Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

Published: September 12, 2017 doi: 10.3791/56039
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Summary

بروتوكولات لدراسة الابهر مورين الجنينية والولادة باستخدام الاستنساخ في فيفو تحليل وتعيين مصير و explants الابهري العضلات الملساء المعزولة مفصلة الخلايا هنا. هذه النهوج المختلفة تسهيل التحقيق في morphogenesis الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والتسبب في المرض.

Abstract

الشريان الاورطي هو الشريان الأكبر في الجسم. ويتكون الجدار الابهري طبقة داخلية من خلايا بطانية وطبقة وسطى من التناوب lamellae مطاطا وخلايا العضلات الملساء (سمكس)، وطبقة خارجية الليفية والمصفوفة خارج الخلية. وعلى النقيض من هذه الدراسة على نطاق واسع من النماذج المرضية (مثل تصلب الشرايين) في الشريان الاورطي الكبار، أقل بكثير يعرف عن الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. وهنا، علينا أن نركز على سمكس وتوفر البروتوكولات لتحليل morphogenesis والمرضية سمكس الابهري الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والمرض. على وجه التحديد، البروتوكولات الأربعة المدرجة: أنا) في فيفو مصير الجنينية رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ؛ الثاني) الثقافة الشريان الاورطي الجنينية explant؛ ثالثا) SMC في معزل عن الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة؛ ورابعاً) وضع مضخة صغيرة ناضح تحت الجلد في الفئران الحوامل (أو غير حامل). وهكذا، هذه النهج تيسير التحقيق origin(s) ومصير، والاستنساخ بنية سمكس في الشريان الاورطي في فيفو. أنها تسمح لتحوير الشريان الاورطي الجنينية morphogenesis في الرحم بالتعرض المستمر لوكلاء الدوائية. وباﻹضافة إلى ذلك، explants الأنسجة الابهر معزولة أو سمكس الابهري يمكن استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة دور الجينات محددة الأهداف خلال العمليات الأساسية مثل موسكولاريزيشن، والانتشار، والهجرة. ثم يمكن تقييم هذه التجارب المدرة لفرضية سمكس معزولة والشريان الاورطي اكسبلانتيد في السياق في فيفو من خلال نهج الدوائي والوراثية.

Introduction

نظم الدورة الدموية في الكائنات الحية متعددة الخلايا الدالة توصيل المواد الغذائية والأكسجين إلى الخلايا التي ليست على اتصال بالبيئة الخارجية، وإزالة الفضلات وثاني أكسيد الكربون من هذه الخلايا. في الفقاريات، يتكون نظام الدورة الدموية الأولية من القلب، وهي مضخات الدم من خلال سلسلة من الأوعية الدموية. جدران الأوعية الدموية الكبيرة، مثل الشرايين والاوردة، وتتألف من ثلاث طبقات: أنا) البطانية، أو الطبقة الداخلية من خلايا بطانية؛ ثانيا) وسائل الإعلام، أو طبقة وسطى من التناوب circumferentially ممدود خلايا العضلات الملساء سمكس ومطاطا lamellae؛ وثالثاً) الغلالة، أو الطبقة الخارجية من النسيج الضام والليفية. الغالبية العظمى من الدراسات في علم الأحياء والأوعية الدموية تركز على خلايا بطانية، التحقيق في تشكيل أنابيب مبطنة خلية بطانية جديدة عن طريق الأوعية. وفي المقابل، تلقي سمكس اهتماما ضئيلا نسبيا. ومع ذلك، يتم سمكس نوع خلية حاسمة في بناء الجدار الشرياني طبيعي وأمراض الأوعية الدموية.

الشريان الاورطي هو الشريان عيار أكبر في الجسم، وتلقى إخراج القلب من البطين الأيسر للقلب. هي تعاني من الأمراض البشرية المتنوعة، بما في ذلك تصلب الشرايين والأوعية الدموية، والتشريح. في الكائنات الحية الكبار، الشريان الاورطي وفروعه الرئيسية درس مكثف في نماذج أمراض الأوعية الدموية. على سبيل المثال، وضع حمية الدهون عالية تغذية الفئران التي تعتبر لاغية للجينات ترميز مستقبلات low-density lipoprotein أو الابوليبوبروتين ه، تصلب الشرايين، ومصير الأخيرة رسم خرائط الدراسات تشير إلى أن تثير سمكس موجودة مسبقاً إلى أنواع متعددة من الخلايا في لوحة تصلب الشرايين1. وتشمل التغييرات المرضية في تمدد الأوعية الدموية الابهري، المبرمج SMC والمصفوفة خارج الخلية إعادة عرض2،3.

