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Developmental Biology

À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

Published: September 12, 2017 doi: 10.3791/56039
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Summary

Protocoles pour l’étude de l’aorte murin embryonnaire et périnatale à l’aide en vivo clonale analyse et cartographie sort, explants aortiques et muscle lisse isolé des cellules sont détaillées ici. Ces diverses approches facilitent l’enquête de la morphogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale dans le développement normal et la pathogenèse de la maladie.

Abstract

L’aorte est la plus grosse artère du corps. La paroi aortique est constituée d’une couche interne de cellules endothéliales, une couche intermédiaire d’une alternance de lamelles élastiques et des cellules musculaires lisses (CML) et une couche externe de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Contrairement à l’étude généralisée des modèles pathologiques (par exemple, l’athérosclérose) dans l’aorte adulte, sait beaucoup moins sur l’aorte embryonnaire et périnatale. Ici, nous nous concentrons sur les CGS et fournir des protocoles pour l’analyse de la morphogénèse et la pathogenèse de l’embryonnaires et périnatales SMCs aortiques dans un développement normal et la maladie. Plus précisément, les quatre protocoles inclus sont : J’ai) in vivo la cartographie sort embryonnaires et analyse clonale ; II) la culture embryonnaire aorte explant ; III) isolement de SMC de l’aorte périnatale ; et iv) placement pompe mini osmotiques sous-cutanées chez les souris enceintes (ou des femmes enceintes). Par conséquent, ces approches facilitent les recherches des origines, sort et architecture clonale de CML dans l' aorte in vivo. Ils permettent de modulation aorte embryonnaires morphogenèse dans l’utérus par une exposition continue aux agents pharmacologiques. En outre, le tissu aortique isolé des explants ou SMCs aortiques peuvent être utilisés pour mieux comprendre le rôle des gènes spécifiques cibles au cours de processus fondamentaux tels que muscularization, la prolifération et la migration. Ces expériences génératrices d’hypothèse sur CML isolés et l’aorte explanté peuvent ensuite être évalués dans le contexte de in vivo au moyen d’approches pharmacologiques et génétiques.

Introduction

Les systèmes circulatoires de fonction multicellulaires pour fournir des nutriments et l’oxygène aux cellules qui ne sont pas en contact avec le milieu extérieur et pour enlever des déchets produits et dioxyde de carbone de ces cellules. Chez les vertébrés, le principal système circulatoire est composé du cœur, qui pompe le sang à travers une série de vaisseaux sanguins. Les murs de gros vaisseaux sanguins, comme les artères et les veines, se composent de trois couches : je) l’intima ou la couche interne de cellules endothéliales ; II) le support, ou la couche intermédiaire d’une alternance de circonférence allongés des cellules musculaires lisses CML et lamelles élastiques ; et iii) l’adventice ou couche extérieure du tissu conjonctif et des fibroblastes. La grande majorité des études en biologie vasculaire se consacrée sur les cellules endothéliales, enquête sur la formation de nouveaux tubes de bordées de cellules endothéliales par l’intermédiaire de l’angiogenèse. En comparaison, les CGS reçoivent relativement peu d’attention. Cependant, CML est un type de cellule critique dans la construction de la paroi artérielle normale et dans les pathologies vasculaires.

L’aorte est l’artère de plus gros calibre dans l’organisme, qui reçoit le débit cardiaque du ventricule gauche du cœur. Il est touché par diverses maladies humaines, y compris l’athérosclérose, anévrisme et dissection. Dans les organismes adultes, l’aorte et ses branches principales sont intensément étudiés dans des modèles de maladies vasculaires. Par exemple, régime riche en graisses nourri des souris qui ont la valeur null pour le gène codant le récepteur des lipoprotéines de basse densité ou apolipoprotéine E, développer l’athérosclérose et des études de cartographie sort récentes indiquent que SMCs préexistants donnent naissance à plusieurs types de cellules dans le plaque d’athérosclérose1. Dans les anévrismes de l’aorte, changements pathologiques incluent l’apoptose SMC et remodelage2,3de la matrice extracellulaire.

