Summary
Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.
Abstract
Aort vücuttaki en büyük arter olduğunu. Aort duvar endotel hücrelerinin bir iç tabaka, elastik lamellae ve düz kas hücreleri (SMCs) alternatif bir orta katman ve fibroblastlar ve hücre dışı matriks ki dış tabakası oluşur. Patolojik modellerinde (Örneğin, ateroskleroz) Yetişkin aort yaygın bir çalışma aksine, embriyonik ve perinatal aort hakkında daha az bilinir. Burada, SMCs üzerinde ele ve embriyonik ve perinatal aort SMCs normal gelişim ve hastalığın patogenezi ve morfogenetik analizi için iletişim kuralları sağlar. Özellikle, dahil dört protokolü şunlardır: Ben) vivo embriyonik kader haritalama ve klonal analizi; II) embriyonik aort kültür explant; III) perinatal aort SMC izolasyon; ve IV) hamile (veya gebe olmayan) farelerde subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme. Böylece, bu yaklaşımlar origin(s), kader ve klonal SMCs mimarisinde aort içinde vivoincelenmesi kolaylaştırmak. Onlar sürekli maruz farmakolojik embriyonik aort morfogenez rahim içinde oransal için sağlar. Buna ek olarak, izole aort dokusu explants veya aort SMCs muscularization, nükleer silahların yayılmasına karşı ve göç gibi temel süreçler sırasında belirli bir gen hedefleri rolüne anlayışlar kazanmak için kullanılabilir. Bu hipotez oluşturma deneyler izole SMCs ve explanted aort sonra vivo içinde bağlamında farmakolojik ve genetik yaklaşımlar ile tespit edilebilir.
Introduction
Hücrelere besin ve oksijen sağlamak için çok hücreli organizmalar işlevinin dolaşım sistemi bu değil dış çevre ile temas ve atık ürünlerin ve karbon dioksit bu hücrelerdeki kaldırmak için vardır. Omurgalılar, birincil dolaşım sistemi hangi pompalar kan damarlarının bir dizi sayesinde kan kalp oluşur. Atar ve toplar damarlardaki, gibi büyük kan damarlarının duvarlarında üç katmandan oluşur: Ben) intima veya iç tabaka endotel hücre; II) medya veya Orta tabaka, çepeçevre alternatif düz kas hücreleri SMCs ve elastik lamellae uzamış; ve III) adventitia veya bağ dokusu ve fibroblastlar dış tabakası. Vasküler Biyoloji çalışmalarda büyük çoğunluğu yeni endotel hücre kaplı borular aracılığıyla angiogenez oluşumu soruşturma endotel hücreleri üzerinde odaklanın. Buna karşılık, nispeten az ilgi SMCs alırsınız. Ancak, SMCs normal Arteryel duvar inşası ve vasküler patolojiler kritik hücre tipi vardır.
Aort vücuttaki kalp sol ventrikül kardiyak çıkış alma en büyük kalibreli arter olduğunu. Ateroskleroz, anevrizma ve diseksiyona dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları dertli. Yetişkin canlılar arasında aorta ve büyük dalları yoğun damar hastalığı modellerinde incelenmektedir. Örneğin, düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör veya apolipoprotein E, kodlama gen için boş olan fareler beslenen yüksek yağlı diyet geliştirmek ateroskleroz ve kader eşleme çalışmalar gösterir önceden varolan SMCs birden fazla hücre türü için neden olmaktadır aterosklerotik plak1. Aort Anevrizmalarının patolojik değişiklikler SMC Apoptozis ve hücre dışı matriks2,3remodeling içerir.
Önemli ölçüde daha az embriyonik ve perinatal dönemlerinde SMC morfogenez ve patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, embriyonik ve perinatal aort SMCs vivo içindedoku explants ve izole hücreler eğitimi için protokolleri sağlamak. Örneğin, protokol ilk bölümünü kader haritalama ve embriyonik farelerde klonal analiz delineates. Cre recombinase bir hücre özgü organizatörü kontrolü altında ifade belirli hücreleri işaretleme ve onların döl4,5,6kolaylaştırır; Ancak, farelerde embriyonik gelişim sırasında cep özel etiketleme zamansal kontrol zor olabilir. Bu bağlamda, bir organizatörü SMCs (e.g.,Myh11 veya Acta2) ve Cre muhabir etkin altında koşullu CreER ifade embriyo ile biz tamoxifen veya onun aktif metaboliti 4-OH-tamoxifen hamile barajlar içinde enjekte için yöntemleri sağlar ve embriyo veya postnatal çoluk çocuk etiketli hücreleri analiz etmek için. Ayrıca, hangi çoğunlukla Cre gazetecilere bir tek gazeteci fluorophore1,7ile kullanmak, kader Haritalama çalışmaları aksine, klonal analiz önemli ölçüde çok renkli Cre gazetecilere ile zenginleştirilmiştir.