من المعروف أقل بكثير فيما يتعلق بتصريح خاص morphogenesis والمرضية أثناء فترات الولادة والجنينية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات لدراسة الجنينية والولادة الابهري سمكس في فيفو، في explants الأنسجة والخلايا المعزولة. على سبيل المثال، القسم الأول من البروتوكول يحدد مصير رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ في الفئران الجنينية. Recombinase Cre أعرب تحت سيطرة أحد المروجين خلية محددة يسهل تمييز خلايا معينة وعلى ذرية4،،من56؛ مع ذلك، يمكن التحكم الزمني لوضع العلامات الخاصة بالخلية الصعبة خلال التطور الجنيني في الفئران. وفي هذا السياق، مع الأجنة معربا عن كرير الشرطي تحت مروج نشط في سمكس (e.g.,Myh11 أو Acta2)، وهو مراسل لجنة المساواة العرقية، نحن توفير أساليب للحقن تاموكسيفين أو في المستقلب النشط 4-OH-التاموكسيفين في السدود الحوامل ومن أجل تحليل الخلايا المسماة في الأجنة أو ذرية بعد الولادة. وعلاوة على ذلك، خلافا لمصير دراسات رسم الخرائط، التي يغلب عليها الطابع الاستفادة من الصحفيين لجنة المساواة العرقية مع مراسل واحد فلوروفوري1،7، إلى حد كبير هو تعزيز تحليل الاستنساخ مع الصحفيين Cre متعدد الألوان.

تصف الأجزاء الثانية والثالثة من البروتوكول الأساليب لعزل واستزراع explants الابهري الجنينية وسمكس الابهري من حديثي الولادة، على التوالي. تسمح هذه النهج للتلاعب بمسارات الإشارات، على وجه التحديد في الابهر explants أو سمكس، وتحليل الآثار المباشرة لوكلاء الدوائية. وهكذا، يمكن فحص دور جينات محددة في النسيج للفائدة بطريقة سريعة أكثر بكثير مما عن طريق التلاعب الوراثية التقليدية في الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات SMC معزولة تيسير تحليل الهجرة الخلية والالتصاق، ومن الناحية الفنية محدودة فيفو.

وأخيراً، يحدد القسم البروتوكول الرابع وضع مضخة صغيرة تحت الجلد ناضح محملة بوكلاء الدوائية في الفئران الحوامل (أو غير حامل). ويسهل هذا الأسلوب تحليل الأثر على التنمية الجنينية الناجمة عن العوامل التي تتطلب التسريب المستمر بسبب التمثيل الغذائي السريع. والبديل للحقن المتكرر ليس عمليا بالنسبة للعديد من العوامل وينبغي تجنبها، كما أنه قد يسبب مشقة كبيرة في السد حامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع البروتوكولات الماوس تقرها لجنة الاستخدام في جامعة ييل ورعاية الحيوان المؤسسية.

1. تعيين مصير الجنينية في فيفو وتحليل الاستنساخ

ملاحظة: أننا استخدمنا هذه النهج على نطاق واسع لتقييم أصول الخلايا وعلى بنية الاستنساخ في نماذج التنمية والمرض 7 ، 8 ، 9 ، 10-

