Summary
Protokoll för att studera embryonala och perinatal murina aorta med i vivo klonal analys och öde kartläggning, aorta bladsticklingar och isolerade glatt muskulatur celler är detaljerade här. Dessa olika synsätt underlätta utredningen av morfogenes av embryonala och perinatal aorta i normal utveckling och patogenesen vid sjukdom.
Abstract
Aorta är den största artären i kroppen. Aortaväggen består av ett inre lager av endotelceller, ett mellanlager av omväxlande elastisk lamellerna och glatta muskelceller (SMCs) och ett yttre lager av fibroblaster och extracellulära matrix. I kontrast till den omfattande studien av patologiska modeller (t.ex. åderförkalkning) i vuxen aorta, är mycket mindre känt om embryonala och perinatal aorta. Här fokuserar vi på SMCs och tillhandahålla protokoll för analysen av morfogenes och patogenes för embryonala och perinatal aorta SMCs i normala utveckling och sjukdom. Specifikt, de fyra protokoll som ingår är: jag) i vivo embryonala öde kartering och klonal analys; (II) explant embryonala aorta kultur; (III) SMC isolering från perinatal aorta; och iv) subkutan osmotisk mini pumpen placering hos gravida (eller icke-gravida) möss. Således underlätta dessa synsätt utredningen av den ursprung, öde och klonal arkitektur för SMCs i aorta i vivo. De tillåter för modulerande embryonala aorta morfogenes i livmodern genom kontinuerlig exponering för farmakologiska medel. Dessutom, isolerad aorta vävnad explants eller aorta SMCs kan användas för att få insikter i rollen som specifik gen mål under grundläggande processer såsom muscularization, spridning och migration. Dessa hypotesgenererande experiment på isolerade SMCs och explanterad aorta kan sedan utvärderas i kontexten i vivo genom farmakologiska och genetiska metoder.
Introduction
Cirkulationssystem av flercelliga organismer funktion att leverera näringsämnen och syre till celler som är inte i kontakt med den yttre miljön och att avlägsna slaggprodukter och koldioxid från dessa celler. Hos ryggradsdjur består primära cirkulationssystemet av hjärtat, som pumpar blod genom en serie av blodkärl. Väggarna i stora blodkärl, såsom artärer och vener, består av tre lager: jag) den intima, eller inre lager av endotelceller; II) media eller mellersta lagret av alternerande maskrad långsträckt glatta muskelceller SMCs och elastisk lameller; och iii) den adventitia, eller yttre lager av bindväv och fibroblaster. De allra flesta studier i vaskulär biologi fokus på endotelceller, utreda bildandet av nya endothelial cellen-fodrade rör genom angiogenes. I jämförelse får SMCs relativt lite uppmärksamhet. SMCs är dock en kritisk celltyp i byggandet av normala kärlväggen och i vaskulära sjukdomar.
Aorta är den största-kaliber artären i kroppen, får hjärtminutvolymen från vänster kammare i hjärtat. Det drabbas av olika sjukdomar, däribland åderförkalkning, aneurysm och dissektion. I vuxna organismer studeras aorta och dess större grenar intensivt i modeller av vaskulär sjukdom. Exempelvis hög fett diet utfodras möss som är null för den gen som kodar den LDL-receptorn eller apolipoprotein E, utveckla ateroskleros och senaste öde mappning studier tyder på att befintliga SMCs ger upphov till flera celltyper i den aterosklerotiska plack1. I aortaaneurysm inkluderar patologiska förändringar SMC apoptos och extracellulär matrix remodeling2,3.