İletişim kuralı ikinci ve üçüncü bölümlerde izole edip embriyonik aort explants ve gelen ventilasyon, aortik SMCs sırasıyla kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yaklaşımlar sinyal yollar, özellikle aort explants veya SMCs, manipülasyon ve farmakolojik ajanların doğrudan etkileri analiz etmek için izin verir. Böylece, faiz dokusunun belirli genlerin rol farelerde geleneksel genetik manipülasyon yoluyla çok daha hızlı bir biçimde tarandı. Buna ek olarak, izole SMC çalışmalar hücre göç çözümlemesini kolaylaştıran ve teknik olarak yapışma içinde vivosınırlı.
Son olarak, dördüncü protokol bölümünde subkutan ozmotik Mini pompa hamile (veya gebe olmayan) farelerde farmakolojik ajanlar ile yüklenen yerleşimini delineates. Bu yöntem embriyonik gelişme hızlı metabolizma nedeniyle sürekli infüzyon gerektiren ajanlar nedeniyle üzerindeki etkisinin analizi kolaylaştırır. Sık iğne alternatif birçok ajanlar için pratik değildir ve o hamile baraj önemli rahatsızlık neden olabilir, kaçınılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm fare protokolleri kurumsal hayvan bakım ve Yale Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanan.
1. In Vivo kader embriyonik eşleme ve klonal analizi
Not: Biz bu yaklaşımlar yaygın olarak hücreleri ve geliştirme ve hastalık modelleri klonal mimarileri kökenleri değerlendirmek için kullandık 7 , 8 , 9 , 10.
- ayarla bir CreER ile fareler ve fareler Cre muhabir ile arasında çiftleşme.
Not: Bir CreER işaretleme SMC için kullanılır; Myh11-CreERT2-Acta2-CreERT2 fareler 11 , 12 yaygın olarak bu amaç için kullanılır. ROSA26R-CreERT2 fareler 13 geniş embriyonik doku işaretlemek için kullandık.- Klonal analizi, bir çok renkli Cre muhabir (Örneğin, konfeti veya Rainbow [Rb] fareler) 8 , 14 , 15 kullanın ve kader eşleme için bir tek renkli Cre muhabir (Örneğin, ROSA26R-YFP fareler 16) veya çift renkli Cre muhabir ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
Not: Bu üreme düzeni 2-6 ay yaşlı (genellikle ~ 30 g) ve bir CreER ve Cre muhabir ile embriyo üretecektir yetişkin fareler kullanır.
- Klonal analizi, bir çok renkli Cre muhabir (Örneğin, konfeti veya Rainbow [Rb] fareler) 8 , 14 , 15 kullanın ve kader eşleme için bir tek renkli Cre muhabir (Örneğin, ROSA26R-YFP fareler 16) veya çift renkli Cre muhabir ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
- Kontrol için sabahları bir metal kullanarak vajinal prizler yoklama ve fiş algılama embriyonik gün (E) 0.5 olarak gün öğlen vakti düşünün.
- Bir fiş algılandığında erkek erkeğe ait ayırın.
- Hazırla 4-OH-Tamoksifen ve Tamoksifen çalışma çözümleri.
- 5 mg 50 µL % 100 etanol, 2 dk için girdap içine 4-OH-tamoxifen için dağıtılması ve sonra mısır yağı 450 µL ekleyin. Buz üzerinde örnek soğuduktan kadar döngüleri arasında dinlenme ile 10 s döngüleri için 2 çıktı düzeyinde solüsyon içeren temizleyicide. Örnek tamamen çözülmüş sonra (genellikle ~ sonication döngüleri 4-5), sonicated çözüm 200 µL almak ve mısır yağı final çalışma çözüm (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL) yapmak için 1.800 µL içinde erimesi.
- Kadar bu çözülür tamoxifen için 50 mg/ml % 100 etanol ve girdap oranında seyreltin. Mısır yağı final çalışma çözüm (tamoxifen, 10 mg/mL) yapmak ve 45 ° C tamamen çözülmüş emin olmak için heyecan içinde seyreltik.