  1. إعداد التزاوج بين الفئران مع كرير والفئران مع مراسل Cre.
    ملاحظة: يتم استخدام كرير ل SMC الوسم؛ Myh11-CreERT2 أو Acta2-CreERT2 الفئران 11 ، 12 يستخدم عادة لهذا الغرض. وقد استخدمنا ROSA26R-CreERT2 الفئران 13 لوضع علامات على نطاق واسع على الأنسجة الجنينية.
    1. لتحليل الاستنساخ، استخدام متعدد ألوان Cre مراسل (مثلاً، قصاصات من الورق أو الفئران قوس قزح [م ع]) 8 ، ، من 14 15 ومصير رسم الخرائط، استخدام لون واحد مراسل لجنة المساواة العرقية (مثلاً، ROSA26R-يفب الفئران 16) أو المراسل Cre لون مزدوج ROSA26R-متوماتو-مجفب (متمج) 17-
      ملاحظة: يستخدم هذا المخطط تربية الفئران الكبار 2-6 أشهر من العمر (عادة ز ~ 30) وسوف تولد الأجنة مع كرير ومراسل Cre.
  2. التحقق من المقابس المهبلي في الصباح باستخدام معدن التحقيق والنظر بعد ظهر اليوم للكشف عن التوصيل كيوم الجنينية (ه) 0.5-
  3. فصل الإناث عن الذكور عند الكشف عن المكونات.
  4. تحضير 4-OH-تاموكسيفين وحلول العامل تاموكسيفين.
    1. على 4-OH-تاموكسيفين، يذوب 5 ملغ في 50 ميليلتر من 100% إيثانول، دوامة لمدة 2 دقيقة ثم قم بإضافة 450 ميليلتر من زيت الذرة. على الجليد، sonicate على مستوى الإخراج 2 لعشر دورات s مع الراحة بين الدورات حتى يبرد عينة. بعد أن عينة هو حل تماما (عادة ~ 4-5 دورات سونيكيشن) وتأخذ 200 ميليلتر لحل سونيكاتيد وتذوب في 1,800 ميليلتر من زيت الذرة لجعل الحل العامل النهائي (4-OH-تاموكسيفين، 1 ملغ/مل).
    2. على تاموكسيفين، تضعف إلى 50 ملغ/مل في الإيثانول 100% ودوامه حتى أنه يذوب. مخفف بزيت الذرة لجعل الحل العامل النهائي (تاموكسيفين، 10 ملغ/مل) وآثاره عند 45 درجة مئوية لضمان أن يتم حله تماما.
  5. لتحريض الجنينية المبكرة، حقن 4-OH-تاموكسيفين إينترابيريتونيلي في سد حوامل.
    1. استخدام حقن 4-OH-تاموكسيفين (يصل إلى 150 ~ ميكروغرام كل الحوامل الماوس، أو تقريبا 5 مغ/كغ وزن الجسم) في E5.5 وما بعدها كما أنها تسفر عن السد قابلة للحياة والأجنة الجراء.
    2. استخدام تاموكسيفين في جرعات 0.5-1.5 ملغ (أو 17-50 مغ/كغ) للحوامل مع الأجنة في السدود ~ E9 وما بعدها. استخدام إبرة ز 30 لحقن كل.
      ملاحظة: يستخدم الترشيح من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر عادة لتعقيم جميع المخاليط قبل الحقن.
  6. لتحليل الاستنساخ، استخدام الحقن داخل لجرعات عالية من 4-OH-تاموكسيفين (مثلاً، 5 مغ/كغ) أو تاموكسيفين (مثلاً، 50 مغ/كغ) وضع علامة على خلايا متعددة.
    1. لتمييز الخلايا الفردية، تيتراتي إلى أسفل جرعة 4-OH-تاموكسيفين أو تاموكسيفين بحيث أنه في النسيج للفائدة (أي الشريان الاورطي)، تقريبا جميع أجنة حلل (كما هو موضح أدناه في نهاية هذا القسم) لا الخلايا المسماة أو الخلايا فقط من لون واحد؛ هذا هو جرعة العتبة.
  7. لتمييز الخلايا في فترة منتصف أواخر الحمل وتتبع مصير أو كلوناليتي في الماوس بعد الولادة، وحقن البروجسترون داخل تجويف السد حامل متزامنا مع تاموكسيفين في 1:2 (البروجسترون: تاموكسيفين) نسبة الجرعة.
    ملاحظة: جرعة تاموكسيفين 17-50 مغ/كغ وجرعات البروجسترون 8.5-25 مغ/كغ (أي نصف جرعة تاموكسيفين). حقن البروجسترون قد يؤدي إلى تأخير العمل بأيام ~ 1-2-
  8. يوثانيزي السد الحوامل بأجنة السن المطلوب باستخدام أسلوب إسقاط مفتوحة، حيث يتم وضع السد في وعاء يحتوي على القطن أو الشاش غارقة مع إيسوفلوراني غير مخفف. تأكيد الوفاة عن طريق فتح تجويف الصدر للحث على استرواح الصدر، بإزالة الأعضاء الحيوية، و/أو عن طريق إجراء خلع عنق الرحم.
  9. تطهير البطن مع الإيثانول 70%. استخدام مقص لقص فتح البطن وتشريح خارج الرحم. إزالة الأجنة من الرحم وفصل الأجنة بعناية من المشيمة وكيس ألمح باستخدام الملقط.
  10. Euthanize الأجنة في E15 أو كبار السن عن طريق إجراء أما التفكك عنق الرحم أو قطع الرأس بالمقص الجراحي أو شفرة حادة.
    ملاحظة: أجنة أصغر سنا من E15 يموت سريعاً في أعقاب القتل الرحيم الأم و/أو إزالة الأجنة من الأم.
  11. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني المثلج وقطع قطعة صغيرة من الذيل باستخدام مقص للنمط الوراثي للمراسل كرير ولجنة المساواة العرقية.
  12. إصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4% في 4 درجات مئوية عن 2 حاء يغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان ثم الأجنة في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني في أنابيب 15 مل، الانتظار حتى أنها تغرق، الذي قد يستغرق مدة تصل إلى يومين.
    13. قوالب البلاستيك تعبئة
  13. التجميد تصل إلى 2/3 من الحد الأقصى لمستوى درجة الحرارة المثلى قطع (OCT) مجمع. ضع كل الجنين عمودياً في القالب، مغمورة تماما في أكتوبر الماضي إينكوباتي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتقليل فقاعات.
  14. مكان تجميد كتل الأنسجة تستقيم في ثلج الجاف، حمام الإيثانول 70% تجميد. تخزين الكتل في-80 درجة مئوية.
  15. تعيين درجة الحرارة كريوستات-22 درجة مئوية وقص كتل لإنشاء مقاطع عرضية عن طريق الشريان الاورطي كامل، 10-20 ميكرومتر سميكة. الجاف للشرائح على RT لمدة 30 دقيقة قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
  16. ذوبان الشرائح في الرايت، محمية من الضوء لتجنب وتبيض من فلوروفوريس. يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني-Tween20 0.1%.
    1. لتحليل الاستنساخ، وصمة عار الشرائح لنوى (DAPI، 5 ملغ/مل) وصورة مباشرة أخرى فلوروفوريس في المراسل Cre قوس قزح (أزرق: الإثارة 433-نيوتن متر كحد أقصى، وشمال البحر الأبيض المتوسط-475 الانبعاثات ماكس؛ mOrange: 548 نانومتر، 562 نانومتر؛ متشيري: 587 نانومتر، 610 نيوتن متر).
      1. استخدام المرشحات التالية للكشف عن فلوروفوريس مع مجهر فلوري تستقيم: DAPI (الإثارة ماكس/عرض النطاق الترددي 350/50 نانومتر، nm الانبعاثات ماكس/عرض النطاق الترددي 460/50)، وأزرق (الإثارة 436/20 نانومتر، nm الانبعاثات 480/40)، ولاية تكساس الأحمر (الإثارة 560/ 40 نانومتر، nm الانبعاثات 630/75) وعامل تصفية مخصص لفصل متشيري عن مورانجي (الإثارة 577/10 نانومتر، الانبعاثات 630/50 nm).
    2. لمصير رسم الخرائط مع المراسل Cre متمج، الكشف عن التجارة والنقل (484 نانومتر، 510 نيوتن متر)، أما عن طريق التصوير مباشرة أو باستخدام إيمونوستاينينج. للتصوير مع مجهر فلوري تستقيم استخدام عامل تصفية التجارة والنقل (الإثارة 470/40 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاث 525/50 نانومتر).
    3. إيمونوستينينج، احتضان الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وتغسل مع 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني واحتضان ثم مع الأجسام المضادة الثانوية حاء 1 استخدام مكافحة--CD31 (التركيز النهائي 0.0016 مغ/مل)، مكافحة-التجارة والنقل (0.006 ملغ/مل) و Cy3--مباشرة مترافق مكافحة-SMA (تمييع النهائي 1: 500) الابتدائي الأجسام المضادة واستخدام أنتيبودي الثانويةs مترافق مباشرة إلى فلوروفوريس (1: 500 تمييع النهائي) (انظر الجدول للمواد)-
  17. صورة الشرائح مع مجهر فلوري تستقيم (التكبير: 4 X-20 X) أو [كنفوكل] مجهر (10 X-63 X). للتكبير عالية، استخدام 63 تصوير [كنفوكل] × الهدف النفط مع فتحه عددية من 1.4-0.6 وحجم إطار بكسل 1,024 x 1,024-

