Summary
Protokoller for at studere de embryonale og perinatal murine aorta bruger i vivo klonede analyse og skæbne kortlægning, aorta explants og isoleret glat muskel celler er beskrevet her. Disse forskellige tilgange lette undersøgelsen af morfogenese af embryonale og perinatal aorta i normal udvikling og patogenesen ved sygdom.
Abstract
Aorta er den største arterie i kroppen. Aorta væggen består af en indre lag i endothelial celler, et midterste lag af vekslende elastisk lamellae og glatte muskelceller (SMCs) og et ydre lag af fibroblaster og ekstracellulære matrix. I modsætning til den udbredte undersøgelse af patologiske modeller (fx åreforkalkning) i voksen aorta, er langt mindre kendt om den embryonale og perinatal aorta. Her fokuserer vi på SMCs og give protokoller for analysen af morfogenese og patogenese af embryonale og perinatal aorta SMCs i normale udvikling og sygdom. Specifikt, de fire protokoller inkluderet er: Jeg) i vivo embryonale skæbne kortlægning og klonede analyse; II) eksplantat embryonale aorta kultur; III) SMC isolation fra perinatal aorta; og iv) subkutane osmotisk mini pumpe placering i gravid (eller ikke-gravide) mus. Således, disse tilgange lette undersøgelsen af origin(s), skæbne og klonede arkitektur af SMCs i aorta in vivo. De giver mulighed for modulerende embryonale aorta morfogenese i utero af løbende eksponering for farmakologisk agenter. Derudover isolerede aorta væv explants eller aorta SMCs kan bruges til at få indsigt i rollen som bestemt gen mål under grundlæggende processer såsom muscularization, spredning og migration. Disse hypotese-genererende eksperimenter på isolerede SMCs og eksplanterede aorta kan derefter vurderes i in vivo sammenhæng gennem farmakologiske og genetiske metoder.
Introduction
Kredsløbssystemet i flercellede organismer funktion for at levere næringsstoffer og ilt til cellerne, der er i kontakt med omverdenen, og at fjerne affaldsprodukter og kuldioxid fra disse celler. I hvirveldyr består primært kredsløbssygdomme af hjertet, som pumper blodet gennem en serie af blodkar. Væggene i store blodkar, såsom arterier og vener, består af tre lag: Jeg) intima, eller indre lag i endothelial celler; II) medier eller midterste lag af vekslende circumferentially aflange glatte muskelceller SMCs og elastisk lamellae; og iii) adventitia, eller ydre lag af bindevæv og fibroblaster. Det store flertal af undersøgelser i vaskulære biologi fokus på endotelceller, undersøger dannelsen af nye endotel celle-foret rør gennem angiogenese. I sammenligning modtage SMCs forholdsvis lidt opmærksomhed. SMCs er imidlertid en kritisk celletype i opførelsen af den normale arterievæggen og vaskulære sygdomme.
Aorta er den største kaliber arterie i kroppen, modtager den minutvolumen fra venstre hjertekammer af hjertet. Det er plaget af forskellige sygdomme hos mennesker, herunder åreforkalkning, aneurisme og dissektion. I voksen organismer studerede aorta og dens store grene intenst i modeller af vaskulær sygdom. For eksempel, højt fedtindhold kost fodret mus, der er null for genet kodning low-density lipoprotein receptor eller apolipoprotein E, udvikle åreforkalkning, og de seneste skæbne kortlægning undersøgelser tyder på, at allerede eksisterende SMCs giver anledning til flere celletyper i den aterosklerotisk plaque1. I aorta aneurismer omfatter patologiske ændringer SMC apoptose og ekstracellulære matrix remodeling2,3.