- Erken embriyonik indüksiyon için 4-OH-Tamoksifen intraperitoneally hamile bir baraj enjekte.
- 4-OH-tamoxifen enjeksiyonları (~ 150 µg hamile fare veya kabaca 5 mg/kg vücut ağırlığı başına) kullanmak E5.5 ve bundan sonra onlar uygun Barajı, embriyo ve pups verim.
- Kullanım tamoxifen dozda 0,5 - 1,5 mg (veya 17-50 mg/kg) için barajlar embriyo ile hamile ~ E9 ve bundan sonra. Tüm enjeksiyonlar için 30 G iğne kullanın.
Not: 0,22 µm filtre aracılığıyla filtreleme genellikle enjeksiyon öncesinde tüm karışımları sterilize etmek için kullanılır.
- 4-OH-tamoxifen (örneğin, 5 mg/kg) veya tamoxifen (örneğin, 50 mg/kg) birden çok hücre işaretlemek için yüksek dozda mayi enjeksiyonlari klonal analizi için kullanın.
- Tek tek hücreler mark, faiz (Yani, aorta) doku içinde hemen hemen tüm embriyoların (aşağıda bu bölümün sonunda açıklandığı gibi) analiz hiçbir etiketli hücreleri veya yalnızca hücreleri sahip olduğunu 4-OH-tamoxifen veya tamoxifen doz titre için
- tek bir rengi; Bu eşik doz ise.
- Orta-geç gebelik döneminde hücreleri işaretlemek ve onların kaderi ya da doğum sonrası Mouse, clonality izlemek için progesteron hamile Barajı mayi boşluğuna kullanılazlar ile tamoxifen bir 1:2 (progesteron: tamoxifen) enjekte doz oranı.
Not: Tamoxifen dozlarda 17-50 mg/kg ve progesteron dozlarda 8.5-25 mg/kg (Yani, Tamoksifen dozlarda yarısı). Progesteron enjeksiyon emek ~ 1-2 gün gecikme olabilir. - Euthanize Baraj Baraj pamuk veya gazlı bez içeren bir receptacle yerleştirildiği bir açık bırak yöntemini kullanarak istenen bir yaş embriyo ile hamile ile su katılmamış isoflurane batırılmış. Pnömotoraks ikna etmek için göğüs boşluğu açarak, hayati organları kaldırarak, ve/veya servikal çıkığı yaparak ölüm onaylayın.
- Karın % 70 etanol ile temiz. Makas karın kesip açmak ve rahim incelemek için kullanın. Embriyoların rahim kaldır ve dikkatle embriyo plasenta ve sarısı sac forseps kullanarak ayrı.
- Servikal yerinden çıkması veya Cerrahi makas ile işten çıkarma veya keskin bir bıçak gerçekleştirerek embriyo E15 veya büyük ötenazi.
Not: Ötenazi anne ve/veya anneden embriyo kaldırılmasını takiben embriyo E15 genç hızla öldü. - Buz gibi PBS embriyo yerleştirin ve kuyruk CreER ve Cre muhabiri genotip için makas kullanarak küçük bir parça kesti.
- Embriyo üç kez PBS 2 h. yıkama için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde embriyo düzeltmek ve PBS içinde % 30 Sükroz 15 mL tüpler hangi-ebilmek almak ilâ iki gün onlar kadar beklemeniz, embriyo kuluçkaya. Buz gibi
- dolgu plastik 2/3 maksimum seviyede en iyi kesim ısı (OCT) bileşik kalıplar. Her embriyo Ekim Incubate kabarcıklar en aza indirmek için (RT) oda sıcaklığında 10 dakika tamamen sular altında kalıp, dikey olarak yerleştirin.
- Doku bloklar bir kuru buzun içinde donmak % 70 etanol banyo dik dondurma yer. -80 sokak depolamak ° C.
- -22 ° C-cryostat sıcaklığı ayarlamak ve blok aracılığıyla tüm aort, 10-20 µm kalınlığında transvers bölümler oluşturmak için kesti. RT, slaytlar 30 dk önce bunları-80 saklamak için Kuru ° C.
- RT, fluorophores ağartma önlemek için ışıktan korunan, slaytlar çözülme. PBS-Tween20 ile slaytlar % 0,1 yıkayın.