Considérablement moins est connu au sujet de la morphogenèse de la SMC et la pathogenèse pendant la période embryonnaire et périnatale. Ici, nous fournissons des protocoles pour l’étude embryonnaires et périnatale aortique SMCs in vivo, des explants de tissus et de cellules isolées. Par exemple, l’article premier du protocole délimite cartographie sort et analyse clonale chez les souris embryonnaires. Recombinase cre exprimée sous le contrôle d’un promoteur spécifique à la cellule facilite le marquage des cellules spécifiques et leur progéniture4,5,6; Toutefois, un contrôle temporel de l’étiquetage spécifique des cellules peut être difficile durant le développement embryonnaire chez la souris. Dans ce contexte, nous fournissons avec embryons expriment le conditionnel CreER sous un promoteur actif dans les CGS (e.g.,Myh11 ou Acta2) et un reporter de la Cre, méthodes d’injection de tamoxifène ou son métabolite actif 4-OH-tamoxifène chez les mères enceintes et pour analyser les cellules marquées dans les embryons ou descendants postnatal. En outre, contrairement aux études de cartographie du destin, dont principalement utiliser Cre reporters avec un seul journaliste fluorophore1,7, l’analyse clonale est considérablement amélioré avec des journalistes de Cre multicolores.

La deuxième et la troisième section du protocole décrire des méthodes d’isolement et de mise en culture des explants aortiques embryonnaires et SMCs aortiques de nouveaux-nés, respectivement. Ces approches permettent la manipulation des voies de signalisation, plus précisément dans les explants aortiques ou CML et pour analyser les effets directs des agents pharmacologiques. Ainsi, le rôle de certains gènes dans le tissu d’intérêt peut subir de façon beaucoup plus rapide que par le biais de manipulations génétiques traditionnelles chez les souris. En outre, les études SMC isolés facilitent l’analyse de la migration cellulaire et adhérence, qui sont techniquement limité in vivo.

Enfin, la quatrième section du protocole délimite le placement d’une pompe osmotique mini sous-cutanée, chargé avec des agents pharmacologiques chez des souris enceintes (ou des femmes enceintes). Cette méthode facilite l’analyse de l’effet sur le développement embryonnaire causé par des agents nécessitant une perfusion continue en raison d’un métabolisme rapide. L’alternative des injections fréquentes n’est pas pratique pour de nombreux agents et doit être évitée, car elle peut causer une gêne importante dans le barrage enceinte.

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Protocol

tous les protocoles de souris sont approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Yale et d’institutionnels animalier.

1. In Vivo embryonnaires sort cartographie et analyse clonale

Remarque : nous avons largement utilisé ces approches pour évaluer les origines des cellules et leur architecture clonale dans les modèles de développement et de la maladie 7 , 8 , 9 , 10.