Betydligt mindre är känt om SMC morfogenes och patogenes under embryonala och perinatal perioder. Här tillhandahåller vi protokoll för att studera embryonala och perinatal aorta SMCs i vivo, i vävnad bladsticklingar och isolerade celler. Till exempel, skisserar den första delen av protokollet öde kartering och klonal analys i embryonala möss. CRE recombinase uttryckt under kontroll av en cell-specifika promotorn underlättar märkning av specifika celler och deras avkomma4,5,6. men kan temporal kontroll av cell-specifik märkning vara utmanande under embryonalutvecklingen hos möss. I detta sammanhang tillhandahåller med embryon som uttrycker den villkorliga CreER under en promotor som är aktiva i SMCs (e.g.,Myh11 eller Acta2) och Cre reporter, vi metoder för att injicera tamoxifen eller dess aktiva metabolit 4-OH-tamoxifen i gravid dammar och för att analysera märkt cellerna på embryon eller postnatal avkomma. Dessutom, i motsats till öde mappning studier, som huvudsakligen använder Cre reportrar med en enda reporter fluorophore1,7, klonal analys är väsentligen ökat med flerfärgade Cre reportrar.
I andra och tredje avsnitt av protokollet beskrivs metoder för att isolera och odla embryonala aorta bladsticklingar och aorta SMCs från nyfödda, respektive. Dessa synsätt möjliggöra manipulation av signalvägar, särskilt i aorta bladsticklingar eller SMCs, och för att analysera de direkta effekterna av farmakologiska medel. Rollen av specifika gener i vävnaden av intresse kan således undersökas på ett mycket snabbare sätt än genom traditionella genetiska manipulationer hos möss. Dessutom isolerade SMC studierna underlätta analysen av cellmigration och vidhäftning, som är tekniskt begränsad i vivo.
Slutligen, den fjärde protokollenheten skisserar placeringen av en subkutan osmotisk mini pump laddad med farmakologiska agenter i gravid (eller icke-gravida) möss. Denna metod underlättar analysen av effekten på embryonal utveckling orsakas av agenter som kräver kontinuerlig infusion på grund av snabb metabolism. Alternativet att täta injektioner är inte praktiskt för många agenter och bör undvikas, eftersom det kan orsaka betydande obehag i gravid dammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla mus protokoll godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén vid Yale University.
1. In Vivo embryonala öde kartläggning och klonal analys
Obs: vi har använt dessa metoder allmänt för att utvärdera beskärningarna av celler och deras klonal arkitektur i utveckling och sjukdom modeller 7 , 8 , 9 , 10.
- inrätta parning mellan möss med en CreER och möss med Cre reporter.
Obs: En CreER används för SMC märkning. Myh11-CreERT2 eller Acta2-CreERT2 möss 11 , 12 används ofta för detta ändamål. Vi har använt ROSA26R-CreERT2 möss 13 för i stort sett märkning embryonala vävnader.- För klonal analys, använda en flerfärgade Cre reporter (t.ex. konfetti eller Rainbow [Rb] möss) 8 , 14 , 15 och öde kartläggning, använda en Enfärgad Cre reporter (t.ex. ROSA26R-YFP möss 16) eller dubbel-färg Cre reportern ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Obs: Detta avel system använder vuxna möss som är 2-6 månader gamla (allmänt ~ 30 g) och kommer att generera embryon med en CreER och Cre reporter.
- För klonal analys, använda en flerfärgade Cre reporter (t.ex. konfetti eller Rainbow [Rb] möss) 8 , 14 , 15 och öde kartläggning, använda en Enfärgad Cre reporter (t.ex. ROSA26R-YFP möss 16) eller dubbel-färg Cre reportern ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Markerar för vaginal pluggar på morgonen med en metall sond, överväga middagstid samma dag som plug upptäckt som embryonala dag (E) 0,5.
- Separata honan från hanen när en plugg upptäcks.
- Förbered 4-OH-tamoxifen och tamoxifen fungerande lösningar.
- För 4-OH-tamoxifen, lös 5 mg till 50 µL av 100% etanol, virvel för 2 min och sedan lägga till 450 µL av majsolja. På isen, Sonikera output Level 2 för 10 s cykler med vila mellan cykler tills provet kyls ner. Efter provet löses helt (vanligtvis ~ 4-5 cykler av ultraljudsbehandling), ta 200 µL sonicated lösningen och löses upp i 1 800 µL av majsolja att göra slutliga arbetslösning (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
- För tamoxifen, späd till 50 mg/mL 100% etanol och vortex tills det är upplöst. Utspädd i majsolja att göra slutliga arbetslösning (tamoxifen, 10 mg/mL) och rör vid 45 ° C att se till att det är helt upplöst.