Væsentligt mindre er kendt om SMC morfogenese og patogenese de embryonale og perinatal perioder. Her give vi protokoller for at studere embryonale og perinatal aorta SMCs i vivo, i væv explants og i isolerede celler. For eksempel, skildrer den første del af protokollen skæbne kortlægning og klonede analyse i embryonale mus. CRE recombinase udtrykt under kontrol af en celle-specifikke promotor fremmer mærkning af specifikke celler og deres afkom4,5,6 tidsmæssige kontrol af celle-specifik mærkning kan dog udfordrende under fosterudviklingen i mus. I denne forbindelse leverer med embryoner udtrykker den betingede CreER en promotor aktiv i SMCs (e.g.,Myh11 eller Acta2) og en Cre reporter, vi metoder til indsprøjtning tamoxifen eller dets aktive metabolit 4-OH-tamoxifen i gravide dæmninger og til at analysere de mærkede celler i embryoner eller postnatal afkom. Desuden, i modsætning til skæbne kortlægning undersøgelser, som overvejende udnytte Cre journalister med en enkelt reporter fluorophore1,7, klonede analyse er væsentligt forbedret med multi farve Cre journalister.
I andet og tredje afsnit af protokollen beskrives metoder til isolering og dyrkning embryonale aorta explants og aorta SMCs fra nyfødte, henholdsvis. Disse tilgange giver mulighed for manipulation af signaling veje, især i aorta explants eller SMCs, og til at analysere de direkte virkninger af farmakologiske midler. Således kan rollen af specifikke gener i væv af interesse screenes i en langt hurtigere måde end via traditionelle genetiske manipulationer i mus. Derudover de isolerede SMC undersøgelser lette analysen af celle migration og vedhæftning, som er teknisk begrænset in vivo.
Endelig beskriver den fjerde protokol afsnit placeringen af en subkutan osmotisk mini pumpe fyldt med farmakologiske midler hos gravide (eller ikke-gravide) mus. Denne metode fremmer analyse af effekten på fosterudviklingen forårsaget af agenter, der kræver kontinuerlig infusion på grund af hurtige stofskifte. Alternativ for hyppige injektioner er ikke praktisk for mange ansatte og bør undgås, da det kan forårsage betydelige ubehag i den gravide dam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle mus protokoller godkendes af institutionelle Animal Care og brug Udvalget ved Yale University.
1. kortlægning af In Vivo embryonale skæbne og klonede analyse
Bemærk: vi har brugt disse tilgange bredt til at evaluere oprindelsen af celler og deres klonede arkitektur i udvikling og sygdom modeller 7 , 8 , 9 , 10.
- oprette parring mellem mus med en CreER og mus med en Cre reporter.
Bemærk: En CreER bruges til SMC mærkning; Myh11-CreERT2 eller Acta2-CreERT2 mus 11 , 12 er almindeligt anvendt til dette formål. Vi har brugt ROSA26R-CreERT2 mus 13 bredt mærkning embryonale væv.- For klonede analyse, bruge en multi-farve Cre reporter (fx konfetti eller Rainbow [Rb] mus) 8 , 14 , 15 og skæbne kortlægning, bruge en ensfarvet Cre reporter (f.eks. ROSA26R-YFP mus 16) eller dobbelt-farve Cre reporter ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Bemærk: Denne avl ordning bruger voksen mus, der er 2-6 måneder gamle (generelt ~ 30 g) og vil generere embryoner med en CreER og Cre reporter.
- For klonede analyse, bruge en multi-farve Cre reporter (fx konfetti eller Rainbow [Rb] mus) 8 , 14 , 15 og skæbne kortlægning, bruge en ensfarvet Cre reporter (f.eks. ROSA26R-YFP mus 16) eller dobbelt-farve Cre reporter ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Tjek for vaginale stik i morgen ved hjælp af en metal sonde og overveje middag på dagen for stik opdagelse som embryonale dag (E) 0,5.
- Adskille kvindelige fra mandlige, når en plug registreres.
- Forbered 4-OH-tamoxifen og tamoxifen arbejder løsninger.
- For 4-OH-tamoxifen, 5 mg opløses i 50 µL af 100% ethanol, vortex for 2 min og derefter tilføje 450 µL af majs olie. På isen, der sonikeres output på niveau 2 for 10 s cyklusser med hvile mellem cyklusser indtil prøven køler ned. Efter prøven er helt opløst (normalt ~ 4-5 cyklusser af ultralydbehandling), tage 200 µL af sonicated løsning og opløses i 1800 µL af majs olie at gøre endelige brugsopløsning (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
- For tamoxifen, fortyndes til 50 mg/mL 100% ethanol og vortex indtil den er opløst. Fortyndet i majsolie at foretage den endelige brugsopløsning (tamoxifen, 10 mg/mL) og røre ved 45 ° C til at sikre, at det er helt opløst.