  1. mis en place l’accouplement entre des souris avec un CreER et des souris avec un journaliste Cre.
    Remarque : Un CreER est utilisé pour SMC marquage ; Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 souris 11 , 12 est couramment utilisé à cette fin. Nous avons utilisé des souris de ROSA26R-CreERT2 13 pour le marquage largement les tissus embryonnaires.
    1. Pour analyse clonale, utiliser une multi-couleur Cre journaliste (p. ex., confettis ou souris Rainbow [Rb]) 8 , 14 , 15 et pour la cartographie de sort, utiliser un journaliste de Cre de simple-couleur (par exemple, ROSA26R-YFP souris 16) ou le journaliste de Cre double-couleur ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
      Remarque : Ce schéma d’élevage utilise des souris adultes qui sont âgés de 2 à 6 mois (généralement ~ 30 g) et généreront des embryons avec une CreER et un reporter de Cre.
  2. Rechercher les fiches vaginales dans la matinée à l’aide d’un métal probe et envisager de midi le jour de la fiche par détection jour embryonnaire (E) 0,5.
  3. Séparer le mâle de la femelle lorsqu’une fiche est détectée.
  4. Préparer 4-OH-tamoxifen et solutions de travail tamoxifène.
    1. Pour 4-OH-tamoxifen, dissoudre 5 mg dans 50 µL d’éthanol à 100 %, Vortexer pendant 2 min, puis ajouter 450 µL d’huile de maïs. Sur la glace, laisser agir au niveau de la sortie 2 pendant 10 cycles de s de repos entre les cycles jusqu'à ce que l’échantillon ait refroidi. Après que l’échantillon est complètement dissout (généralement ~ 4-5 cycles de sonication), prendre 200 µL de solution aux ultrasons et dissoudre dans 1 800 µL d’huile de maïs pour faire la solution de travail final (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
    2. De tamoxifène, diluer à 50 mg/mL dans l’éthanol à 100 % et vortex jusqu'à ce qu’il soit dissous. Dilué dans de l’huile de maïs pour faire la solution de travail final (tamoxifène, 10 mg/mL) et mélanger à 45 ° C pour s’assurer qu’elle est complètement dissoute.
  5. Pour l’induction embryonnaire précoce, injecter par voie intrapéritonéale 4-OH-tamoxifen dans un barrage de l’enceinte.
    1. Utiliser les injections 4-OH-tamoxifen (jusqu'à ~ 150 µg / souris enceinte, soit environ 5 mg/kg de poids corporel) à E5.5 et à cette date qu’ils cèdent barrage viable, des embryons et des chiots.
    2. Utilisation de tamoxifène à des doses de 0,5 - 1,5 mg (ou 17-50 mg/kg) pour les mères enceintes avec des embryons à ~ E9 et par la suite. Utiliser une aiguille de 30G pour toutes les injections.
      Remarque : La Filtration à travers un filtre à 0,22 µm est généralement utilisée pour stériliser tous les mélanges avant l’injection.
  6. Pour analyse clonale, utiliser des injections intrapéritonéales de fortes doses de 4-OH-tamoxifen (p. ex., 5 mg/kg) ou tamoxifène (p. ex., 50 mg/kg) à l’occasion de plusieurs cellules.
    1. Pour marquer les cellules individuelles, titrer vers le bas de la dose de 4-OH-tamoxifène ou tamoxifène tel que dans les tissus d’intérêt (c.-à-d., l’aorte), presque tous les embryons analysés (comme décrit ci-dessous à la fin de cette section) n’ont aucune cellules marquées ou seulement les cellules d’une seule couleur ; Il s’agit de la dose seuil.
  7. Pour marquer les cellules dans la période de gestation de mi-fin et à retrouver leur destin ou la clonalité chez la souris après la naissance, injecter la progestérone dans la cavité intrapéritonéale du barrage enceinte concomitamment avec le tamoxifène dans un 1:2 (progestérone : tamoxifène) rapport des doses.
    NOTE : Tamoxifène doses sont 17-50 mg/kg et les doses de progestérone sont 8,5-25 mg/kg (c'est-à-dire la moitié de la dose de tamoxifène). L’injection de progestérone peut retarder le travail de ~ 1 à 2 jours.
  8. Euthanasier le barrage enceinte avec des embryons d’un âge désiré en utilisant une méthode de chute libre, où le barrage est placé dans un récipient contenant du coton ou gaze imbibée d’isoflurane non dilué. Confirmer la mort en ouvrant la cage thoracique pour provoquer un pneumothorax, en supprimant les organes vitaux, et/ou en effectuant la dislocation cervicale.
  9. Purifier l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux pour couper ouvert l’abdomen et disséquer sur l’utérus. Enlever l’embryon de l’utérus et de séparer soigneusement les embryons le placenta et le sac vitellin avec une pincette.
  10. Euthanasier les embryons à E15 ou plus en effectuant la dislocation cervicale ou décapitation avec ciseaux chirurgicaux ou une lame bien aiguisée.
    NOTE : Embryons âgés de moins de E15 meurent rapidement après l’euthanasie de la mère et/ou le retrait des embryons de la mère.
  11. Placer les embryons dans du PBS glacée et couper un petit morceau de queue à l’aide de ciseaux au génotype du reporter CreER et Cre.
  12. Difficulté les embryons dans 4 % paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 2 h. laver les embryons trois fois dans du PBS et puis incuber les embryons dans 30 % de saccharose en tubes de 15 mL, attendre qu’ils sombrent, qui peut prendre jusqu'à deux jours dans du PBS.
  13. Remplissage plastique congélation moules jusqu'à 2/3 du niveau maximum avec la température de coupe optimale (OCT) composée. Placez chaque embryon verticalement dans le moule, entièrement submergé en octobre incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) pour réduire au minimum les bulles.
  14. Place congélation blocs de tissus verticalement dans une glace, bain d’éthanol 70 % de geler. Stocker les blocs à -80 ° C.
  15. Régler la température de cryostat à-22 ° C et couper des blocs pour générer des sections transversales à travers l’aorte entier, 10 à 20 µm d’épaisseur. Sécher les lames à RT pendant 30 min avant leur stockage à -80 ° C.
  16. Décongeler les diapositives à ta, abri de la lumière pour éviter le blanchiment des fluorophores. Laver les lames avec PBS-Tween20 0,1 %.
    1. Pour analyse clonale, détachant les diapositives pour les noyaux (DAPI, 5 mg/mL) et autres fluorophores dans l’arc-en-ciel Cre reporter d’images directement (azurée : 433-nm excitation de max, 475 nm émission de max ; mOrange : 548 nm, 562 nm ; mCherry : 587 nm, 610 nm).
      1. Utilisation des filtres ce qui suit pour la détection des fluorophores avec un microscope à fluorescence vertical : DAPI (excitation max/bande passante 350/50 nm, émission max/bande passante 460/50 nm), Cerulean (excitation 436/20 nm, émission 480/40 nm), texas rouge (excitation 560 / 40 nm, émission 630/75 nm) et un filtre personnalisé pour séparer le mCherry de mOrange (excitation 577/10 nm, émission 630/50 nm).
    2. Pour la cartographie sort avec le journaliste de Cre mTmG, détecter GFP (484 nm, 510 nm), soit directement d’imagerie ou à l’aide d’immunomarquage. Pour l’imagerie avec un microscope à fluorescence vertical utiliser un filtre GFP (excitation 470/40 nm, émission 525/50 nm).
    3. Pour immunostaining, incuber les sections avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C, laver avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS et puis incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 h. utilisation anti-CD31 (concentration finale 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) et Cy3-anticorps primaires directement conjugué anti-SMA (dilution finale 1/500) et utilisation secondaire antibodies directement conjugué à fluorophores (dilution finale 1/500) (voir la Table des matières).
  17. Image des diapositives avec un microscope à fluorescence vertical (grossissement : 4 X - 20 X) ou microscope confocal (10 X-63 X). À fort grossissement, utilisez un 63 d’imagerie confocale x objectif à huile avec une ouverture numérique de 1,4 à 0,6 et une taille d’image de 1 024 x 1 024 pixels.