2. Explant "الجنينية الشريان الاورطي الثقافة"

ملاحظة: هذا النهج كان يستخدم لتقييم دور beta3 إنتغرين في تضيق اكسبلانتيد جيش التحرير الوطني (-/-) الشريان الاورطي الجنينية 9 ، 18-

  1. euthanize سد في الوقت المناسب-حوامل في E15.5 باستنشاق isoflurane الزائدة، وفقا للخطوة 1.8، أعلاه.
  2. الحصاد و euthanize الأجنة، وفقا للخطوات 1-1، 9-10، أعلاه.
  3. وضع الجنين سوبينيلي ويعلقون أطرافه الموسعة للمجلس التشريح. تصور مع ستيريوسكوبي تشريح واستخدام مقص لقص شق عمودي من البطن عن طريق القص بالصدر العلوي. تشريح بعيداً الغدة الصعترية، القصبة الهوائية والرئتين والمريء، والكبد والأمعاء.
  4. بلطف سحب قلب بطنيا باستخدام الملقط واستخدام مقص تشريح الشريان الاورطي بعيداً عن الجانب الظهرية في تجاويف الصدر والبطن. لإطلاق سراح الشريان الاورطي، قطع عليه في جذر الدانية والبعيدة ومواقف البطن.
  5. مكان الشريان الاورطي في المثلج PBS العقيمة في غطاء ثقافة خلية. نقل الشريان الاورطي إلى لوحة 24-جيدا والثقافة في دميم مع 0.5% FBS لمدة تصل إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تكميل المتوسط الثقافة مع جسم حظر (مثلاً، مكافحة إنتغرين αvβ3 جسم في 0.02 مغ/مل 9؛ انظر الجدول للمواد) أو عامل الدوائي.
  6. أغسل الشريان الاورطي مرتين مع برنامج تلفزيوني ومن ثم إصلاحها مع بارافورمالدهيد 4% عن 20 دقيقة
  7. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونقل الشريان الاورطي إلى أنبوب 1.5 مل مع 30% السكروز في برنامج تلفزيوني. بعد المصارف الشريان الاورطي، جعل كتل الأنسجة المجمدة وقطع المقاطع وإيمونوستاين، كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 13-15، أعلاه.