- For tidlig embryonale induktion, injicere 4-OH-tamoxifen intraperitoneal i en gravid dam.
- Bruger 4-OH-tamoxifen injektioner (op til ~ 150 µg pr. gravide mus, eller omtrent 5 mg/kg legemsvægt) på E5.5 og derefter som de giver levedygtige dam, fostre og unger.
- Brug tamoxifen ved doser på 0,5 - 1,5 mg (eller 17-50 mg/kg) for dæmninger gravid med embryoner på ~ E9 og derefter. Bruge en 30G nål for alle injektioner.
Bemærk: Filtrering gennem et 0,22 µm filter bruges typisk til at sterilisere alle blandinger inden injektionen.
- For klonede analyse, bruge intraperitoneal injektioner af høje doser af 4-OH-tamoxifen (fx, 5 mg/kg) eller tamoxifen (fx, 50 mg/kg) til at markere flere celler.
- Til at markere individuelle celler, titreres ned 4-OH-tamoxifen eller tamoxifen dosis, således at i væv af interesse (dvs. aorta), næsten alle embryoner analyseret (som beskrevet nedenfor i slutningen af dette afsnit) har enten ingen celler mærket eller kun celler af en enkelt farve; Dette er tærskeldosis.
- Til at markere celler i midten-slutningen svangerskabsperioden og spore deres skæbne eller clonality i den postnatale mus, tilføre progesteron intraperitoneal hulrummet af dæmningen gravid samtidig med tamoxifen i en 1:2 (progesteron: tamoxifen) dosis ratio.
Bemærk: Tamoxifen doser er 17-50 mg/kg og progesteron doser er 8,5-25 mg/kg (dvs. halvdelen af tamoxifen doser). Progesteron injektion kan forsinke arbejdskraft ved ~ 1-2 dage. - Aflive dæmningen gravid med embryoner af en ønskede alder ved hjælp af en åben slip-metoden, hvor dam er placeret i en beholder indeholdende bomuld eller gaze gennemblødt med ufortyndet isofluran. Bekræfte død ved at åbne brysthulen for at fremkalde pneumothorax, ved at fjerne de vitale organer, og/eller ved at udføre cervikal dislokation.
- Rense maven med 70% ethanol. Brug saks til at skære åbne maven og dissekere ud af livmoderen. Fjern embryoner fra livmoderen og forsigtigt adskille embryoner fra moderkagen og blommesækken med pincet.
- Euthanize embryoner på E15 eller ældre ved at udføre enten cervikal dislokation eller halshugning med kirurgisk saks eller en skarp kniv.
Bemærk: Embryoner yngre end E15 hurtigt dør efter eutanasi af moderen og/eller fjernelse af embryoner fra mor. - Af embryoner i iskold PBS og skar et lille stykke af halen ved hjælp af saks til genotype for indberetteren CreER og Cre.
- Fix embryoner i 4% PARAFORMALDEHYD ved 4 ° C i 2 h. vask embryoner tre gange i PBS og derefter inkuberes embryoner i 30% saccharose i PBS i 15 mL rør, vente, indtil de synker, hvilket kan tage op til to dage.
- Fyld plast frysning forme op til 2/3 af maksimale niveau med optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte. Placer hvert embryon lodret i formen, helt nedsænket i oktober Incubate i 10 min. ved stuetemperatur (RT) for at minimere bobler.
- Sted frysning væv blokke oprejst i en tøris, 70% ethanol bad til at fryse. Gemme blokke på-80 ° C.
- Indstil kryostaten temperaturen til 22 ° C og skære blokke til at generere tværgående afdelinger gennem hele aorta, 10-20 µm tykt. Tørre dias på RT for 30 min før gemme dem på-80 ° C.