- İçin klonal analizi, çekirdeği (DAPI, 5 mg/mL) slaytlarını leke ve doğrudan diğer fluorophores gökkuşağı Cre muhabir olarak görüntü (gök mavisi: 433-nm uyarma max, 475-nm emisyon max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Fluorophores ile dik bir floresan mikroskop saptamak için aşağıdaki filtreleri kullanın: DAPI (uyarma max/bant genişliği 350/50 nm, emisyon max/bant genişliği 460/50 nm), Cerulean (uyarma 436/20 nm, emisyon 480/40 nm), Teksas kırmızı (uyarma 560 / 40 nm, emisyon 630/75 nm) ve mCherry (uyarma 577/10 nm, emisyon 630/50 nm) mOrange ayırmak için özel filtre.
- MTmG Cre reporter ile kader eşleme için GFP tespit (484 nm, 510 nm), doğrudan görüntüleme veya immunostaining kullanarak. GFP filtre (uyarma 470/40 nm, emisyon 525/50 nm) dik bir floresan mikroskobu ile görüntülemede kullanılmak.
- İmmunostaining için birincil antikorlar gecede 4 ° C'de bölümlerle kuluçkaya, PBS Triton X-100 %0,1 ile yıkayın ve 1 h. kullanım anti-CD31 için ikincil antikorlar ile kuluçkaya (son konsantrasyon 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) ve Cy3-doğrudan konjuge anti-SMA (1:500 son seyreltme) birincil antikorlar ve kullanım ikincil antibodie(bkz: Malzemeler tablo) fluorophores (1:500 son seyreltme) doğrudan Birleşik s.
- İçin klonal analizi, çekirdeği (DAPI, 5 mg/mL) slaytlarını leke ve doğrudan diğer fluorophores gökkuşağı Cre muhabir olarak görüntü (gök mavisi: 433-nm uyarma max, 475-nm emisyon max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
- Görüntü slaytlar ile dik bir floresan mikroskobu (büyütme: 4 X - 20 X) veya confocal mikroskop (10 X-63 X). Yüksek büyütme için bir confocal görüntüleme 63 petrol amaç x 1.4-0,6 sayısal bir diyafram ve bir çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel kullanın.
2. Embriyonik aort kültür explant
Not: Bu yaklaşım daha önce explanted, stenoz integrin beta3 rolü değerlendirmek için kullanılan Eln (- / -) embriyonik aort 9 , 18.
- E15.5 zaman aşımına uğradı-hamile bir barajın başı olarak adım 1.8, aşırı isoflurane Solunduğunda yukarıda ötenazi.
- Hasat ve yukarıdaki adımları 1.9-1.10, göre embriyo ötenazi.
- Embriyo supinely konumlandırın ve genişletilmiş bacaklarda diseksiyon kurulu pin. Diseksiyon stereoscope ile görselleştirin ve karın ile göğüs kemiği üzerinden bir dikey kesi üst Toraks için kesmek için makas kullanın. Uzak teşrih timus, nefes borusu, akciğerler, yemek borusu, karaciğer ve bağırsak.
- Yavaşça ventrally forseps kullanarak kalp çekin ve aort damarı torasik ve abdominal boşluklar dorsal yönünü uzak incelemek için makas kullanın. Aort serbest bırakmak için proksimal kök ve distal karın pozisyonlar kesmek.
- Buz gibi steril PBS bir hücre kültür başlıklı aort yerleştirin. Aort 24-şey plakasına aktarmak ve %0,5 ile DMEM içinde kültür FBS için en fazla 24 saat 37 ° c
Not: Kültür orta bir engelleme antikor (Örneğin, anti-integrin αvβ3 antikor 0,02 mg/mL 9; bkz: Malzemeler tablo) veya farmakolojik ajan ile takıma girebilir. - İki kez PBS ile aort yıkama ve sonra 20 dakika süreyle %4 paraformaldehyde ile tamir PBS içinde
- yıkama üç kez ile PBS ve transfer 1.5 mL tüp % 30 ile aort Sükroz. Aort lavabo sonra donmuş doku blokları, kesim bölümler ve immunostain, adımları 1,13-1.15, yukarıda açıklandığı gibi olun.
3. Perinatal aort SMC izolasyon
Not: Bu yaklaşım aort SMCs Eln (- / -) ve wildtype perinatal fareler izole Biyoloji karşılaştırmak için kullanılmakta olan.
- Bir fare kuçu kuçu postnatal gününde (P) 0.5, servikal yerinden çıkması veya Cerrahi makas ile işten çıkarma veya adım 1.10, açıklandığı gibi keskin bir bıçak yukarıda Euthanize.