3. SMC في معزل عن "الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة"

ملاحظة: هذا النهج يستخدم حاليا لمقارنة بيولوجيا سمكس الابهر معزولة من جيش التحرير الوطني (--/--) و wildtype الفئران فترة ما حول الولادة-

  1. يوثانيزي الفاري ألجرو في يوم ما بعد الولادة (ف) 0.5، أما بخلع عنق الرحم أو بقطع الرأس بالمقص الجراحي أو شفرة حادة، كما هو موضح في الخطوة 1، 10، أعلاه.
    2. نفذ الخطوة 2، 3
  2. وبعد ذلك، بعد فتح الصدر والبطن، ثقب البطين الأيسر مع إبرة ز 23. استخدام أنابيب بلاستيكية للاتصال الإبرة المحاقن المعقمة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني عقد عمودياً في وضع مرتفعة حيث أن برنامج تلفزيوني يتدفق في البطين الأيسر بالجاذبية. تسمح ضخ PBS العقيمة في البطين الأيسر حتى بلانتشيس الكبد.
    1. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة أدفينتيتيال في الخارج من الشريان الاورطي وتشريح الشريان الاورطي كما هو موضح في الخطوة 2، 4-
  3. هضم الشريان الاورطي في حل واحد من دميم (500 ميليلتر) تستكمل مع 225 يو/مليلتر كولاجيناز و 2.25 يو/مليلتر elastase مضاد حيوي فطري لمدة 45 دقيقة في 37 درجة "جيم يدوياً" يهز 1 x الأنبوب كل دقيقة 5-10
  4. في الخلية العقيمة الثقافة هود، تيتوراتي الأنسجة هضمها من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة 200 ميليلتر لتوليد تعليق خلية واحدة. نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 مل، وإضافة 2 مل دميم، والطرد المركزي في ز 920 x لمدة 5 دقائق في 25 درجة مئوية.
  5. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من SMC الثقافة المتوسطة (التي تحتوي على 10% FBS وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل رهيجف والبنسلين يو/مليلتر 100/ستربتوميسين، رهفجف 1 ميكروغرام/مل و 2.5 ميكروغرام/مل الامفوتريسين بدميم). نقل إلى لوحة ثقافة 35 ملم.
    ملاحظة: عند عزل الأولية، ~ 400,000 الخلايا يتم الحصول عليها من الابهر wildtype P0.5 واحد؛ ~ 300,000 من هذه الخلايا هي سمكس.
  6. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية وتغيير إلى متوسط الثقافة SMC جديدة كل 3 أيام. استخدام التقنيات القياسية مع التربسين، مرور الخلايا عندما المتلاقية. للتجارب، واستخدام خلايا من مقاطع من 3-7-

4. تحت الجلد ناضح مضخات صغيرة "الإيداع" في الحوامل (أو عدم الحوامل) الفئران

ملاحظة: هذا النهج كان يستخدم باستمرار تقديم عامل دوائية (مثل إنتغرين β3 و β5 المانع سيلينجيتيدي) للأجنة في الرحم 9. المضخة كان إدراجها في السد حامل في E13.5 وتحتفظ حتى الولادة.

  1. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-5 ٪ في الأكسجين (معدل التدفق من 1 لتر في الدقيقة) للاستقراء و 1-3% للصيانة. استخدم منعكس تو-قرصه لرصد مستوى التخدير، وضبط عامل مخدر حسب الحاجة. إدارة البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ) لتسكين.
  2. يحلق في أسفل الظهر مع لوس أنجليس كليبرز. استخدام الستائر العقيمة، والقفازات، والصكوك، والحفاظ على الفئران على لوحة تدفئة جراحية خلال عملية جراحية-
    3. ضع كل الماوس في موقف المعرضة
  3. وفرك ظهره مع تدين تليها كحول الأيزوبروبيل. حوالي 3-5 سم روسترال إلى قاعدة الذيل في أسفل الظهر، واستخدم مشرط جعل شق جلد أفقي 0.5-1.0 سم في الطول دون إصابة العضلات الأساسية-
  4. إدراج هيموستات في الشق وإنشاء جيب تحت الجلد روسترالي لغرس مضخة بفتح وإغلاق الفكين هيموستات.
  5. ملء مضخة صغيرة ناضح بعامل الاختيار، وفقا للشركة المصنعة ' s المبادئ التوجيهية (انظر الجدول للمواد). إدراج المضخة شغلها في الجيب وإغلاق الشق مع مقاطع أو خيوط غير الامتصاص 6-0. التأكد من أن الوقت الجراحي الكلي أقل من 10 دقيقة
  6. ، قد رصد الفئران كل 15 دقيقة حتى أنهم استعادوا من ريكومبينسي القصية. إدارة البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ) كل 6-12 ساعة في حالة ح 48. عند الفئران شفوا تماما من التخدير العام، رصد منها يوميا. إزالة القصاصات أو خيوط الجراحة بعد 7-10 أيام-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تحليل الاستنساخ ممثل سمكس في المسخ الأجنة جيش التحرير الوطني (الجينات ترميز الايلاستين البروتين المصفوفة خارج الخلية)، جيش التحرير الوطني(+/-)، Acta2-كريرT2 الفئران كانت تزاوج للفئران جيش التحرير الوطني(+/-) يحمل أيضا متعدد الألوان ROSA26R(Rb/Rb) المراسل. كما هو موضح في الخطوة 1، تم التحقق من المقابس والسدود الحوامل كانت المستحث بحقنه واحدة تاموكسيفين (1.5 ملغ) في E12.5، وأنهم قد ضحى بها في E18.5. وكانت الأجنة المقطوع والثابتة، والمجمدة، وجينوتيبيد. تم قطع عرضية كريوسيكتيونس الابهر تنازلي. أقسام من جيش التحرير الوطني(+/-)، Acta2-كريرT2، ROSA26R(Rb/+) الأجنة تشير إلى أن الطبقة الداخلية سمكس الزائدة التي تتراكم في جيش التحرير الوطني-تميزت الفئران فارغة (ابتداء من بعد E15.5) متعددة الألوان ( الشكل 1) ومن هنا تنبع من أكتين العضلات الملساء ألفا متعددة (SMA)+ الخلايا الموجودة في ~ E12.5. في الشريان الاورطي E12.5، SMA+ الخلايا تقتصر على وسائل الإعلام الغلالة.