2. Explantation embryonnaires aorte Culture

Remarque : cette approche a été utilisée auparavant pour évaluer le rôle de l’intégrine bêta 3 durant une sténose de l’explantés Eln (- / -) embryonnaire aorte 9 , 18.

  1. euthanasier un barrage chronométré-enceintes à E15.5 par inhalation isoflurane excédentaire, selon l’étape 1.8, au-dessus de.
  2. Récolte et euthanasier les embryons, comme par les Etapes 1,9-1.10, au-dessus de.
  3. Placer l’embryon passivement et épingler les branches étendues à la Commission de la dissection. Visualiser avec un stéréoscope de dissection et d’utiliser des ciseaux pour couper une incision verticale de l’abdomen par l’intermédiaire du sternum à la partie supérieure du thorax. Disséquer de loin le thymus, trachée, poumons, oesophage, foie et l’intestin.
  4. Tirer le cœur sur le ventre avec une pincette délicatement et utiliser des ciseaux à disséquer l’aorte loin de l’aspect dorsal des cavités thoraciques et abdominales. Pour libérer de l’aorte, le couper à la racine proximale et les positions abdominales distales.
  5. Placer l’aorte dans glacee PBS stérile sous une hotte de culture cellulaire. Transférer l’aorte à une plaque 24 puits et de la culture en DMEM contenant 0,5 % FBS pendant 24 h à 37 ° C.
    Remarque : Le milieu de culture peut être complété par un anticorps bloquant (p. ex., anti-intégrine αvβ3 anticorps à 0,02 mg/mL 9 ; Voir la Table des matières) ou d’un agent pharmacologique.
  6. Laver l’aorte deux fois avec du PBS et puis le fixer avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 20 min.
  7. Laver trois fois avec PBS et transférez l’aorte dans un tube de 1,5 mL avec 30 % de saccharose dans du PBS. Après l’aorte descend, faire des blocs de tissus congelés, des sections coupées et réagissent, comme ci-dessus en étapes 1.13-1,15,.

3. SMC isolément de l’aorte périnatale

Remarque : cette approche est actuellement utilisée pour comparer la biologie du CML aortique isolés de souris périnatales Eln (- / -) et de type sauvage.

