjerner (DAPI) (Figur 3). De fleste av kultivert cellene uttrykke SMC indikatorer men ikke CD31.
For å vurdere infundert om farmakologiske hemming av integrin β3 kan attenuere hypermuscularization og stenose på Eln(- / -) aorta i vivo, vi kontinuerlig hemmer cilengitide på grunn av sine kort halveringstid i plasma. Eln(+/ −) menn og kvinner ble paret, og, som beskrevet i trinn 4, osmotisk mini-pumper lastet med cilengitide ble implantert i gravid demninger på E13.5. Pups var euthanized og genotyped P0.5, og deres aortas ble analysert. Cilengitide behandling betydelig attenuates aortic stenosis og hypermuscularization i Eln(- / -) mus (Figur 4) uten å endre wildtype aorta9. Dermed er anti-integrin β3 en potensielt lovende noninvasive tilnærming til å behandle elastin aortopathy.
Figur 1 . Overflødig SMCs i Eln(- / -) Aorta avledet fra flere eksisterende SMCs. Dammer gravid med Eln(- / -), Acta2-CreER-T2 embryo også bærer multicolor grobunn reporter ROSA26R(Rb / +) ble indusert med en enkelt intraperitoneal injeksjon av tamoxifen (1.5 mg) på E12.5. Dammer ble ofret ved E18.5 og transverse deler av de synkende aortas av embryoene ble analysert, med flekker for DAPI og den direkte fluorescensen Rb farger, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) og mOrange (mOr). Overflødig SMCs akkumuleres i den indre del av Eln-null aorta etter E15.518. De overskytende indre lag SMCs inkluderer celler flere farger (stjerner), som angir polyclonality. Lu, aorta lumen. Skala bar, 10 µm. Reprinted fra Misra et al., 20169. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Anti-αvβ3 Integrin blokaden demper Hypermuscularization og stenose i Eln(- / -) aorta Explant. I E15.5, gravide damer var euthanized og aortas av Eln(- / -) embryo ble høstet. Isolerte aortas er løst umiddelbart eller kultivert i nærvær av en isotype kontroll IgG1 eller et integrin αvβ3 blokkerer antistoff 18 h før fiksering. Fast aortas var farget for CD31, SMA og kjerner (DAPI). Lu, aorta lumen. Skala bar, 100 µm. Reprinted fra Misra et al., 20169. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Isolert og kultivert aorta SMCs fra Neonatal mus Express glatt muskel markører. SMCs ble isolert fra P0.5 pups og var kulturperler. Celler fra tredje passering var fast og farget for CD31 (EC markør), kjerner (DAPI) og en SMC markør (SMA, SM22α, eller SMMHC, som angitt). Denne analysen viser at ~ 90% av kultivert celler uttrykke SMC markører, og ingen ble observert for å uttrykke CD31. Skala bar, 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Kontinuerlig infusjon av Cilengitide i Vivo Attenuates Eln(- / -) aorta Hypermuscularization og stenose. Mannlige og kvinnelige Eln(+/-) mus var korslagt. Integrin β3 hemmer cilengitide eller kjøretøy (PBS) var kontinuerlig fylt i gravid demninger bruker osmotisk mini-pumper starter på E13.5. Tverrgående seksjoner P0.5 var farget for SMA (rød), CD31 (hvit) og kjerner (DAPI, blå). Lu, aorta lumen. Skala bar, 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsetning til omfattende undersøkelser av murine aorta og dens store grener i voksen pathological betingelser, for eksempel modeller av aterosklerose, er mindre kjent om morphogenesis og patogenesen av embryonale og perinatal aorta. Her vi fokusere på embryonale/perinatal aorta, spesielt SMCs, og gi for å studere aorta gjennom i vivo, vev explant, og SMC isolasjon tilnærminger. Disse gratis tilnærminger gir etterforsker med ulike tilnærminger til å studere embryonale/perinatal aorta.
Klonal analyse er en meget kraftig tilnærming som gjør det mulig å undersøke virkemåten til enkeltceller. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen til å identifisere spesialiserte SMCs i lunge blodkar10. Det er viktig å erkjenne at i en enkelt mus bæreveske multi-farge grobunn reporter, det er en sjanse for at celler av samme farge kan ha flere rekombinasjon hendelsen. Dermed nødvendiggjør klonal analyse med multi-farge reporter evalueringen av tallrike mus. Fordi tamoxifen i midten slutten svangerskapsdiabetes perioden kan forstyrre fødsel, for eksperimenter som merke celler i midten slutten svangerskapsdiabetes perioden og spore dem fødselen, skal progesteron og tamoxifen settes inn samtidig. Ligner protokoller i embryo, skjebne kartlegging og klonal analyse av celler i den voksne mus kan foretas med intraperitoneal injeksjon av tamoxifen i voksen.
Klonal analyse og skjebne tilordning av SMCs bruker mus bærer effekter av transgener med uttrykk for grobunn recombinase under kontroll av arrangørene med forbedret aktivitet i den glatte muskulaturen. Her beskriver vi protokoller bruker mus bærer betinget effekter av transgener Myh11-CreER-T2 eller Acta2-CreER-T2. Myh11 er den mest spesifikke SMCs19; Det er imidlertid downregulated i Eln(- / -) aorta9. Acta2 uttrykkes i SMCs, inkludert de av Eln-null aorta, men det er ikke så nøyaktig fordi det er også uttrykt i andre celletyper. Hvis disse betingede effekter av transgener var "lekk" (dvs. indusere rekombinasjon i fravær av tamoxifen), det kan være problematisk da eksperimenter ikke ville avgrense tidspunktet for cellen merkes. Leakiness av disse effekter av transgener ble analysert ved å vurdere beta-galactosidase aktivitet i mus bærer en lacZ-baserte grobunn reporter og Myh11-CreER-T2 eller Acta2-CreER-T2 etter kjøretøy behandling ( dvs, i fravær av tamoxifen induksjon)11,12. Basert på analysen, var disse effekter av transgener anses ikke lekk.
Hypermuscularization karakteriserer flere vaskulær patologi hos mennesker. For eksempel er supravalvular aortic stenosis (SVAS) en ødeleggende congenital tilstand som er preget av hindringen av store og mellomstore arterier på grunn av overflødig SMCs. SVAS resultater fra tap av funksjon av en allelet av ELN genet og forekommer som en isolert enhet eller, mer kjent som del av Williams-Beuren syndrom20,21,22,23,24. ELN(- / -) mutant mus phenocopy mange aspekter av aorta fenotypen SVAS18,21,22. Aorta explants fra Eln(- / -) embryo bli raskt okkludert under kultur, mens explants fra wildtype embryo forblir patent9,18. Aorta explant tilnærming muliggjør screening for agenter som attenuere stenose i elastin aortopathy9. Men tar denne tilnærmingen ikke hensyn til mekaniske eller fysiske krefter som aorta er underlagt i kroppen. Dermed bør positive treff i aorta explant screening vurderes med i vivo Eln mutant musen modeller.
SMC isolasjon protokollen er raske og robuste enmetoden å få SMCs fra perinatal murine aorta. En lignende tilnærming kan ekstrapolert for å isolere SMCs fra voksen mus. På grunn av den relativt store størrelsen, voksen aorta kan åpnes langs og adventitia og endotelceller dissekert bort. For å evaluere renheten av celler isolert fra perinatal eller voksen aorta, er det viktig å kontrollere uttrykket av SMC markører (f.eks SMMHC, smoothelin, SM22α og SMA) og mangel på uttrykk for endothelial celle markører (f.eks CD31 og vaskulær endotelial cadherin). En potensiell alternativ isolasjon tilnærming er å bruke flowcytometri å isolere fluorescently merket SMCs fra dissekert aorta. Mus med et fluorescerende grobunn reporter og Myh11-CreER-T2, Acta2-CreER-T2eller Tgln-grobunn kan brukes til å merke fluorescently SMCs11,12,25, 26,27. Eventuelt kan eksisterende transgene mus med SMA arrangøren kjøring uttrykk for en fluorophore (dvs. GFP, mCherry, eller RFP) brukes28,29,30.
Implantert osmotisk mini-pumper brukes til kontinuerlig levering av farmakologiske agenter til forsøksdyr. Vi har implantert mini-pumper i gravid mus på E13.5 å levere agenter å utvikle embryo resten av svangerskapsdiabetes perioden9. For å nå embryoene, skal slike midler kunne passere blod-placental barrieren. Generelt, mini-pumper er svært godt tolerert, og gitt den lave hastigheten av smitte, anbefales ikke rutinemessig antibiotika. Sår dehiscence er sjelden; men hvis det oppdages en dehiscence større enn 4 mm, musen skal re bedøvet og såret renset og lukket igjen med en kirurgisk Sutur.
Dette verket beskriver en armamentarium av tilnærminger som kan brukes til å studere normal dannelsen av embryonale og perinatal aorta veggen under utvikling, og etter forstyrrelser i denne prosessen under sykdom. Disse protokollene kan i tillegg brukes til å studere vedlikehold og sykdom i voksen aorta. Tilnærminger kan ekstrapolert til andre blodkarene og glatt muskel-belagt ikke-vaskulære strukturer, som fordøyelsessystemet eller lunge luftveiene. Til slutt, lignende teknikker kan brukes å studere celletyper utover SMCs, som endotelceller eller fibroblaster, samt samspillet mellom disse celler typer og SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dean Li for deler hans laboratorium protokoll for aorta SMC isolasjon. Midler støtte ble gitt av National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 og R01HL133016 til D.M.G), American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 til D.M.G.), og Yale University (Brown-Coxe fellesskap til am og oppstart midler til D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