- För tidig embryonal induktion, injicera 4-OH-tamoxifen intraperitonealt i en gravid dam.
- Använder 4-OH-tamoxifen injektioner (upp till ~ 150 µg per gravid mus, eller ca 5 mg/kg kroppsvikt) vid E5.5 och därefter som de ge livskraftiga dam, embryon och pups.
- Användning tamoxifen vid doser på 0,5 - 1,5 mg (eller 17-50 mg/kg) för dammar gravid med embryon på ~ E9 och därefter. Använda en 30G nål för alla injektioner.
Obs: Filtrering genom ett 0,22 µm filter är vanligtvis används för att sterilisera alla blandningar före injektion.
- För klonal analys, använda intraperitoneal injektioner av höga doser av 4-OH-tamoxifen (t.ex., 5 mg/kg) eller tamoxifen (t.ex., 50 mg/kg) att markera flera celler.
- Att markera enskilda celler, titrera ner 4-OH-tamoxifen eller tamoxifen dosen så att i vävnaden av intresse (dvs aorta), nästan alla embryon analyseras (som beskrivs nedan i slutet av detta avsnitt) har antingen inga celler märkta eller endast celler av en enda färg; Detta är tröskeldos.
- Att markera celler under perioden mitten slutet graviditetsdiabetes och att spåra deras öde eller clonality i postnatal musen, injicera progesteron i intraperitoneal hålighet i gravid dammen samtidigt med tamoxifen i en 1:2 (progesteron: tamoxifen) baserat på dosen.
Obs: Tamoxifen doser är 17-50 mg/kg och progesteron doser är 8,5-25 mg/kg (dvs. hälften av tamoxifen doser). Progesteron injektionen kan fördröja arbetskraft av ~ 1-2 dagar. - Euthanize dammen gravid med embryon från en önskad ålder med en öppen släpp-metoden, där dammen placeras i ett kärl som innehåller bomull eller gasväv indränkt med outspädd isofluran. Bekräfta död genom att öppna brösthålan för att framkalla pneumotorax, genom att ta bort vitala organ eller genom att utföra cervikal dislokation.
- Rengör buken med 70% etanol. Använd sax för att skära öppna buken och dissekera ut livmodern. Ta bort embryon från livmodern och noggrant separata embryon från moderkakan och gulesäcken använda pincett.
- Euthanize embryona på E15 eller äldre genom att utföra antingen cervikal dislokation eller halshuggning med kirurgisk sax eller en vass kniv.
Obs: Embryon yngre än E15 dör snabbt efter avlivning av mor och/eller avlägsnande av embryon från mor. - Placera embryon i iskall PBS och skär en liten bit av svansen med sax till genotyp för CreER och Cre reportern.
- Fixa embryon i 4% PARAFORMALDEHYD vid 4 ° C i 2 h. Tvätta embryona tre gånger i PBS och sedan odla embryona i 30% sackaros i PBS i 15 mL rör, vänta tills de sjunker, vilket kan ta upp till två dagar.
- Fyllning plast frysning formar upp till 2/3 av maximal nivå med optimal skärtemperatur (ULT) förening. Placera varje embryo vertikalt i formen, helt nedsänkt i OCT. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) för att minimera bubblor.
- Plats frysa vävnad block upprätt i en torris, 70% etanol bad att frysa. Lagra block vid -80 ° C.
- Ställa in kryostaten temperaturen till-22 ° C och skär block för att generera tvärgående sektioner genom hela aorta, 10-20 µm tjock. Torka bilderna på RT för 30 min före lagra dem vid -80 ° C.
- Tina bilderna på RT, skyddade från ljus för att undvika blekning av fluorophores. Tvätta i bilderna med PBS-Tween20 0,1%.
- För klonal analys, färga bilderna för kärnor (DAPI, 5 mg/mL) och direkt bild andra fluorophores i Rainbow Cre reportern (Cerulean: 433-nm excitation max, 475-nm utsläpp max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Använda följande filter för att upptäcka fluorophores med ett upprätt fluorescerande Mikroskop: DAPI (excitation max/bandbredd 350/50 nm, emission max/bandbredd 460/50 nm), Cerulean (excitation 436/20 nm, emission 480/40 nm), texas röd (excitation 560 / 40 nm, emission 630/75 nm) och anpassade filter för att skilja mCherry från mOrange (excitation 577/10 nm, emission 630/50 nm).
- För öde kartläggning med mTmG Cre reporter, upptäcka GFP (484 nm, 510 nm), antingen genom direkt imaging eller använda immunfärgning. För avbildning med ett upprätt fluorescerande Mikroskop använda GFP filter (excitation 470/40 nm, emission 525/50 nm).
- För immunfärgning, inkubera sektioner med primära antikroppar övernattning på 4 ° C, tvätta med 0,1% Triton x-100 i PBS och sedan Inkubera med sekundära antikroppar för 1 h. användning anti-CD31 (slutlig koncentration 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) och Cy3-direkt konjugerade anti-SMA (1: 500 slutspädning) primära antikroppar och använda sekundära antibodies direkt konjugerat till fluorophores (1: 500 slutspädning) (se Tabell för material).
- För klonal analys, färga bilderna för kärnor (DAPI, 5 mg/mL) och direkt bild andra fluorophores i Rainbow Cre reportern (Cerulean: 433-nm excitation max, 475-nm utsläpp max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Bild bilder med ett upprätt fluorescerande Mikroskop (förstoring: 4 X - 20 X) eller confocal Mikroskop (10 X-63 X). För hög förstoring, använda en confocal imaging 63 x olja mål med en numerisk bländare på 1.4-0.6 och en bildstorlek på 1 024 x 1 024 pixlar.
2. Explant embryonala Aorta kultur
Obs: detta tillvägagångssätt användes tidigare för att utvärdera rollen av integrin beta3 i stenos av den explanterad Eln (- / -) embryonala aorta 9 , 18.
- euthanize en timed-gravid-dammen vid E15.5 vid överskott isofluran inandning, enligt steg 1,8, ovan.
- Skörd och avliva embryona, enligt steg 1,9-1.10, ovan.
- Position embryot supinely och pin förlängda armar och ben till dissekering styrelsen. Visualisera med en dissektion stereoskop och använd sax för att klippa ett vertikalt snitt från buken genom bröstbenet till övre bröstkorgen. Dissekera bort tymus, luftstrupe, lungor, matstrupe, levern och tarmen.
- Försiktigt dra hjärtat ventralt med pincett och använda sax för att dissekera aorta från den dorsala delen av bröst och buk. För att frigöra aorta, skär den på roten proximala och de distala buken positionerna.
- Placera aorta i iskall steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i en cell kultur huva. Överföra aorta till en 24-well platta och kultur det i DMEM med 0,5% FBS för upp till 24 h vid 37 ° C.
Obs: Odlingsmediet kan kompletteras med en blockerande antikropp (t.ex. anti-integrin αvβ3 antikropp på 0,02 mg/mL 9, se Tabell för material) eller en farmakologisk agent. - Tvätta aorta två gånger med PBS och sedan fixa det med 4% PARAFORMALDEHYD för 20 min.
- Tvätta tre gånger med PBS och överföring aorta till ett 1,5 mL rör med 30% sackaros i PBS. När aorta sjunker, göra fryst vävnad block, skära sektioner och immunostain, som beskrivs i steg 1.13-1,15, ovan.
3. SMC isolering från Perinatal Aorta
Obs: detta tillvägagångssätt används för närvarande att jämföra biologin av aorta SMCs isolerade från Eln (- / -) och vildtyp perinatal möss.
- Euthanize en murin pup på postnatal dag (P) 0,5, antingen genom cervikal dislokation eller genom halshuggning med kirurgisk sax eller en vass kniv, som beskrivs i steg 1.10, ovan.
- Utför steg 2,3 och sedan, efter öppnandet av bröstkorgen och buken, punktering vänster kammare med 23G nål. Använda plaströr att ansluta nålen till steril PBS-innehållande spruta hölls vertikalt på en upphöjd position så att PBS flödar in i vänster kammare av gravitationen. Ge infusion av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i vänster kammare tills levern blanches.
- Använda pincett för att ta bort adventitial vävnad på utsidan av aorta och dissekera aorta som beskrivs i steg 2,4.
- Smälta aorta i en enda lösning av DMEM (500 µL) kompletteras med 225 U/mL kollagenas och 2,25 U/mL elastase 1 x antibiotikum-antimycotic under 45 minuter vid 37 ° C. manuellt skaka röret varje 5-10 min.
- i sterila cell kultur huven, titurate smält vävnaden genom pipettering upp och ner med en 200-µL pipett att generera en encellig suspension. Överföra encelliga suspensionen till en 15-mL tub, tillsätt 2 mL av DMEM och centrifugera 920 x g för 5 min vid 25 ° C.
- Kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 3 mL odlingsmedium för SMC (DMEM innehållande 10% FBS kompletteras med 1 µg/mL rhFGF, 10 µg/mL rhEGF, 100 U/mL penicillin/streptomycin och 2,5 µg/mL amfotericin B). Överföra till en 35 mm kultur plattan.
Obs: Vid första isolering, ~ 400 000 celler erhålls från en enda P0.5 vildtyp aorta; ~ 300 000 av dessa celler är SMCs. - Odla cellerna vid 37 ° C och ändra till färska SMC odlingsmedium varje 3 dagar. Använder standard tekniker med trypsin, passage cellerna när konfluenta. För experiment, använda celler från passager 3-7.
4. Subkutan osmotisk mini pumpen placering i gravid (eller icke-gravida) möss
Obs: detta tillvägagångssätt användes tidigare för att kontinuerligt leverera en farmakologisk agent (t.ex. integrin β3 och β5-hämmare cilengitide) till embryon i livmodern 9. Pumpen var insatt i gravid dammen på E13.5 och underhållas tills förlossning.
- Söva möss med 2-5% isofluran i syre (flödeshastighet av 1 L/min) för induktion och 1-3% för underhåll. Använd den tå-nypa reflexen för att övervaka nivån på anestesi och justera bedövningsmedel som behövs. Administrera subkutana buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) för analgesi.
- Raka nedre ryggen med clippers. Använd sterila draperier, handskar och instrument och underhålla mössen på en kirurgisk värmeplattan under operation.
- Placera varje mus i liggande position och skrubba ryggen med betadine följt av isopropylalkohol. Ca 3-5 cm rostralt om basen av svansen i nedre delen av ryggen, använda en skalpell för att göra en horisontell huden snitt 0,5 - 1,0 cm i längd utan att skada underliggande muskeln.
- Sätt en hemostat i snittet och skapa en subkutan ficka rostrally för pump implantation av öppning och stängning hemostat jaws.
- Fyller en osmotisk mini pumpen med agenten val, enligt tillverkaren ' s riktlinjer (se Tabell för material). Sätt pumpen fylld i fickan och Stäng snitt med clips eller 6-0 icke-resorberbara suturer. Se till att den totala kirurgiska tid är mindre än 10 min.
- Övervaka postoperativt, möss varje 15 min tills de har återhämtat sig från sternala koordinationsrubbning. Administrera subkutana buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) varje 6-12 h för 48 h. När mössen har återhämtat sig helt från narkos, övervaka dem dagligen. Ta bort klipp eller suturer 7-10 dagar efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en representativ klonal analys av SMCs i embryon mutant för Eln (den gen som kodar extracellulära matrix proteiner elastin), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 möss parades Eln(+/-) möss också bära den flerfärgade ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Som beskrivs i steg 1, pluggar kontrollerades, gravid dammar förmåddes med en enda tamoxifen injektion (1,5 mg) på E12.5 och de offrades på E18.5. Embryon var skördade, fasta, frysta och genotypning. Tvärgående fallande aorta kryosnitt klipptes. Sektioner från Eln(+/-), Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb / +) embryon indikerar att det överskjutande inre lagret SMCs som ackumuleras i Eln-null möss (start efter E15.5) markeras av flera färger ( Figur 1) och därmed härleda från flera alpha-smooth muscle aktin (SMA)+ celler som är närvarande vid ~ E12.5. I E12.5 aorta är SMA+ celler begränsad till tunica media.
För att generera Eln(- / -) embryonala artärer för bladsticklingar, hane och hona parades Eln(+/-) möss. Använda metoder som beskrivs i steg 2, pluggar kontrollerades och gravid Eln(+/-) dammar offrades på E15.5. Artärer isolerades från Eln(- / -) embryon och odlade för 0 eller 18 h i närvaro av en anti-integrin β3 blockering antikropp eller en IgG1-kontroll. Artärer fastställdes sedan, frusen, och cryosectioned och kryosnitt var färgas för SMA (SMC markör), CD31 (endotelceller markör), och atomkärnor (DAPI) (figur 2). Resultaten visar att inom 18 h av odling, E15.5/Eln(- / -) aorta blir hypermuscular och stenotiska. Denna process är försvagad genom en anti-integrin β3 blockerande antikropp.
SMCs isolerades från aorta av vildtyp möss vid P0.5. Som beskrivs i steg 3, SMCs var isolerade från dissekerade neonatal aorta av enzymet matsmältning och odlade. Cellerna var anpassade, och passagen 3 celler var målat för SMC markörer (dvs, SMA, glatt muskulatur myosin heavy chain (SMMHC) eller transgelin (även känd som SM22α)), CD31 och atomkärnor (DAPI) (figur 3). De flesta av de odlade cellerna express SMC markörer men inte CD31.
För att utvärdera infunderas huruvida farmakologisk hämning av integrin β3 kan dämpa hypermuscularization och stenos av Eln(- / -) aorta i vivovi kontinuerligt den hämmare cilengitide på grund av dess korta halveringstid i plasma. Eln(+/ −) hanar och honor parades, och, som beskrivs i steg 4, osmotisk mini-pumpar laddad med cilengitide var implanteras i gravid fördämningar på E13.5. På P0.5, pups var euthanized och genotypning, och deras artärer analyserades. Cilengitide behandling dämpar signifikant aortastenos och hypermuscularization i Eln(- / -) möss (figur 4) utan att ändra den vildtyp aorta9. Anti-integrin β3 är alltså en potentiellt lovande icke-invasiv metod att behandla elastin aortopathy.
Figur 1 . Överskjutande SMCs i Eln(- / -) Aorta härleda från flera befintliga SMCs. Dammar gravid med Eln(- / -), Acta2-CreERT2 embryon som också bär multicolor Cre reportern ROSA26R(Rb / +) förmåddes med en intraperitoneal injektion av tamoxifen (1,5 mg) på E12.5. Dammar offrades på E18.5 och tvärgående delar av de fallande artärer av embryon analyserades, med färgning för DAPI och den direkta fluorescensen av Rb färger, Cerulean (Cer), mCherry (mCh) och mOrange (mOr). Överskjutande SMCs ackumuleras i det inre aspekten av Eln-null aorta efter E15.518. De överskjutande inre lager SMCs inkluderar celler av flera färger (asterisker), som anger polyclonality. Lu, aorta lumen. Skalstapeln, 10 µm. Reprinted från Misra et al., 20169. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Anti-αvβ3 Integrin blockad dämpar Hypermuscularization och stenos av Eln(- / -) aorta Explant. Vid E15.5, gravid dammar var euthanized och artärer av Eln(- / -) embryon skördades. Isolerade artärer antingen fasta omedelbart eller odlade i närvaro av kontrollen isotypen IgG1 eller en integrin αvβ3 blockerande antikropp för 18 h före fixering. Fast artärer var färgas för CD31, SMA och atomkärnor (DAPI). Lu, aorta lumen. Skalstapeln, 100 µm. Reprinted från Misra et al., 20169. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Isolerade och odlade aorta SMCs från neonatala möss Express muskulatur markörer. SMCs var isolerade från P0.5 ungar och odlade. Celler från tredje passage var fixeras och färgas för CD31 (EG markör), kärnor (DAPI), och en SMC-markör (SMA, SM22α, eller SMMHC, som anges). Denna analys indikerar att ~ 90% av de odlade cellerna express SMC markörer, och ingen observerades för att uttrycka CD31. Skala bar, 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Kontinuerlig Infusion av Cilengitide In Vivo dämpar Eln(- / -) Aorta Hypermuscularization och stenos. Manliga och kvinnliga Eln(+/-) möss korsades. Den integrin β3-hämmare cilengitide eller fordon (PBS) var kontinuerligt infunderas i gravid dammar med osmotisk mini-pumpar börjar på E13.5. Tvärgående sektioner vid P0.5 var färgas för SMA (röd), CD31 (vit) och atomkärnor (DAPI, blå). Lu, aorta lumen. Skalstapeln, 100 µm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I kontrast till de omfattande utredningarna av murina aorta och dess större grenar i vuxen sjukdomstillstånd, såsom modeller för åderförkalkning, är mindre känt om morfogenes och patogenesen av embryonala och perinatal aorta. Här, vi fokuserar på embryonal/perinatal aorta, särskilt SMCs, och tillhandahåller protokoll för att studera aorta genom in-vivo, vävnad explant, och SMC isolering strategier. Dessa gratis synsätt ger utredaren med olika metoder att studera embryonala/perinatal aorta.
Klonal analys är en mycket kraftfull metod som gör att man kan undersöka beteendet hos enskilda celler. Vi har nyligen använt denna metod för att identifiera specialiserade SMCs i pulmonell kärlsystemet10. Det är viktigt att erkänna att, i en individuell mus bär flerfärgade Cre reporter, det finns en chans att celler av samma färg kan härleda från fler än en rekombination händelse. Således kräver klonal analys med flerfärgade reporter utvärderingen av många möss. Eftersom tamoxifen under perioden mitten slutet graviditetsdiabetes kan störa förlossning, för experiment som markera celler under perioden mitten slutet graviditetsdiabetes och spåra dem efter födseln, ska progesteron och tamoxifen injiceras samtidigt. Liknar protokoll i embryot, öde kartering och klonal analys av celler i vuxen mus kan ske med intraperitoneal injektion av tamoxifen i vuxen.
Klonal analys och öde kartläggning av SMCs använder möss bära transgener med uttryck för Cre recombinase under kontroll av initiativtagare med ökad aktivitet i den glatta muskulaturen. Här beskriver vi protokoll använder möss bära villkorlig transgener Myh11-CreERT2 - eller Acta2-CreERT2. Myh11 är den mest specifika markören SMCs19; Det är dock nedreglerade i Eln(- / -) aorta9. Acta2 uttrycks i SMCs, inklusive de av Eln-null aorta, men det är inte så specifik eftersom det uttrycks också i andra celltyper. Om dessa villkorlig transgener var ”läckande” (dvs, framkalla rekombination i avsaknad av tamoxifen), det kan vara problematiskt, eftersom experimenten inte skulle avgränsa tidpunkten för cell märkning. Leakiness av dessa transgener analyserades genom att bedöma beta-galaktosidas aktivitet hos möss som bär Lindholm-baserade Cre reporter och antingen Myh11-CreERT2 eller Acta2-CreERT2 efter fordonet behandling ( dvs, i avsaknad av tamoxifen induktion)11,12. Baserat på denna analys, ansågs dessa transgener inte läckande.
Hypermuscularization karakteriserar flera vaskulära sjukdomar hos människor. Supravalvular aortastenos (SVAS) är exempelvis en förödande medfödda tillstånd som kännetecknas av obstruktion av stora och medelstora artärer på grund av överskott SMCs. SVAS resultat från förlust av funktion i en allel av ELN -genen och förekommer som en isolerad enhet eller, mer allmänt, som en del av Williams-Beuren syndrom20,21,22,23,24. ELN(- / -) muterade möss phenocopy många aspekter av aorta fenotypen av SVAS18,21,22. Aorta bladsticklingar från Eln(- / -) embryon blir snabbt ockluderas under kultur, medan bladsticklingar från vildtyp embryon kvar patent9,18. Metoden aorta explant underlättar screening för agenter som dämpa stenos i elastin aortopathy9. Dock tar detta tillvägagångssätt inte hänsyn till de mekaniska eller fysiska krafter som aorta är underställd medan i kroppen. Således, positiva träffar i aorta explant screening bör bedömas med invivo Eln mutant musmodeller.
SMC isolering protokollet är en snabb och robust metod att få SMCs från perinatal murina aorta. Ett liknande tillvägagångssätt kan extrapoleras för att isolera SMCs från vuxna möss. På grund av sin relativt stora storlek, vuxen aorta kan öppnas längdriktningen och den adventitia och endotelceller dissekeras bort. Utvärdera renheten hos de celler som isolerats från perinatal eller vuxen aorta, är det viktigt att kontrollera för uttrycket av SMC markörer (t.ex. SMMHC, smoothelin, SM22α och SMA) och avsaknaden av uttryck av endotelceller markörer (t.ex. CD31 och vaskulär-endothelial cadherin). En potentiell alternativ isolering metod är att använda flödescytometri att isolera fluorescently märkt SMCs från dissekerade aorta. Möss som redovisade en fluorescerande Cre reporter och Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2, eller Tgln-Cre kan användas för att fluorescently etikett SMCs11,12,25, 26,27. Alternativt kan befintliga transgena möss med SMA promotorn körning uttrycket av en fluorophore (dvs, GFP, mCherry eller RFP) vara används28,29,30.
Implanterade osmotisk mini-pumpar används för att ge kontinuerlig leverans av farmakologiska agenter till försöksdjur. Vi har implanterats mini-pumpar hos dräktiga möss på E13.5 att leverera agenter till utveckla embryon under resten av graviditetsdiabetes perioden9. För att nå embryona, måste sådana agenser kunna passera blod-placentabarriären. I allmänhet, mini-pumpar tolereras mycket väl och, med tanke på den låga andelen infektion, rekommenderas inte rutinmässigt antibiotika. Såret sårruptur är sällsynt; dock om en sårruptur som är större än 4 mm upptäcks, musen bör åter sövda och såret rengöras och stängas igen med en kirurgisk sutur.
Detta arbete beskriver en arsenal av metoder som kan användas för att studera normala bildandet av embryonala och perinatal aortaväggen under utveckling, samt efter störningar i denna process under sjukdom. Dessutom kan dessa protokoll tillämpas studera underhåll och sjukdom i vuxen aorta. Metoder kan extrapoleras till andra blodkärl samt till glatt muskulatur-belagd icke-vaskulära strukturer, såsom mag-tarmkanalen eller lung luftvägarna. Slutligen, liknande tekniker kan användas för att studera celltyper bortom SMCs, såsom endotelceller eller fibroblaster, samt samspelet mellan dessa celler typer och SMCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dean Li för att dela hans laboratoriets protokoll för aorta SMC isolering. Finansiering av stöd tillhandahölls av National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 och R01HL133016 till D.M.G), American Heart Association (bidrag 14GRNT19990019 till D.M.G.), och Yale University (Brown-Coxe gemenskap till A.M. och start medel till D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