- Adım 2.3 gerçekleştirmek ve daha sonra göğüs ve karında açtıktan sonra sol ventrikül ile 23 G iğne ponksiyon. PBS yerçekimi tarafından sol ventrikül akması için PBS içeren steril enjektör iğne bağlanmak için plastik boru kullanım dikey olarak yükseltilmiş bir konumda düzenlenen. Karaciğer blanches dek steril PBS infüzyonu sol ventrikül içine izin veremeyiz.
- Aort dışındaki adventitial dokuyu ve aort 2.4 adımda anlatıldığı gibi incelemek için forseps kullanın.
- DMEM tek bir çözüm içinde aort sindirmek (500 µL) takıma 225 U/mL collagenase, 2.25 U/mL elastase ve 1 x antibiyotik-antimycotic 45 dk az 37 ° c el sallamak için tüp her 5-10 dakika
- Steril hücre kültür Hood, titurate yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için 200-µL pipet ile pipetting tarafından sindirilmiş doku. Tek hücreli süspansiyon 15 mL tüp transfer DMEM 2 mL ekleyin ve santrifüj kapasitesi 920 x g 25 5 min için de ° C.
- Süpernatant atmak. Hücre Pelet SMC kültür ortamının (1 µg/mL rhFGF, 10 µg/mL rhEGF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2,5 µg/mL Amfoterisin B ile FBS takıma % 10 içeren DMEM) 3 ml resuspend. Aktarım için 35-mm kültür plaka.
Not: ilk yalıtım tek bir P0.5 wildtype aort ~ 400.000 hücre elde edilir; ~ 300.000 bu hücrelerin çoğu SMCs. - 37 ° C'de hücreler kültür ve her 3 günde taze SMC kültür Orta olarak değiştirin. Tripsin ile standart yöntemlerle, hücreleri konfluent ne zaman geçiş. Deneyler için pasajlar 3-7 hücrelerden kullanın.
4. Subkutan ozmotik Mini pompa yerleştirme hamile (veya sigara hamile) fareler
Not: Bu yaklaşım daha önce sürekli farmakolojik ajan (Örneğin, integrin β3 ve β5 inhibitörü teslim etmek için kullanılan cilengitide) embriyo rahimde 9. Pompa E13.5 hamile barajın takılı ve doğum kadar saklanır.
- Anestezi ile oksijen (debisi 1 L/dak) indüksiyon ve bakım için 1-%3 2-%5 isoflurane fareler. Toe-çimdik refleks anestezi düzeyini izlemeniz için kullanın ve anestezik Ajan gerektiği gibi ayarlayın. Subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) analjezi için yönetmek.
- Alt sırt makasları ile tıraş. Steril örtüler, eldiven ve aletleri kullanmak ve ameliyat sırasında fareler Isıtma cerrahi tabakta korumak.
- Yer her fare yüzükoyun sígara ve arka izopropil alkol tarafından takip betadin ile fırçalayın. Yaklaşık 3-5 cm alt sırt, kuyruk tabanına rostral bir yatay cilt kesi 0.5 - 1.0 cm uzunluğunda temel kas ağır yaralı olmadan yapmak için bir neşter kullanın.
- Bir hemostat belgili tanımlık kesme takıp subkutan bir cep rostrally pompa implantasyon için açılış ve kapanış hemostat jaws oluşturabilirsiniz.
- Doldurmak bir ozmotik Mini pompa seçim, üretici göre Ajan ile ' s yönergeleri (bkz: Malzemeler tablo). Dolu pompa cep içine yerleştirin ve belgili tanımlık kesme klipleri veya 6-0 absorbe olmayan dikiş ile kapatın. Toplam cerrahi saat 10 dk. daha az olduğundan emin Sternal recumbency ele geçirdiler kadar
- post-operatively, fareler her 15dk izlemek. Subkutan buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) her 6-12 h 48 h için yönetmek. Fareler genel anestezi tamamen iyileşti, onları her gün izlemek. Küçük resimleri kaldırmak veya 7-10 gün ameliyat sonrası tasarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir temsilci klonal analizinde SMCs içinde embriyo mutant Eln (hücre dışı matriks proteini elastin kodlama gen) için Eln(+/-), Acta2-CreERT2 fareler de taşıyan Eln(+/-) fareler için şeklindeki çok renkli ROSA26R(Rb/Rb) muhabir. 1. adımda açıklandığı gibi bujileri kontrol edildi, hamile baraj E12.5 adlı bir tek tamoxifen enjeksiyon (1.5 mg) ile indüklenen ve onlar E18.5 kurban edildi. Embriyo hasat, sabit, dondurulmuş ve genotyped vardı. Aort cryosections azalan enine kesilmiş. Eln(+/-), Acta2-CreERT2, bölümlerden ROSA26R(Rb / +) embriyo göstermek aşırı iç tabaka SMCs bu Elniçinde birikir-null fareler (E15.5 sonra başlayan) birden çok renk () tarafından işaretlenir Şekil 1) ve bu nedenle, mevcut olan hücreler birden çok alfa-düz kas aktin (SMA)+ türetme yapıp yapmayacağınızı ~ E12.5. E12.5 aort SMA+ hücreleri tunica medyaya sınırlıdır.