- Tø dias på RT, beskyttet mod lys for at undgå blegning af fluorophores. Vask dias med PBS-Tween20 0,1%.
- For klonede analyse, pletten dias for kerner (DAPI, 5 mg/mL) og direkte billede andre fluorophores i Rainbow Cre reporter (Cerulean: 433-nm excitation max, 475-nm emission max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Brug følgende filtre til påvisning af fluorophores med en opretstående fluorescerende mikroskop: DAPI (excitation max/båndbredde 350/50 nm, emission max/båndbredde 460/50 nm), Cerulean (excitation 436/20 nm, emission 480/40 nm), texas rød (excitation 560 / 40 nm, emission 630/75 nm) og brugerdefineret filter til at adskille mCherry fra mOrange (excitation 577/10 nm, emission 630/50 nm).
- Til skæbne kortlægning med mTmG Cre reporter, opdage normal god landbrugspraksis (484 nm, 510 nm), enten ved direkte imaging eller immunfarvning. For billeddannelse med en opretstående fluorescerende mikroskop bruge en normal god landbrugspraksis filter (excitation 470/40 nm, emission 525/50 nm).
- For immunfarvning, inkuberes sektioner med primære antistoffer natten over ved 4 ° C, vask med 0,1% Triton X-100 i PBS og derefter inkuberes med sekundære antistoffer for 1 h. brug anti-CD31 (slutkoncentration 0.0016 mg/mL), anti-normal god landbrugspraksis (0.006 mg/mL) og Cy3-direkte konjugerede anti-SMA (1: 500 endelig fortynding) primære antistoffer og brug sekundære antibodies direkte konjugeret med fluorophores (1: 500 endelig fortynding) (Se Tabel of Materials).
- For klonede analyse, pletten dias for kerner (DAPI, 5 mg/mL) og direkte billede andre fluorophores i Rainbow Cre reporter (Cerulean: 433-nm excitation max, 475-nm emission max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Billede dias med en opretstående fluorescerende mikroskop (forstørrelse: 4 X - 20 X) eller Konfokal mikroskop (10 X-63 X). For høj forstørrelse, bruge en Konfokal imaging 63 x olie mål med en numerisk blænde på 1,4-0,6 og en rammestørrelsen på 1.024 x 1.024 pixel.
2. Explant embryonale Aorta kultur
Bemærk: denne tilgang blev tidligere brugt til at evaluere integrin beta3 i stenose af de eksplanterede rolle Eln (- / -) embryonale aorta 9 , 18.
- aflive en tidsindstillet-gravid dæmningen ved E15.5 af overskydende isofluran indånding, som pr trin 1.8, ovenfor.
- Høst og aflive embryoner, som pr trin 1.9-1,10, ovenfor.
- Placer embryonet dvask og pin forlænget arme og ben til dissektion bestyrelsen. Visualisere med en dissektion Stereoskopet og bruge saks til at skære et lodret snit fra maven gennem brystbenet til den øvre brystkasse. Dissekere væk thymus, luftrør, lunger, spiserør, lever og tarmen.
- Forsigtigt trække hjertet ventrally med pincet og bruge saks til at dissekere aorta fra den dorsale aspekt af thorax og abdominale hulrum. For at frigive aorta, skære det på den proksimale roden og de distale abdominal positioner.
- Placer aorta i iskold steril PBS i en celle kultur hætte. Overføre aorta til et 24-godt plade og kultur det i DMEM med 0,5% FBS i op til 24 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Næringssubstratet kan suppleres med en blokerende antistof (fx anti-integrin αvβ3 antistof på 0,02 mg/mL 9; Se Tabel af materialer) eller en farmakologisk agent. - Vaske aorta to gange med PBS og derefter løse det med 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min.
- Vaskes tre gange med PBS og overførsel aorta til et 1,5 mL rør med 30% saccharose i PBS. Efter aorta dræn, gøre frossen væv blokke, skåret dele og immunostain, som beskrevet i trin 1.13-1,15, ovenfor.
3. SMC Isolation fra Perinatal Aorta
Bemærk: denne fremgangsmåde anvendes i øjeblikket til at sammenligne biologi af aorta SMCs isoleret fra Eln (- / -) og vildtype perinatal mus.