لإنشاء جيش التحرير الوطني(-/-) أورتاس الجنينية اكسبلانتس، والذكور والإناث وقد تزاوج الفئران جيش التحرير الوطني(+/-) . باستخدام الأساليب الموضحة في الخطوة 2، تم التحقق من المقابس والحوامل جيش التحرير الوطني(+/-) سدا تم التضحية بها في E15.5. تم عزل من الأجنة جيش التحرير الوطني(-/-) أورتاس ومثقف 0 أو ح 18 حضور β3 إنتغرين المضادة حجب جسم أو عنصر تحكم IgG1. ثم الثابتة أورتاس، المجمدة، وكريوسيكتيونيد، وكريوسيكشنز الملون ل SMA (SMC العلامة)، CD31 (علامة غشائي خلية)، ونوى (DAPI) (الشكل 2). تظهر النتائج أن الشريان الاورطي E15.5 جيش التحرير الوطني(-/-) يصبح ضمن ح 18 من استزراع، هايبرموسكولار وضيق. هذه العملية هو يخفف بجسم حظر β3 إنتغرين المضادة.

سمكس كانت معزولة من الشريان الاورطي الفئران wildtype في P0.5. كما هو موضح في الخطوة 3، سمكس كانت معزولة من تشريح الشريان الاورطي الولدان بإنزيم الهضم ومثقف. كانت باساجيد الخلايا، والخلايا مرور 3 كانت الملون لعلامات SMC (أي، SMA أو العضلات الملساء الميوسين الثقيلة سلسلة (سمك) أو ترانسجيلين (المعروفة أيضا باسم SM22α))، CD31، ونوى (DAPI) (الشكل 3). معظم الخلايا المستزرعة التعبير عن علامات SMC ولكن لا CD31.

لتقييم ما إذا كان يمكن التخفيف من تثبيط الدوائي من β3 إنتغرين هايبرموسكولاريزيشن وتضيق من جيش التحرير الوطني(-/-) الشريان الاورطي في فيفو، نحن باستمرار غرست سيلينجيتيدي المانع بسبب عمرها النصفي قصيرة في البلازما. جيش التحرير الوطني(+ −) تم تزاوج الذكور والإناث، وكما هو موضح في الخطوة 4، ناضح مضخات صغيرة محملة سيلينجيتيدي تم زرعها في السدود الحامل في E13.5. في P0.5، الجراء euthanized وجينوتيبيد، وحللت بها أورتاس. العلاج سيلينجيتيدي يخفف إلى حد كبير تضيق الابهر وهايبرموسكولاريزيشن في الفئران جيش التحرير الوطني(--/--) (الشكل 4) دون تغيير الشريان الاورطي wildtype9. وهكذا، β3 إنتغرين المضادة اتباع نهج موسع يحتمل أن تكون واعدة لعلاج أورتوباثي الايلاستين.