ELN(- / -) embriyonik aortas explants, kadın ve erkek için oluşturmak için fare Eln(+/-) şeklindeki. 2. adımda açıklanan yöntemleri kullanarak, bujileri kontrol ve hamile Eln(+/-) baraj E15.5 kurban edildi. Aortas Eln(- / -) embriyolar izole edildi ve 0 veya 18 h bir anti-integrin β3 varlığında antikor veya Igg1 denetimini engelleme için kültürlü. Aortas o zaman sabit, dondurulmuş, ve cryosectioned ve cryosections SMA (SMC marker), lekeli CD31 (endotel hücre işaretçisi) ve çekirdek (DAPI) (Şekil 2). Kültür 18 h içinde hypermuscular E15.5/Eln(- / -) aort olur sonuçları göstermek ve stenotic. Bu işlem tarafından bir anti-integrin β3 engelleyen antikor zayıflatılmış.
SMCs P0.5, wildtype farelerin aort yalıtılmış. 3. adımda açıklandığı gibi SMCs disseke yenidoğan aort enzim sindirim tarafından izole edildi ve kültürlü. Hücreleri pasajlı, ve geçiş 3 hücreleri CD31 ve çekirdeği (DAPI) (şekil 3) SMC işaretçileri için (Yani, SMA, düz kas myosin ağır zincir (SMMHC) veya transgelin (Ayrıca SM22α da bilinir)), lekeli. Kültürlü hücrelerin çoğu SMC işaretleri ama değil CD31 hızlı.
Değerlendirmek için farmakolojik integrin β3 inhibisyonu hypermuscularization ve Eln(- / -) aort vivo içindebiz sürekli stenoz azaltmak inhibitörü cilengitide nedeniyle onun kısa yarılanma infüzyon plazmada. Eln(+/ −) kadın ve erkek şeklindeki ve adım 4'te açıklandığı gibi ozmotik mini-pompalar ile cilengitide yüklü E13.5, hamile barajlar implante edildi. P0.5, pups euthanized ve genotyped ve onların aortas analiz edildi. Cilengitide tedavi önemli ölçüde aortik stenoz ve hypermuscularization farelerde Eln(- / -) (şekil 4) wildtype aort9değiştirmeden zayıflar. Böylece, anti-integrin β3 elastin aortopathy tedavi etmek için potansiyel olarak umut verici bir noninvaziv yaklaşım olacaktır.
Resim 1 . Aşırı SMCs Eln(- / -) aort türetmek birden çok önceden varolan SMCs. Barajlar da çok renkli Cre muhabir taşıyan Eln(- / -), Acta2-CreERT2 embriyo ile hamile ROSA26R(Rb / +) tamoxifen (1.5 mg) E12.5 adlı tek bir mayi enjeksiyon ile indüklenen. Barajlar E18.5 feda ve embriyoların azalan aortas enine bölümlerini DAPI ve Rb renklerin doğrudan floresan için boyama ile analiz Cerulean (Cer), mCherry (mCh) ve mOrange (mOr). Aşırı SMCs birikir Elniç yüzeyi içinde-null aort E15.518sonra. Aşırı iç katman SMCs polyclonality gösteren birden çok renk (yıldızlar), hücreler içerir. Lu, aort Lümen. Ölçek çubuğu, 10 µm. Reprinted enesali vd., 20169dan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Anti-αvβ3 Integrin abluka zayıflar Hypermuscularization ve Eln(- / -) aort Explant stenoz. E15.5, hamile barajlar euthanized ve Eln(- / -) embriyo aortas hasat edildi. İzole aortas hemen sabit ya da bir izotip kontrol Igg1 veya fiksasyon önce 18 h için bir integrin αvβ3 engelleyen antikor huzurunda kültürlü. Sabit aortas CD31, SMA ve çekirdeği (DAPI) için lekeli. Lu, aort Lümen. Ölçek çubuğu, 100 µm. Reprinted enesali vd., 20169dan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . İzole ve kültürlü yenidoğan fare hızlı düz kas işaretleri üzerinden aort SMCs. SMCs P0.5 pups izole edildi ve kültürlü. Üçüncü geçiş hücreleri sabit ve CD31 için lekeli (EC marker), çekirdek (DAPI) ve bir SMC işaretleyici (SMA, SM22α veya SMMHC, belirtildiği gibi). Bu analiz ~ %90 kültürlü hücre SMC işaretleri hızlı ve hiçbiri CD31 ifade gözlendi gösterir. Ölçek bar, 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Cilengitide Vivo içinde sürekli infüzyon zayıflar Eln(- / -) aort Hypermuscularization ve stenoz. Erkek ve dişi fareler Eln(+/-) geçti. İntegrin β3 inhibitörü cilengitide veya araç (PBS) sürekli hamile barajlar ozmotik mini-pompalar E13.5 başlayan kullanarak infüzyon. P0.5 enine bölümleri SMA (kırmızı), CD31 (beyaz) ve çekirdek (DAPI, mavi) için lekeli. Lu, aort Lümen. Ölçek çubuğu, 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare aort ve ateroskleroz, modelleri gibi yetişkin patolojik koşullarında büyük dalları geniş araştırmalar aksine daha az morfogenez ve embriyonik ve perinatal aort patogenezi ile ilgili olarak bilinir. Burada, biz embriyonik/perinatal aorta, özellikle SMCs, odak ve aort yoluyla vivo içindedoku explant, çalışmaya iletişim kuralları sağlar ve SMC yalıtım yaklaşımlar. Bu ücretsiz yaklaşımlar embriyonik/perinatal aort çalışmaya farklı yaklaşımlarla araştırmacı sağlar.
Klonal analiz bir tek tek hücreler davranışını araştırmak izin verir çok güçlü bir yaklaşımdır. Son zamanlarda özel SMCs pulmoner damarlara10tanımlamanıza yardımcı olması için bu yaklaşım kullandık. Bu bireysel bir fare, çok renkli Cre muhabir taşıma ihtimali vardır, aynı renkteki hücreler birden fazla rekombinasyon olayından türetilen tanımak için önemlidir. Böylece, klonal analizi çok renkli muhabir ile çok sayıda farelerin değerlendirme gerektirir. Orta-geç gebelik dönemindeki Tamoxifen doğum, orta-geç gebelik döneminde hücreleri işaretlemek ve onları postnatally, iz deneyler için engelleyebilir çünkü progesteron ve Tamoksifen kullanılazlar enjekte. Benzer şekilde embriyo Protokoller'de, kader eşleme ve yetişkin fare hücrelerinde klonal analizi tamoxifen yetişkin mayi enjeksiyon ile üstlenilen.
Klonal analizi ve kader eşleştirme SMCs düz kas gelişmiş aktivite ile transgenes Cre recombinase rehberleri kontrol altında ifade ile taşıyan fareler kullanır. Burada, koşullu transgenes Myh11-CreERT2 veya Acta2-CreERT2taşıyan fareler kullanarak iletişim kuralları açıklar. Myh11 SMCs19en belirgin belirtecidir; Ancak, Eln(- / -) aort9downregulated öyle. Acta2 Elndahil SMCs ifade edilir-null aort, ama değil gibi belirli de diğer hücre tipleri ifade çünkü. Eğer bu koşullu transgenes "sızan" (Yani, Tamoksifen yokluğunda rekombinasyon teşvik), deneyler, hücre işaretleme zamanlaması betimlemek değil gibi sorunlu olabilir. Bu transgenes leakiness bir lacZ tabanlı Cre muhabir ve Myh11-CreERT2 ya da araç tedavi ( Aşağıdaki Acta2-CreERT2 taşıyan farelerde beta galaktozidaz etkinlik değerlendirme tarafından analiz edildi Yani, Tamoksifen indüksiyon yokluğu)11,12. Bu çözümleme bağlı olarak, bu transgenes sızan kabul.
Hypermuscularization birden fazla vasküler patolojiler insanlarda karakterize. Örneğin, supravalvular aortik stenoz (SVAS) aşırı SMCs. SVAS sonuçlarından kaybı ELN gen alleli bir fonksiyonu nedeniyle büyük ve orta ölçekli damar tıkanıklığı ile karakterize bir yıkıcı Konjenital durumdur ve izole bir varlık veya daha fazla, yaygın, Williams-Beuren Sendromu20,21,22,23,24parçası olarak oluşur. ELN(- / -) mutant fare phenocopy SVAS18,21,22aort fenotip birçok yönleri. Patent9,18explants wildtype embriyo gelen kalır, ancak aort explants Eln(- / -) embriyo üzerinden hızla kültür sırasında tıkandı haline. Aort explant yaklaşım tarama stenoz elastin aortopathy9Azalt aracıları için kolaylaştırır. Ancak, bu yaklaşım aort vücuttaki süre için söz konusu olduğunu mekanik veya fiziksel güçleri dikkate almaz. Böylece, aortik explant tarama pozitif hits içinde vivo Eln mutant fare modelleri ile değerlendirilmesi.
SMC yalıtım Protokolü perinatal fare aort SMCs almak için hızlı ve sağlam bir yöntemdir. Benzer bir yaklaşım SMCs yetişkin fareler yalıtmak için yaygınlaştırılması. Nispeten büyük büyüklüğü nedeniyle yetişkin aort boyuna açılabilir ve adventitia ve endotel hücreleri uzak disseke. Saflık perinatal veya yetişkin aort izole hücre değerlendirmek için ifade SMC işaretleri (Örneğin, SMMHC, smoothelin, SM22α ve SMA) ve endotel hücre işaretleri (Örneğin, ifade eksikliği denetlemek önemlidir CD31 ve vasküler endotel cadherin). Alternatif yalıtım yaklaşım fluorescently yalıtmak için Akış Sitometresi kullanmaktır bir potansiyel disseke aort SMCs etiketli. Bir floresan Cre muhabir ve Myh11-CreERT2, Acta2-CreERT2veya Tgln-Cre taşıyan fareler fluorescently SMCs11,12,25etiketlemek için kullanılabilir, 26,27. Alternatif olarak, varolan transgenik fareler bir fluorophore (Yani, GFP, mCherry, ya da RFP) ifade sürüş SMA organizatörü ile kullanılan28,29,30olabilir.
İmplante ozmotik mini-pompalar laboratuvar hayvanlarının farmakolojik sürekli teslimini sağlamak için kullanılır. Mini-pompalar ajanlar gebelik dönemi9geri kalan döneminde embriyo geliştirmek için teslim etmek için E13.5, hamile farelerde implante. Embriyo ulaşmak için böyle ajanlar kan plasental bariyer geçmek mümkün olması gerekir. Genel olarak, mini-pompalar çok iyi tolere edilir ve enfeksiyon oranı düşük göz önüne alındığında, rutin antibiyotik tavsiye edilmez. Yara yırtılması çok nadirdir; Ancak, 4 mm büyük bir yırtılması algılanırsa, fareyi yeniden imzalat olmalı ve yara temizlenir ve tekrar bir cerrahi sütür ile kapalı.
Bu eser bir armamentarium normal oluşumu embriyonik ve perinatal aort duvar geliştirme sırasında hem de bu süreçte tedirginlikler hastalığı sırasında sonra eğitim için kullanılan yaklaşımların açıklar. Ayrıca, bu iletişim kuralları bakım ve yetişkin aort hastalığı çalışmaya uygulanır. Yaklaşımlar gastrointestinal sistem veya akciğer solunum yolları gibi düz kas kaplı olmayan vasküler yapıların yanı sıra diğer kan damarları yaygınlaştırılması. Son olarak, benzer teknikler endotel hücreleri veya fibroblastlar yanı sıra, bu hücre türleri ile SMCs arasındaki etkileşimi gibi hücre tipleri dışında SMCs, çalışma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dean Li aort SMC yalıtım için onun laboratuvarı protokol paylaştığınız için teşekkür ederiz. Destek finansman sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri tarafından (R21NS088854, R01HL125815 ve R01HL133016 D.M.G için), Amerikan Kalp Derneği (Grant-in-Aid 14GRNT19990019) D.M.G. için ve Yale Üniversitesi (kahverengi-Coxe Bursu için sabah ve başlangıç fonlar için D.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/mL |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