- Aflive en murine pup på postnatal dag (P) 0,5, enten ved cervikal dislokation eller ved halshugning med kirurgisk saks eller en skarp kniv, som beskrevet i trin 1,10, ovenfor.
- Udføre trin 2.3 og derefter, efter åbning af thorax og abdomen, punktere venstre hjertekammer med 23G kanyle. Brug plastslanger tilsluttes nålen til steril PBS-holdige sprøjten holdes lodret på en ophøjet position, således at PBS munder ud i venstre ventrikel ved hjælp af tyngdekraften. Tillad infusion af steril PBS til venstre hjertekammer, indtil leveren blanches.
- Bruge pincet til at fjerne adventitial væv på ydersiden af aorta og dissekere aorta, som beskrevet i trin 2.4.
- Fordøje aorta i en enkelt løsning af DMEM (500 µL) suppleret med 225 U/mL collagenase, 2.25 U/mL elastase og 1 x antibiotikum antimykotikum for 45 min. ved 37 ° C. manuelt ryste røret hver 5-10 min.
- i sterilt celle kultur hætte, titurate den fordøjede væv af pipettering op og ned med 200 µL pipette til at generere en enkelt celle suspension. Overføre encellede suspension til en 15 mL tube, tilsættes 2 mL af DMEM og centrifugeres ved 920 x g i 5 min. ved 25 ° C.
- Supernatanten. Resuspenderes celle i 3 mL af SMC næringssubstratet (DMEM indeholder 10% FBS suppleret med 1 µg/mL rhFGF, 10 µg/mL rhEGF, 100 U/mL penicillin/streptomycin og 2,5 µg/mL Amphotericin B). Overførsel til en 35-mm kultur plade.
Bemærk: Ved oprindelige isolering, ~ 400.000 celler er fremstillet af et enkelt P0.5 vildtype aorta; ~ 300.000 af disse celler er SMCs. - Kultur celler ved 37 ° C og ændre til frisk SMC næringssubstratet hver 3 dage. Hjælp af standardteknikker med trypsin, passage celler når sammenflydende. For eksperimenter, bruge celler fra passager 3-7.
4. Subkutane osmotisk mini pumpe placering i gravide (eller ikke-gravide) mus
Bemærk: denne tilgang blev tidligere brugt til løbende levere en farmakologisk agent (fx integrin β3 og β5 hæmmer cilengitide) til embryoner i livmoderen 9. Pumpen blev indsat i den gravide dæmningen ved E13.5 og opretholdt indtil fødsel.
- Bedøver mus med 2-5% isofluran i ilt (strømningshastigheden af 1 L/min.) til induktion og 1-3% for vedligeholdelse. Bruge den tå-knivspids refleks til overvågning af anæstesi, og justere den bedøvende agent efter behov. Administrere subkutane buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) for analgesi.
- Barbere lænden med neglesaks. Bruge sterilt gardiner, handsker og instrumenter og vedligeholde mus på en varme kirurgisk plade under kirurgi.
- Opstille hver mus i liggende stilling og krat på bagsiden med betadine efterfulgt af isopropylalkohol. Ca 3-5 cm rostralt til bunden af halen i den nederste del af ryggen, bruge en skalpel til at foretage en horisontal hud indsnit 0,5 - 1,0 cm længde uden at skade den underliggende muskel.
- Indsætte en hemostat i snit og oprette en subkutan lomme rostrally til pumpe implantation af åbning og lukning hemostat jaws.
- Udfylde en osmotisk mini pumpe med agent for valg, som producenten ' s retningslinjer (Se Tabel af materialer). Sæt fyldt pumpen i lommen og luk snittet med clips eller 6-0 ikke-resorberbare suturer. Sikre, at den samlede kirurgiske tid er mindre end 10 min.