Figure 1
الشكل 1 . سمكس الزائدة في الشريان الاورطي جيش التحرير الوطني(-/-) مستمدة من عدة سمكس الموجودة من قبل. السدود الحوامل مع جيش التحرير الوطني(-/-)، Acta2-كريرT2 الأجنة يحمل أيضا مراسل Cre متعدد الألوان ROSA26R(Rb/+) كانت المستحث بحقنه داخل واحدة من تاموكسيفين (1.5 ملغ) في E12.5. تم التضحية بالسدود في E18.5، وحللت مقاطع عرضية من أورتاس التنازلي للأجنة، مع تلطيخ DAPI والأسفار المباشر للألوان Rb، أزرق (Cer)، مشري (صحة الأم والطفل) ومورانج (مور). سمكس الزائدة تتراكم في الجانب الداخلي من جيش التحرير الوطني-الشريان الاورطي فارغة بعد E15.518. سمكس الطبقة الداخلية الزائدة تشمل خلايا متعددة الألوان (النجمة)، مما يشير إلى بوليكلوناليتي. لو، التجويف الابهري. مقياس بار، 10 ميكرون. ريبرينتيد من ميسرا et al.,9من عام 2016. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . يخفف الحصار إنتغرين المضادة-αvβ3 هايبرموسكولاريزيشن وتضيق من Explant الابهري جيش التحرير الوطني(-/-) . في E15.5، كانت euthanized السدود الحوامل وكانت تحصد أورتاس الأجنة جيش التحرير الوطني(-/-) . أورتاس معزولة تم إصلاحها فورا أو مثقف حضور عنصر تحكم ايستب IgG1 أو αvβ3 إنتغرين جسم حظر ح 18 قبل التثبيت. كانت ملطخة أورتاس الثابتة ل CD31، والسويدية، ونوى (DAPI). لو، التجويف الابهري. مقياس بار، 100 ميكرومتر. ريبرينتيد من ميسرا et al.,9من عام 2016. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . معزولة ومثقف سمكس الابهري من الفئران حديثي الولادة علامات التعبير عن العضلات الملساء. سمكس كانت معزولة من الجراء P0.5 ومثقف. خلايا من سن الثالثة كانت ثابتة والملون ل CD31 (EC العلامة)، نوى (DAPI)، وعلامة SMC (SMA، SM22α، أو سمك، وكما هو مبين). هذا التحليل يشير إلى أن ~ 90% الخلايا المستزرعة عن علامات SMC، ولم يلاحظ أي للتعبير عن CD31. مقياس بار، 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . يخفف التسريب المستمر من سيلينجيتيدي في فيفو هايبرموسكولاريزيشن الابهري جيش التحرير الوطني(--/--) وتضيق. الذكور والإناث وقد عبرت الفئران جيش التحرير الوطني(+/-) . كان غرست إنتغرين β3 مثبط سيلينجيتيدي أو مركبة (PBS) باستمرار في السدود الحامل استخدام ناضح ميني-مضخات بدءاً من E13.5. مقاطع عرضية في P0.5 كانت ملطخة SMA (أحمر)، CD31 (أبيض)، ونوى (DAPI، الأزرق). لو، التجويف الابهري. مقياس بار، 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على النقيض من تحقيقات واسعة النطاق في الشريان الاورطي موريني وفروعها الرئيسية في الحالات المرضية الكبار، مثل نماذج من تصلب الشرايين، المعروف أقل فيما يتعلق morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. هنا، علينا التركيز على الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة، على وجه التحديد سمكس، وتوفير بروتوكولات لدراسة الشريان الاورطي من خلال في فيفو، explant الأنسجة، ونهج العزلة SMC. وتوفر هذه النهج مجانية المحقق بمختلف النهج لدراسة الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة.

تحليل الاستنساخ هو نهج قوية جداً أن يسمح أحد للتحقيق في سلوك الخلايا الفردية. أننا استخدمت مؤخرا هذا النهج للمساعدة في تحديد سمكس المتخصصة في المفرج الرئوية10. من المهم الاعتراف بأن في ماوس فردية تحمل مراسل Cre متعدد ألوان، هناك فرصة لأن خلايا من نفس اللون يمكن أن تستمد من الحدث جزئ واحد أو أكثر. وبالتالي، يقتضي تحليل الاستنساخ مع مراسل متعدد ألوان تقييم العديد من الفئران. لأنه يمكن أن تتداخل تاموكسيفين في فترة منتصف أواخر الحمل مع الولادة، للتجارب التي تمييز الخلايا في فترة منتصف أواخر الحمل وتتبع لهم وأرزان ارتباط المستقبلات، ينبغي أن يكون حقن البروجسترون وتاموكسيفين في الوقت ذاته. مشابهة للبروتوكولات في الجنين، مصير رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ من خلايا في الماوس الكبار يمكن الاضطلاع بالحقن داخل تاموكسيفين في الكبار.

خرائط التحليل ومصير الاستنساخ سمكس يستخدم الفئران تحمل المتسلسلات بالتعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة المروجين مع تعزيز النشاط في العضلات الملساء. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات استخدام الفئران تحمل المتسلسلات الشرطي Myh11-كريرT2 أو Acta2-كريرT2. Myh11 هو العلامة الأكثر تحديداً سمكس19؛ ومع ذلك، فمن دوونريجولاتيد في الشريان الاورطي جيش التحرير الوطني(-/-) 9. وأعرب عن Acta2 في سمكس، بما في ذلك جيش التحرير الوطني-الشريان الاورطي فارغة، ولكن لأنه ليس محدداً فهو وارد أيضا في أنواع الخلايا الأخرى. إذا كانت هذه المتسلسلات الشرطي "راشح" (أي، الحث على جزئ في الغياب من تاموكسيفن)، وقد يكون إشكالياً، كما التجارب أن لم تحدد توقيت وسم الخلية. وقد تم تحليل يجتازها من هذه المتسلسلات بتقييم نشاط بيتا-جالاكتوسيداسي في الفئران التي تحمل لاكز المستندة إلى مراسل لجنة المساواة العرقية وأما Myh11-كريرT2 أو Acta2-كريرT2 بعد العلاج المركبة ( أي، في غياب التعريفي تاموكسيفين)11،12. وبناء على هذا التحليل، هذه المتسلسلات اعتبرت لا راشح.