  1. Euthanasier un murin pup à jour après la naissance (P) 0,5, dislocation cervicale ou par décapitation avec ciseaux chirurgicaux ou une lame tranchante, tel que décrit à l’étape 1.10, au-dessus de.
  2. Exécuter l’étape 2.3 et ensuite, après avoir ouvert le thorax et l’abdomen, perforer le ventricule gauche avec aiguilles 23G. Tube en plastique utilisation pour se connecter à l’aiguille de seringue contenant du PBS stérile maintenu verticalement à une position élevée que PBS s’écoule dans le ventricule gauche par gravité. Permettent l’injection de PBS stérile dans le ventricule gauche jusqu'à ce que le foie blanches.
    1. Utiliser des pinces pour enlever le tissu adventitiels à l’extérieur de l’aorte et disséquer l’aorte, comme indiqué au point 2.4.
  3. Digérer l’aorte dans une solution unique de DMEM (500 µL) additionné de 225 collagénase U/mL, 2,25 élastase U/mL et 1 x antibiotique-antimycosiques pendant 45 min à 37 ° C. manuellement secouer le tube chaque 5-10 min.
  4. Dans la hotte de culture de cellules stériles, titurate les tissus digérés par pipetage de haut en bas avec une pipette de 200 µL pour générer une suspension de cellules individuelles. Transférer la suspension de cellules individuelles dans un tube de 15 mL, ajouter 2 mL de DMEM et centrifuger à 920 x g pendant 5 min à 25 ° C.
  5. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de culture SMC (DMEM contenant 10 % FBS additionné de 1 µg/mL rhFGF, rhEGF de 10 µg/mL, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2,5 µg/mL d’amphotéricine B). Transférer sur une plaque de 35 mm culture.
    NOTE : Sur l’isolement initial, ~ 400 000 cellules sont obtenus à partir d’une aorte de type sauvage unique P0.5 ; ~ 300 000 de ces cellules sont les CGS.
  6. Culture les cellules à 37 ° C et changer de milieu de culture des SMC frais tous les 3 jours. Selon les techniques habituelles avec la trypsine, le passage des cellules lorsque confluentes. Pour les expériences, utiliser des cellules de passages 3-7.

4. Sous-cutanée Placement de mini pompe osmotique dans l’enceinte (ou Non enceinte) souris

Remarque : cette approche a été utilisée précédemment pour fournir en permanence un agent pharmacologique (p. ex., l’intégrine β3 et β5 inhibiteur Cilengitide) aux embryons dans l’utérus 9. La pompe a été insérée dans le barrage enceinte à E13.5 et maintenue jusqu'à la parturition.

  1. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2-5 % d’oxygène (débit de 1 L/min) pour l’induction et 1 à 3 % pour l’entretien. Le réflexe d’orteil-pincement permet de surveiller le niveau de l’anesthésie et ajustez l’agent anesthésique selon vos besoins. Administration sous-cutanée buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg) pour l’analgésie.
  2. Se raser le bas du dos avec une tondeuse. Utiliser des rideaux stérile, gants et instruments et maintenir les souris sur un plateau chirurgical de chauffage pendant la chirurgie.
  3. Placer chaque souris en position couchée et frottez le dos avec betadine suivie d’alcool isopropylique. Environ 3-5 cm rostrale à la base de la queue dans le bas du dos, utiliser un scalpel à pratiquer une incision horizontale peau 0,5 - 1,0 cm de longueur sans blesser le muscle sous-jacent.
  4. Insérer une pince hémostatique dans l’incision et créer une poche sous-cutanée rostralement à l’implantation de la pompe en ouvrant et fermant les mâchoires de la pince hémostatique.
  5. Remplir une mini-pompe osmotique avec l’agent de choix, selon le fabricant ' directives de s (voir la Table des matières). Insérez la pompe remplie dans la poche et refermer l’incision avec des pinces ou des sutures non résorbables 6-0. Veiller à ce que le temps chirurgical total est inférieure à 10 min.
  6. Suivre après l’intervention, les souris toutes les 15 min jusqu'à ce qu’ils ont récupérés de décubitus sternal. Administration sous-cutanée buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg) toutes les 6 à 12 h pendant 48 h. Quand les souris ont complètement remis de l’anesthésie générale, analysez-les quotidiennement. Retirer les clips ou les sutures post-chirurgie de 7 à 10 jours.

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Representative Results

Dans une analyse représentative clonale de CML en mutant des embryons pour Eln (le gène codant l’élastine protéine de matrice extracellulaire), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 de souris ont été accouplés à des souris Eln(+/-) transportant également les multi-color ROSA26R(Rb/Rb) journaliste. Tel que décrit à l’étape 1, bouchons ont été vérifiés, enceintes barrages ont été induites par une injection unique de tamoxifène (1,5 mg) à E12.5, et ils ont été sacrifiés à E18.5. Les embryons ont été récoltés, fixe, congelés et génotypés. Transverse, descendant des cryosections aortiques ont été coupé. Des sections de l' Eln(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embryons indiquent que la couche intérieure excès SMCs qui s’accumulent dans l’Eln-souris null (démarrant après E15.5) sont marquées par plusieurs couleurs ( La figure 1) et d'où dérivent de multiples actine muscle lisse-alpha (SMA)+ cellules qui sont présentes à ~ E12.5. Dans l’aorte E12.5, SMA+ cellules sont limitées à des médias de tunica.

Pour générer des aortes embryonnaires Eln(- / -) pour les explants, mâle et femelle Eln(+/-) de souris ont été accouplés. À l’aide des méthodes décrites à l’étape 2, bouchons ont été vérifiés et enceintes Eln(+/-) barrages ont été sacrifiés à E15.5. Les aortes ont été isolés des embryons Eln(- / -) et mis en culture pour 0 ou 18 h en présence d’un anti-intégrine β3 bloquant les anticorps ou un contrôle IgG1. Aortes ont été ensuite fixés, congelés, et sectionnés et cryosections ont été colorés pour SMA (marqueur de SMC), CD31 (marqueur de cellules endothéliales) et les noyaux (DAPI) (Figure 2). Les résultats démontrent que, dans les 18 h de culture, l’aorte E15.5/Eln(- / -) devienne hypermuscular et sténosés. Ce processus est atténué par un anti-intégrine β3 des anticorps bloquants.

Les CGS ont été isolées de l’aorte de souris de type sauvage à P0.5. Tel que décrit à l’étape 3, CGS ont été isolées de l’aorte disséquée néonatale par digestion enzymatique et sont cultivés. Les cellules ont été repiquées et cellules de passage 3 ont été colorés pour les marqueurs SMC (c.-à-d., SMA, la chaîne lourde de myosine de muscle lisse (CLMML) ou transgelin (également connu comme SM22α)), CD31 et noyaux (DAPI) (Figure 3). La plupart des cellules cultivées exprime des marqueurs de la SMC mais pas CD31.

Afin d’évaluer si l’inhibition pharmacologique de l’intégrine β3 peut atténuer hypermuscularization et sténose de l’Eln(- / -) aorte in vivo, nous avons continuellement infusé le cilengitide inhibiteur en raison de sa courte demi-vie dans le plasma. Eln(+ / −) mâles et femelles ont été accouplées, et, tel que décrit à l’étape 4, mini-pompes osmotiques chargés avec cilengitide ont été implantés chez des mères enceintes à E13.5. À P0.5, chiots ont été euthanasiés et génotypés et leurs aortes ont été analysés. Cilengitide traitement atténue considérablement la sténose aortique et hypermuscularization chez les souris de l’Eln(- / -) (Figure 4) sans altérer l' aorte de type sauvage9. Ainsi, β3 anti-intégrine est une approche non invasive potentiellement prometteur pour traiter les aortopathy de l’élastine.

Figure 1
Figure 1 . CML excès dans l’aorte Eln(- / -) dérive de multiples SMCs préexistantes. Barrages enceintes avec des embryons Eln(- / -), Acta2-CreERT2 transportant aussi le journaliste Cre multicolor ROSA26R(Rb / +) ont été induites avec une seule injection intrapéritonéale de tamoxifène (1,5 mg) à E12.5. Barrages ont été sacrifiés à E18.5, et des coupes transversales des aortes descendantes des embryons ont été analysés, avec coloration DAPI et la fluorescence directe des couleurs Rb, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) et mOrange (mOr). CML excès s’accumulent dans le côté interne de l' Eln-aorte null après E15.518. Le CML excès de couche interne comprendre des cellules de couleurs multiples (astérisques), indiquant polyclonality. Lu, lumen aortique. Barreau de l’échelle, 10 µm. réimpression de Misra et al., 20169. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Anti-αvβ3 l’intégrine blocus atténue Hypermuscularization et sténose de l’Explant aortique Eln(- / -) . À E15.5, les mères enceintes ont été euthanasiés et les aortes d’embryons Eln(- / -) ont été récoltés. Aortes isolées ont été fixés immédiatement ou mis en culture en présence d’un contrôle d’isotype IgG1 ou un intégrine αvβ3 des anticorps bloquant pendant 18 heures avant fixation. Aortes fixes ont été colorés pour CD31, SMA et noyaux (DAPI). Lu, lumen aortique. Barreau de l’échelle, 100 µm. réimpression de Misra et al., 20169. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Isolées et cultivées SMCs aortiques de souris néonatales Express Muscle lisse marqueurs. CGS ont été isolées de petits P0.5 et ont été cultivés. Cellules du troisième passage ont été fixées et colorées pour CD31 (marqueur de l’EC), les noyaux (DAPI) et un marqueur SMC (SMA, SM22α ou CLMML, comme il est indiqué). Cette analyse indique qu’environ 90 % des cellules cultivées expriment des marqueurs de la SMC, et aucun n’ont été observés à exprimer CD31. Balance bar, 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Une perfusion continue de Cilengitide In Vivo atténue Eln(- / -) Hypermuscularization aortique et la sténose. Mâles et femelles Eln(+/-) de souris ont été croisés. L’intégrine β3 inhibiteur cilengitide ou véhicule (PBS) a été perfusée en permanence chez les mères enceintes à l’aide de mini-pompes osmotiques à partir de E13.5. Sections transversales à P0.5 ont été colorées pour SMA (rouge), CD31 (blanc) et noyaux (DAPI, bleu). Lu, lumen aortique. Echelle, 100 µm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Contrairement à l’enquête approfondie de l’aorte murin et ses branches principales pathologies adultes, tels que les modèles de l’athérosclérose, moins est connu au sujet de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale. Ici, nous nous concentrons sur l’aorte embryonnaire/périnatale, spécifiquement la CML et fournir des protocoles afin d’étudier l’aorte à travers en vivo, explant de tissu, et isolement SMC s’approche. Ces approches complémentaires fournissent l’enquêteur avec diverses approches pour étudier l’aorte embryonnaire/périnatale.

Analyse clonale est une approche très puissante qui permet d’étudier le comportement des cellules individuelles. Nous avons récemment utilisé cette approche pour aider à identifier les CML spécialisé dans le système vasculaire pulmonaire10. Il est essentiel de reconnaître que, chez une souris individuelle transportant un journaliste de Cre multicolore, il y a une chance que les cellules de la même couleur pourraient dériver de plus d’un événement de recombinaison. Ainsi, analyse clonale avec un journaliste multicolore nécessite l’évaluation de nombreuses souris. Parce que le tamoxifène dans la période de gestation de mi-fin peut interférer avec la parturition, des expériences qui marquent les cellules dans la période de gestation de mi-fin et remonter après la naissance, la progestérone et tamoxifène doivent être injectés en même temps. Similaire aux protocoles dans l’embryon, cartographie de sort et analyse clonale de cellules chez la souris adulte peuvent être entrepris avec l’injection intrapéritonéale de tamoxifène chez l’adulte.

Clonale cartographie analyse et devenir des CML utilise souris comportant une activité accrue dans le muscle lisse de transgènes avec l’expression de la recombinase Cre sous le contrôle des promoteurs. Nous décrivons ici les protocoles utilisant des souris portant des transgènes conditionnelles Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2. Myh11 est le marqueur plus spécifique de la CML19; Cependant, elle est diminuée dans l' aorte de Eln(- / -) 9. Acta2 s’exprime dans les CGS, y compris ceux de l' Eln-aorte null, mais il n’est pas aussi précis parce qu’elle s’exprime aussi dans d’autres types de cellules. Si ces transgènes conditionnels ont été « perméables » (c.-à-d., induire la recombinaison en l’absence du tamoxifène), il pourrait être problématique, car les expériences ne seraient pas délimiter le calendrier de marquage cellulaire. La perméabilité de ces transgènes a été analysée en évaluant l’activité de la bêta-galactosidase en portant une base lacZ Cre journaliste et Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 après un traitement de véhicule ( c'est-à-dire, en l’absence d’induction de tamoxifène)11,12. Selon cette analyse, ces transgènes étaient considérées comme non perméables.

Hypermuscularization caractérise plusieurs pathologies vasculaires chez les humains. Par exemple, sténose aortique supravalvulaire (SVAS) est une affection congénitale dévastatrice qui se caractérise par l’obstruction des grosses et moyennes artères en raison de l’excès SVAS CML. résulte de la perte de fonction d’un allèle du gène ELN et se présente comme une entité isolée ou, plus couramment, dans le cadre de Williams-Beuren syndrome20,21,22,23,24. Cause de souris mutantes ELN(- / -) beaucoup d’aspects du phénotype aortique de SVAS18,21,22. Des explants aortiques provenant d’embryons Eln(- / -) deviennent rapidement occlus durant la culture, alors que les explants de type sauvage embryons restent brevet9,18. L’approche de l’explant aortique facilite la présélection pour les agents qui atténuent la sténose à l’élastine aortopathy9. Cependant, cette approche ne tient pas compte des forces mécaniques ou physiques qui l’aorte est soumis alors que dans le corps. Ainsi, hits positifs au dépistage de l’explant aortique doivent être évaluées avec les modèles de souris mutantes Eln in vivo .

Le protocole d’isolement de SMC est une méthode rapide et robuste pour obtenir les CGS de l’aorte murine périnatale. Une approche similaire peut être extrapolée pour isoler les CGS de souris adultes. En raison de sa taille relativement importante, l’aorte adulte peut être ouvertes longitudinalement et l’adventice et les cellules endothéliales disséqué de suite. Pour évaluer la pureté des cellules isolées de l’aorte périnatale ou adulte, il est important de vérifier l’expression des marqueurs de la SMC (p. ex., CLMML, smoothelin, SM22α et SMA) et le manque d’expression des marqueurs de cellules endothéliales (par exemple, CD31 et cadhérine vasculaire endothéliale). Un potentiel alternatif isolement approche consiste à utiliser des écoulement cytometry d’isoler fluorescent étiqueté CML de l’aorte disséquée. Portant un fluorescent Cre reporter et Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2ou Se-Cre peut être utilisé pour étiqueter fluorescent CML11,12,25, 26,27. Des souris transgéniques existantes avec le promoteur de SMA conduisant à l’expression d’un fluorophore (c.-à-d., GFP, mCherry ou DP) peuvent également être utilisé28,29,30.

Mini-pompes osmotiques implantés sont utilisés pour fournir la prestation continue des agents pharmacologiques aux animaux de laboratoire. Nous avons implanté des mini-pompes chez les souris enceintes à E13.5 de livrer des agents pour les embryons en développement pendant le reste de la période gestationnelle9. Pour rejoindre les embryons, ces agents doivent être en mesure de traverser la barrière placentaire-sang. En général, les mini-pompes sont très bien tolérés et, compte tenu du faible taux d’infection, les antibiotiques courants ne sont pas recommandés. Déhiscence de la plaie est rare ; Toutefois, si une déhiscence supérieure à 4 mm est détectée, la souris doit être re-anesthésiée et la plaie nettoyée et refermée par une suture chirurgicale.

Cet ouvrage décrit une panoplie d’approches qui peut être utilisé pour étudier la formation normale de la paroi aortique embryonnaire et périnatale au cours du développement, ainsi qu’après les perturbations de ce processus au cours de la maladie. En outre, ces protocoles peuvent être appliquées à l’étude l’entretien et les maladies de l’aorte adulte. Approches sont extrapolables aux autres vaisseaux sanguins, ainsi qu’aux structures non vasculaires musculaires lisses enduits, tels que le tube digestif ou des voies respiratoires du poumon. Enfin, des techniques similaires permet d’étudier les types de cellules au-delà de CML, telles que les cellules endothéliales ou les fibroblastes, ainsi que l’interaction entre ces types de cellules et les CGS.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Dean Li pour partage de protocole de son laboratoire pour l’isolement de SMC aortique. Soutien financier a été fourni par le National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 et R01HL133016 à D.M.G), l’American Heart Association (subvention 14GRNT19990019 à usinage mécanique D.M.G.) et l’Université de Yale (Brown-Coxe Fellowship à a.m. et mise en service fonds destinés à l’usinage mécanique D.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon 
 TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory  8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory   026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory   006148 
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory  13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

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References

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Biologie du développement numéro 127 biologie vasculaire aorte cellules musculaires lisses la paroi vasculaire cardiovasculaire médias de tunica souris,
À l’aide de <em>In Vivo</em> et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale
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Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, … More

Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z. Y., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

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