- Post-operatively, overvåge mus hver 15 min, indtil de har tilbagebetalt fra brystbenet recumbency. Administrere subkutane buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) hver 6-12 h til 48 h. Når musene har fuldt tilbagebetalt fra narkose, overvåge dem dagligt. Fjerne clips eller suturer 7-10 dage efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en repræsentativ klonede analyse af SMCs i embryoner mutant for Eln (genet kodning ekstracellulære matrix proteiner elastin), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 mus blev parret til Eln(+/-) mus også transporterer de multi-farve ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Som beskrevet i trin 1, stik blev kontrolleret, gravid dæmninger blev induceret med en enkelt tamoxifen injektion (1,5 mg) på E12.5, og de blev ofret på E18.5. Embryoner blev fældet, faste, frosne og genotypebestemmes. Tværgående faldende aorta snit frosset organmateriale blev skåret. Sektioner fra Eln(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embryoner indikerer, at den overskydende inderste lag SMCs, der ophobes i Eln-null mus (Start efter E15.5) er præget af flere farver ( Figur 1) og derfor stammer fra flere alpha-glat muskel aktin (SMA)+ celler, der er til stede på ~ E12.5. I E12.5 aorta er SMA+ celler begrænset til tunica media.
For at generere Eln(- / -) embryonale aortas for explants, mandlige og kvindelige Eln(+/-) mus blev parret. Ved hjælp af metoder, der beskrives i trin 2, stik blev kontrolleret og gravide Eln(+/-) dæmninger blev ofret på E15.5. Aortas blev isoleret fra Eln(- / -) embryoner og kulturperler for 0 eller 18 h i overværelse af en anti-integrin β3 blokerer antistof eller en IgG1 kontrol. Aortas blev derefter fast, frosset, og cryosectioned, og snit frosset organmateriale var farvet for SMA (SMC markør), CD31 (endotel celle markør), og kerner (DAPI) (figur 2). Resultaterne viser, at inden for 18 h af dyrkning, E15.5/Eln(- / -) aorta bliver hypermuscular og stenotic. Denne proces er svækket af en anti-integrin β3 blokerende antistof.
SMCs blev isoleret fra aorta af vildtype mus på P0.5. Som beskrevet i trin 3, SMCs var isoleret fra dissekeret neonatal aorta ved enzymet fordøjelse og kulturperler. Celler var passaged, og passage 3 celler blev farvet for SMC markører (dvs., SMA, glatte muskelceller myosin heavy chain (SMMHC), eller transgelin (også kendt som SM22α)), CD31 og kerner (DAPI) (figur 3). De fleste af de dyrkede celler express SMC markører, men ikke CD31.
For at vurdere infunderes om farmakologisk hæmning af integrin β3 kan dæmpe hypermuscularization og stenose af Eln(- / -) aorta i vivo, vi løbende hæmmer cilengitide på grund af sin korte half-life i plasma. Eln(+/ −) hanner og hunner blev parret, og som beskrevet i trin 4, osmotisk mini-pumper fyldt med cilengitide blev implanteret i gravide dæmninger på E13.5. På P0.5, unger var aflivede og genotypebestemmes, og deres aortas blev analyseret. Cilengitide behandling dæmper signifikant aorta stenose og hypermuscularization i Eln(- / -) mus (figur 4) uden at ændre vildtype aorta9. Anti-integrin β3 er således et potentielt lovende noninvasive tilgang til behandling af elastin aortopathy.
Figur 1 . Overskydende SMCs i Eln(- / -) Aorta stammer fra flere allerede eksisterende SMCs. Dæmninger gravid med Eln(- / -), Acta2-CreERT2 embryoner også med flerfarvet Cre reporter ROSA26R(Rb / +) blev induceret med en enkelt intraperitoneal injektion af tamoxifen (1,5 mg) på E12.5. Dæmninger blev ofret på E18.5, og tværgående dele af de faldende aortas af embryoner blev analyseret, med farvning for DAPI og den direkte fluorescens af Rb farver, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) og mOrange (mOr). Overskydende SMCs ophobes i den indre aspekt af Eln-null aorta efter E15.518. De overskydende indre lag SMCs omfatter celler i flere farver (stjerner), der angiver polyclonality. Lu, aorta lumen. Skalalinjen, 10 µm. Reprinted fra Misra et al., 20169. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Anti-αvβ3 Integrin blokade dæmper Hypermuscularization og stenose af Eln(- / -) aorta eksplantat. På E15.5, gravid dæmninger blev aflivet og aortas Eln(- / -) embryoner blev høstet. Isolerede aortas var enten fast straks eller kulturperler i overværelse af en isotype kontrol IgG1 eller en integrin αvβ3 blokerende antistof til 18 h før fiksering. Fast aortas var farvet for CD31, SMA og kerner (DAPI). Lu, aorta lumen. Skalalinjen, 100 µm. Reprinted fra Misra et al., 20169. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Isoleret og kulturperler aorta SMCs fra Neonatal mus udtrykkelige glatte muskulatur markører. SMCs var isoleret fra P0.5 unger og kulturperler. Celler fra den tredje passage var fast og farvet for CD31 (EF markør), kerner (DAPI), og en SMC markør (enten SMA, SM22α eller SMMHC, som angivet). Denne analyse indikerer, at ~ 90% af de dyrkede celler express SMC markører, og ingen blev observeret for at udtrykke CD31. Skala bar, 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Kontinuerlig Infusion af Cilengitide In Vivo dæmper Eln(- / -) aorta Hypermuscularization og stenose. Mandlige og kvindelige Eln(+/-) mus blev krydset. Integrin β3 hæmmer cilengitide eller køretøj (PBS) blev løbende infunderet i gravide dæmninger ved hjælp af osmotisk mini-pumper startende fra E13.5. Tværgående sektioner på P0.5 var farvet for SMA (rød), CD31 (hvid) og kerner (DAPI, blå). Lu, aorta lumen. Skalalinjen, 100 µm. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modsætning til de omfattende undersøgelser af murine aorta og dens store grene i voksen patologiske tilstande, som modeller for åreforkalkning, er mindre kendt om morfogenese og patogenesen af embryonale og perinatal aorta. Her, vi fokuserer på de embryonale/perinatal aorta, specielt SMCs, og giver protokoller for at studere aorta gennem i vivo, væv eksplantat, og SMC isolation tilgange. Disse gratis tilgange giver investigator med forskellige tilgange til at studere den embryonale/perinatal aorta.
Klonede analyse er en meget kraftfuld tilgang, der gør det muligt at undersøge adfærd af individuelle celler. Vi har for nylig brugt denne metode til at identificere specialiserede SMCs i pulmonal Vaskulaturen10. Det er afgørende at anerkende, at i en individuel mus transporterer en flerfarvet Cre reporter, der er en chance for, at cellerne i samme farve kunne stamme fra mere end én rekombination begivenhed. Således nødvendiggør klonede analyse med en multi-farve reporter evaluering af talrige mus. Fordi tamoxifen i midten-slutningen svangerskabsperioden kan interferere med fødsel, til eksperimenter med at markere celler i midten-slutningen svangerskabsperioden og spore dem efter fødslen, bør progesteron og tamoxifen sprøjtes samtidig. Svarende til protokoller i embryo, skæbne kortlægning og klonede analyse af celler i den voksne mus kan gennemføres med intraperitoneal injektion af tamoxifen i voksen.
Klonede analyse og skæbne kortlægning af SMCs bruger mus transporterer transgener med udtryk for Cre recombinase under kontrol af initiativtagerne med øget aktivitet i den glatte muskulatur. Her beskriver vi protokoller ved hjælp af mus transporterer betinget transgener Myh11-CreERT2 eller Acta2-CreERT2. Myh11 er den mest specifikke markør for SMCs19; men det er downregulated i Eln(- / -) aorta9. Acta2 er udtrykt i SMCs, herunder de af Eln-null aorta, men det er ikke så specifikke fordi det udtrykkes også i andre celletyper. Hvis disse betingede transgener var "utætte" (dvs., fremkalde rekombination i mangel af tamoxifen), det kan være problematisk, da forsøgene ikke vil afgrænse timingen af celle mærkning. Leakiness af disse transgener blev analyseret ved at vurdere beta-galactosidase aktivitet i en lacZ-baserede Cre reporter og enten Myh11-CreERT2 -eller Acta2-CreERT2 efter køretøj behandling ( -mus dvs., i mangel af tamoxifen induktion)11,12. Baseret på denne analyse, disse transgener blev ikke anset for Utætte.
Hypermuscularization kendetegner flere Vaskulære sygdomme hos mennesker. For eksempel, er supravalvulær aorta stenose (SVAS) en ødelæggende medfødt betingelse, der er karakteriseret ved obstruktion af store og mellemstore arterier på grund af overskydende SMCs. SVAS resultater fra tab af funktion af én allel af ELN gen og opstår som en isoleret enhed, eller mere almindeligt, som en del af Williams-Bitz syndrom20,21,22,23,24. ELN(- / -) mutant-mus phenocopy mange aspekter af aorta fænotype SVAS18,21,22. Aorta explants fra Eln(- / -) embryoner blive hurtigt tilstoppet under kultur, explants fra vildtype embryoner fortsat patent9,18. Aorta eksplantat tilgang letter screening for agenter, at dæmpe stenose i elastin aortopathy9. Men denne fremgangsmåde tager ikke hensyn mekanisk eller fysiske kræfter, som aorta er udsat for i kroppen. Således bør positive hits i aorta eksplantat screening vurderes med in vivo Eln mutant musen modeller.
SMC isolation protokol er en hurtig og robust metode til at hente SMCs fra perinatal murine aorta. En lignende fremgangsmåde kan ekstrapoleres for at isolere SMCs fra voksne mus. På grund af sin relativt store størrelse, voksen aorta kan åbnes på langs og adventitia og endotelceller dissekeret væk. For at evaluere renheden af de celler, der er isoleret fra perinatal eller voksen aorta, er det vigtigt at tjekke for udtryk for SMC markører (f.eks. SMMHC, smoothelin, SM22α, og SMA) og manglen udtryk i endothelial celle markører (f.eks. CD31 og vaskulære endotel cadherin). Et potentiale, alternativ isolering tilgang er at bruge flowcytometri at isolere fluorescently mærket SMCs fra dissekeret aorta. Mus medbringer en fluorescerende Cre reporter- og Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2, eller Tgln-Cre kan bruges til at fluorescently mærke SMCs11,12,25, 26,27. Alternativt, kan eksisterende Transgene mus med SMA promotor kørsel udtryk for en fluorophore (dvs. normal god landbrugspraksis, mCherry, eller RFP) blive brugt28,29,30.
Indopererede osmotisk mini-pumper bruges til at yde kontinuerlig levering af farmakologiske midler til forsøgsdyr. Vi har implanteret mini-pumper i gravide mus på E13.5 at levere agenter til at udvikle embryoner i løbet af resten af gestationsalder periode9. For at nå embryonerne, skal sådanne agenter kunne passere blod-placentamembranen. I almindelighed, mini-pumper er meget godt tolereret, og i betragtning af den lave udnyttelsesgrad for infektion, rutinemæssig antibiotika anbefales ikke. Såret opspringning er sjælden; dog hvis der er en større end 4 mm opspringning musen bør re bedøvede og såret rengøres og lukket igen med en kirurgisk sutur.
Dette arbejde beskriver en angrebsformål af tiltag, der kan bruges til at studere den normale dannelse af embryonale og perinatal aorta væggen under udvikling, samt efter perturbationer i denne proces under sygdom. Derudover kan disse protokoller anvendes til at studere vedligeholdelse og sygdom i voksen aorta. Tilgange kan ekstrapoleres til andre blodkar og glat muskulatur-belagt ikke-vaskulære strukturer, såsom mave-tarmkanalen eller lunge airways. Endelig kan lignende teknikker bruges til at studere celletyper ud over SMCs, som endotelceller eller fibroblaster, samt samspillet mellem disse celler typer og SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dean Li for at dele sit laboratorium protokol for aorta SMC isolation. Finansiering støtte blev givet af den National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 og R01HL133016 til D.M.G), American Heart Association (licensbetaling 14GRNT19990019 til D.M.G.), og Yale University (Brown-Coxe stipendium til A.M. og opstart midler til D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