وتميز هايبرموسكولاريزيشن متعددة من أمراض الأوعية الدموية في البشر. على سبيل المثال، سوبرافالفولار تضيق الابهر (سفاس) هو شرط خلقية مدمرة التي تتميز بانسداد الشرايين الكبيرة والمتوسطة الحجم بسبب نتائج سمكس. سفاس الزائدة من فقدان وظيفة اليل واحد من الجينات جيش التحرير الوطني ويحدث ككيان معزولة، أو أكثر شيوعاً، كجزء من بورن ويليامز متلازمة20،21،22،،من2324. فينوكوبي الفئران متحولة جيش التحرير الوطني(-/-) جوانب كثيرة من النمط الظاهري الابهري سفاس18،،من21إلى22. أصبحت تغطي explants الابهري من الأجنة جيش التحرير الوطني(-/-) سريعاً خلال الثقافة، بينما تظل explants من الأجنة wildtype البراءات9،18. أن النهج explant الابهري يسهل الكشف عن العوامل التي تخفف من تضيق في الايلاستين أورتوباثي9. غير أن هذا النهج لا تراعي قوي ميكانيكية أو مادية هو الشريان الاورطي رهنا لحين في الجسم. وهكذا، ينبغي تقييم الزيارات إيجابية في فحص explant الابهر مع نماذج الماوس متحولة المجراة في جيش التحرير الوطني .

البروتوكول العزلة SMC طريقة سريعة وقوية للحصول على سمكس من الشريان الاورطي مورين الفترة المحيطة بالولادة. ويمكن استقراء نهجاً مماثلاً لعزل سمكس من الفئران الكبار. بسبب حجمه الكبير نسبيا، يمكن فتح الشريان الاورطي الكبار طوليا والغلالة وخلايا بطانية تشريح بعيداً. تقييم نقاء الخلايا المعزولة من الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة أو الكبار، من المهم أن تحقق للتعبير عن علامات SMC (مثلاً، سمك، سموثيلين، SM22α، و SMA) وعدم التعبير عن علامات خلية غشائي (مثلاً، CD31 والأوعية الدموية غشائي كادهيرين). احتمال نهج العزلة البديل استخدام التدفق الخلوي لعزل فلوريسسينتلي المسمى سمكس من تشريح الشريان الاورطي. يمكن استخدام الفئران تحمل الفلورسنت Cre مراسل و Myh11-كريرT2، Acta2-كريرT2أو تجلن-لجنة المساواة العرقية لتسمية سمكس11،12،25، فلوريسسينتلي ،من 2627. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الفئران المعدلة وراثيا الموجودة مع المروج SMA يقود التعبير عن فلوروفوري (أي التجارة والنقل، مشري، أو طلب تقديم العروض) تستخدم28،،من2930.

ميني ناضح مزروع-مضخات تستخدم لتقديم وكلاء الدوائي المستمر للحيوانات المختبرية. ونحن قد زرعها ميني-مضخات في الفئران الحوامل في E13.5 لتقديم وكلاء لتطوير الأجنة خلال بقية فترة الحمل9. للوصول إلى الأجنة، يجب أن تكون هذه العوامل قادرة على اجتياز حاجز المشيمة الدم. وبصفة عامة، جيد جداً يسمح بمضخات مصغرة، ونظرا لانخفاض معدل الإصابة، لا يوصي بالمضادات الحيوية الروتينية. نادر dehiscence الجرح؛ ومع ذلك، إذا تم الكشف عن ديهيسسينسي أكبر من 4 مم، الماوس ينبغي إعادة أنيسثيتيزيد والجرح تنظيفها وأغلق مرة أخرى مع خياطة جراحية.

ويصف هذا العمل عتاد نهج التي يمكن استخدامها لدراسة تشكيل الجدار الابهري الجنينية والولادة العادية خلال التنمية، وكذلك بعد اضطرابات في هذه العملية أثناء المرض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة صيانة ومرض الشريان الاورطي الكبار. ويمكن استقراء النهج للأوعية الدموية الأخرى، وكذلك هياكل غير الأوعية الدموية المغلفة بالعضلات الملساء، مثل الخطوط الجوية الرئة أو الجهاز الهضمي. وأخيراً، يمكن استخدام تقنيات مشابهة لدراسة أنواع الخلايا خارج سمكس، مثل خلايا بطانية أو الليفية، فضلا عن التفاعل بين هذه أنواع الخلايا وسمكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر لي دين لمشاركة بروتوكول له المختبرات لعزل SMC الابهري. دعم التمويل كان المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS088854، R01HL125815، و R01HL133016 إلى D.M.G)، "جمعية القلب الأمريكية" (معونات 14GRNT19990019 إلى D.M.G.)، وجامعة ييل (زمالة براون-كوكس صباحا وبدء التشغيل الأموال إلى D.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon 
 TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory   026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory   006148 
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory  13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Tags

علم الأحياء التنموي، مسألة 127، بيولوجيا الأوعية الدموية، والشريان الاورطي، وخلايا العضلات الملساء، جدار الأوعية الدموية، الماوس، القلب والأوعية الدموية، الغلالة وسائل الإعلام
استخدام <em>في فيفو</em> والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, … More

Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z. Y., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter