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Biology

चूहे के गुट माइक्रोबायोटा पर बैक्टीरियोसिन प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि

Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/56053
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1
1Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 2Department of Food Safety and Infection Biology, Norwegian University of Life Sciences (NMBU), 3Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid (UCM), 4Faculty of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences (NMBU)
* These authors contributed equally

Summary

माना जाता है कि बैक्टीरियॉसिन्स विभिन्न पारिस्थितिक निकीओं में सूक्ष्म जैव विविधता को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, हम एक कुशल प्रक्रिया का वर्णन करते हैं कि एक जानवर मॉडल में जीवाणुनाशकों को कैसे प्रभावित किया जाता है।

Abstract

पेट की सूक्ष्म जीव संरचना और हमारे स्वास्थ्य के साथ संबंध के बारे में बहुत बढ़िया सवाल उठते हैं, विशेषकर उन कारकों से संबंधित जो जनसंख्या संतुलन बनाए रखने में योगदान करते हैं। हालांकि, इन कारकों का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध सीमित तरीके हैं जीवाणुनाशक कई जीवाणुओं द्वारा उत्पादित रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स हैं जो खाद्य अधिग्रहण और / या आला प्रतिष्ठानों के लिए प्रतिस्पर्धात्मक लाभ प्रदान कर सकते हैं। कई प्रोबायोटिक लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया (एलएबी) उपभेदों में रोगजनकों के विकास को रोकने के द्वारा मानव और पशु स्वास्थ्य को बढ़ावा देने की बहुत संभावनाएं हैं। इन्हें इम्युनो-मॉड्यूलेशन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि वे जीवाणुओं का उत्पादन करते हैं। हालांकि, जीवाणुओं की शत्रुतापूर्ण गतिविधि सामान्य रूप से प्रयोगशाला जैवसैस द्वारा अच्छी तरह से परिभाषित लेकिन अधिक-सरलीकृत शर्तों के तहत मनुष्यों और जानवरों के परिसर में गूट वातावरण की तुलना में निर्धारित की जाती है, जहां बैक्टीरिया मेजबान से बहुसंख्यक प्रभाव और सैकड़ों माइक्रोबियल प्रजातियों का सामना करते हैं।एक ही स्थान को लेकर यह काम प्रभाव का आकलन करने के लिए एक पूर्ण और कुशल प्रक्रिया का वर्णन करता है एक मूरीन प्रणाली में विभिन्न लक्ष्य विशिष्टताओं के साथ विभिन्न प्रकार के बैक्टीरियोसाइंस जीवाणुरोधी उपचार के दौरान सूक्ष्म जीव संरचना में परिवर्तन की रचना की गई 16 एस आरडीएनए सिकेंजिंग का उपयोग करके निगरानी की जाती है। हमारा दृष्टिकोण बैक्टीरियोसाइन उत्पादकों और उनके आइोजेनिक गैर बैक्टीरियोसिन उत्पादन म्यूटेंट का उपयोग करता है, बाद में माइक्रोबायोटा के गैर-बैक्टीरियोसाइन-संबंधी संशोधनों से बैक्टीरियोसाइन-संबंधी भेद करने की क्षमता देता है। बैक्टीरियल आबादी और स्वास्थ्य मार्करों के बीच कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता के संदर्भ में बैक्टीरियल प्रोफाइल में बेहोश बदलाव खोजने और सहसंबंध स्थापित करने के लिए, बुखार डीएनए निष्कर्षण और 16 एस आरडीएनए अनुक्रमण विधि संगत और, साथ ही जैव सूचना विज्ञान के साथ एक शक्तिशाली प्रक्रिया का गठन करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल सामान्य है और मेजबान माइक को बदलने की क्षमता के साथ अन्य यौगिकों या पोषक तत्वों का अध्ययन करने के लिए इसका इस्तेमाल किया जा सकता हैरोबियोटा संरचना, या तो जब विषाक्तता या लाभकारी प्रभाव का अध्ययन करते हैं

Introduction

बैक्टीरियॉसीन जीवाणु प्रजातियों 1 , 2 की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा उत्पादित रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स हैं। इन यौगिकों और उनके निर्माता, विशेष रूप से प्रयोगशाला, का पता लगाया और खाद्य संरक्षण और चिकित्सा 3 में अपनी क्षमता अनुप्रयोगों के लिए दशकों के लिए दुनिया भर में शोषण किया गया। कई बैक्टीरियोसाइन लिस्टरिया, एंटरोकोकस, स्टेफिलोकोकस और बैसिलस की प्रजातियों सहित महत्वपूर्ण रोगजनकों को मारने के लिए जाना जाता है। कुछ बैक्टीरियोसाइंस में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4 को नियंत्रित करने की क्षमता भी होती है कई बैक्टीरियॉसिन्स में अपेक्षाकृत संकुचित स्पेक्ट्रा है, कुछ संपत्तियों में काफी सराहना की गई संपत्ति है। उदाहरण के लिए, कुछ संकीर्ण-स्पेक्ट्रम बैक्टीरियॉसिन्स का इस्तेमाल समस्याग्रस्त बैक्टीरिया के चुनिंदा समूहों के खिलाफ विशिष्ट गतिविधि को निर्देशित करने के लिए किया जा सकता है, बिना किसी भी अशांति के, समान जगह बांटने वाले कॉन्सन्सल या फायदेमंद वनस्पतियों पर। यह विशेष रूप से आंत पर्यावरण में आवश्यक हैप्याज, जहां कई फायदेमंद रोगाणुओं एक इंटरेक्टिव और गतिशील तरीके से कामयाब रहे 5 । जीवाणुरोधी प्रोफीलैक्टिक या प्रोबायोटिक उपयोग के लिए बहुत ही आकर्षक हैं, क्योंकि वे रोगजनकों, पथोबोनट्स, या अवसरवादी बैक्टीरिया (या) के विकास को रोक सकते हैं जो पेट होमोस्टैसिस 6 , 7 को असंतुलित कर सकते हैं।

उनकी प्रकृति और भौतिक गुणों के संदर्भ में, बैक्टीरियोसाइन बहुत विविध होते हैं, क्योंकि उनके पास अलग-अलग संरचनाएं, लक्ष्य विशिष्टताएं, क्रियाओं के तरीके आदि शामिल हैं । इन विट्रो सेटिंग्स में अधिकांश बैक्टेरियाइन्स का अध्ययन किया गया है, लेकिन बहुत कम भोजन में परीक्षण किया गया है मैट्रीस 8 , 9 या विवो में, जैसे पशु पेट में 6 , 10 । जटिलताओं के कारण विवो में मूल्यांकन किए जाने पर इन विट्रो गुणों को काफी हद तक अलग किया जा सकता हैफूट पर्यावरण और फायदेमंद बैक्टीरिया पर कथित अवांछित प्रभावों के लिए। सबसे प्रोबायोटिक्स लैब हैं वे शॉर्ट-चेन फैटी एसिड समेत अन्य चयापचयों की एक सरणी का उत्पादन करते हैं, जो मेजबान के शरीर विज्ञान को प्रभावित करने के साथ-साथ कुछ बैक्टीरिया की ओर रोगाणुरोधी गुणों को प्रदर्शित करने के लिए जाने जाते हैं। इसलिए, प्रोबायोटिक उपभेदों के मामले में, जो जीवाणुओं का उत्पादन करते हैं, यथार्थवादी assays स्थापित करना सबसे अच्छा है, जैसे कि सामान्य माइक्रोबायोटा के साथ स्वस्थ जानवर।

वर्तमान अध्ययन में, हम एक ऐसी रणनीति प्रदान करते हैं जो विभिन्न जीवाणु-उत्पादक उपभेदों के प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है, जिनके बैक्टीरियॉसिन्स के स्वस्थ चूहों पर अलग-अलग निरोधात्मक स्पेक्ट्रा हैं। हमारी रणनीति में आईज़ोजेनिक गैर-जीवाणुरोधी म्यूटेंट के साथ चूहों को खिलाना शामिल है, जो गैर बैक्टीरियोसिन-मध्यस्थता प्रभाव से बैक्टीरियॉसीन-मध्यस्थता प्रभाव के भेदभाव को सक्षम बनाता है। अनुक्रम 16S आरडीएनए पेट में बैक्टीरिया जनसंख्या के गतिशील परिवर्तन का पालन करने के लिए अनुमति देता है। Subsबैक्टीरिया की प्रजातियों और जीवाणु प्रजातियों और मापा शारीरिक मापदंडों ( जैसे, बॉडीवेट, सीरम जैव रासायनिक पैरामीटर, आदि ) के बीच में समीकरण के सांख्यिकीय विश्लेषण के बारे में पता चलता है। हमारा मानना ​​है कि इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीवित जानवरों में बैक्टीरियोसिन के अध्ययन से परे अन्य प्रोबायोटिक या प्रीबीओटिक अनुप्रयोगों के लिए भी लागू है।

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Protocol

एक विशेष पशु देखभाल इकाई में देखभाल और हैंडलिंग किया जाना चाहिए। यहां वर्णित प्रक्रियाओं को यूरोपीय संघ कानून और 2010/63 / यूरोपीय संघ और स्पेनिश सरकार आरडी 53/2013 द्वारा जानवरों की सुरक्षा पर अनिवार्य प्रयोगशाला पशु देखभाल के सिद्धांतों के पालन से वैलेंसिया विश्वविद्यालय और स्थानीय अधिकारियों के संबंधित एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। पशु प्रयोगों (प्रतिस्थापन, कटौती, परिशोधन) में 3 आर सिद्धांत का सम्मान करने के लिए, वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जाता है।

1. जमे हुए बैक्टीरिया कल्चर जो कि चूहे को टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है

  1. 5 एमएल के मस्तिष्क-दिल जलसेक (बीएचआई) माध्यम में एलएबी की व्यक्तिगत प्रजातियों को टीका डालना और उन्हें 20 से 24 डिग्री (रात भर) 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाना।
  2. प्रत्येक रातोंरात जीवाणु संस्कृति को बीएचआई में 200 एमएल की रातोंरात संस्कृति के 2 एमएल स्थानांतरित करके बीएचआई में 100 गुना पतला। उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 से 24 घंटे तक बढ़ो।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तनाव तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं
  3. हार्वेस्ट सीई5 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5000 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफेगेशन द्वारा एलएलएस
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और दो कोशिकाओं को हर 100 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) में प्रत्येक सेल गोली को निलंबित करके और चरण 1.3 के रूप में कोशिकाओं को इकट्ठा करके दो बार धो लें।
  5. दूसरे धोने के बाद, पीबीएस में 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 15% ग्लिसरॉल में प्रत्येक सेल गोली निलंबित करें।
  6. कोशिकाओं के निलंबन को ट्यूब में 1-एमएल संस्करणों में विभाजित करते हैं और फिर उन्हें उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करते हैं।
    नोट: इस बिंदु के बाद कोशिकाओं को 1-2 महीने के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।
  7. भंडारण से पहले और प्रशासन के पहले सेल नंबर निर्धारित करें ताकि चूहों को दी जाने वाली जीवित कोशिकाओं की संख्या ज्ञात हो।
    1. सेल की गिनती के लिए, बर्फ-ठंडा 0.9% सोडियम क्लोराइड (NaCl) समाधान में कोशिकाओं के दस गुना धारावाहिक dilutions करें। एक बीआईआई अगर प्लेट पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μL फैल सेल विकास और कॉलोनी गठन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (20 से 24 घंटे) सेते हैं, बाद में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) / एमएल निर्धारित करने के लिए।
  8. बैक्टीरिया युक्त पेयजल बनाने के लिए, प्रत्येक जीवाणु स्टॉक संस्कृति की पतली कोशिकाओं को 100 एमएल बाँझ, फ़िल्टर किए गए पीने के पानी में, 10 9 / एमएल पानी का अंतिम औसत सेफू के साथ। बैक्टीरिया के अस्तित्व के आकलन के लिए, जीवाणु उपचार के पहले दो हफ्तों के दौरान सप्ताह में एक बार 24 घंटे के बाद कमजोर पड़ने के बाद और बाद में जीवित कोशिकाओं की गणना करें।

2. चूहे परख और प्रायोगिक डिजाइन

नोट: इस प्रयोग के लिए निश्चित रोगजन मुक्त (एसपीएफ़) बीएएलबी / सी युवा मादा चूहों (6-8 सप्ताह) आवश्यक हैं; यहां, कुल 100 पशु खरीदे गए थे।

  1. पूरे प्रयोग के दौरान पिलेटेड भोजन और पानी की मुफ्त पहुंच के साथ चूहों को प्रदान करें।
  2. प्रयोग को डिज़ाइन करें और शक्ति की गणना करें
    1. यदि प्रत्येक उपचार का अपना नियंत्रण होता है, तो एक युग्मित केस-कंट्रोल डिजाइन (टी-टेस्ट) लागू करें। निर्धारित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रभाव (ओं) की औसत और मानक त्रुटि की गणना करने के लिए प्रारंभिक परख का उपयोग करें। परख की शक्ति और विभिन्न तरीकों और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यक्रमों का उपयोग करके हर समूह के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या का अनुकूलन 11 ।
    2. बैक्टीरियोसिन निर्माता बनाम गैर-उत्पादक उपभेदों के प्रभावों की जांच के लिए, प्रयोगात्मक स्थिति में 9 पशुओं का उपयोग करें।
      नोट: यह संख्या प्रायोगिक मानक त्रुटि के आधार पर निर्धारित किया गया था और एक संतोषजनक शक्ति (0.7 - 1.0) और 0.05 के नीचे एक महत्व का स्तर प्रदान किया गया था।
      नोट: दिए गए उदाहरण में, चूहों के 11 समूह बनाए गए, प्रति पिंजरे में एक। दस पिंजरे 5 पेटीओसिइन-उत्पादन वाले उपभेदों और इसी 5 आइसोजेनिक गैर-उत्पादन वाले उपभेदों के साथ उपचार के अनुरूप हैं; 11 वीं पिंजरे में 10 चूहों थे और नियंत्रण न किए गए नियंत्रण का गठन किया था।
  3. पनीर की सुविधा के लिए चूहों के आगमन के बाद, उन्हें पिंजरों में वितरित करें और जानवरों को कान-लेबल करें ताकि व्यक्तिगत ट्रैकिंग की अनुमति मिल सके। प से पहले एक सप्ताह के लिए पौधों की सुविधा और शर्तों के लिए चूहों को सम्मिलित करनाroceeding।
  4. चरण 1.8 में वर्णित बैक्टीरिया युक्त पेयजल तैयार करें, और संबंधित स्वतंत्र पिंजरों में पानी की बोतलों को पीने के लिए जो स्पष्ट रूप से पहचाने गए हैं ताकि प्रत्येक पिंजरे में चूहों को एक ही पानी की बोतल साझा कर सकें।
    नोट: परीक्षण समूह को एक अलग पिंजरे में रखा जाना चाहिए, परीक्षण बैक्टीरिया के साथ कोई संपर्क नहीं।
  5. ताजे पीने के पानी (100 मिलीलीटर) के साथ हर दिन की एक नई बोतल तैयार करें और नए सिरे से जीवाणुरोधी निलंबन जोड़ें। लगातार 15 दिनों तक ऐसा करें।
  6. दो सप्ताह की अवधि के साथ बैक्टीरिया उपचार का पालन करें, जिसके दौरान माईस बैक्टीरिया से मुक्त पानी पीते हैं ( चित्रा 1 )।

3. नमूने एकत्र करना

  1. फ़ेक नमूने लीजिए
    1. प्रत्येक माउस के लिए आटोक्लाइड पिंजरों (रिक्त) और बाँझ संदंश और लेबल बाँझ 1.5-एमएल ट्यूब तैयार करें।
    2. वें के दौरान microbiota संरचना में भिन्नता से बचने के लिए दिन के एक ही समय में नमूने लीजिएएक दिन का ई कोर्स इष्टतम परिणामों के लिए, ताजा नमूने अलग से इकट्ठा करें।
      नोट: अधिमानतः, सुबह जल्दी मल मिलाकर इकट्ठा होते हैं, जब चूहों को सहज रूप से शौच करना पड़ता है।
    3. 70% शराब के साथ खाली पिंजरे को साफ करें और माउस को अंदर रखें। इसे संवारने के लिए अनुमति दें, और बाँझ संदंश का उपयोग करके 2-4 फीकल छर्रों को इकट्ठा करें, उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में रख दें।
      नोट: कभी-कभी माउन्स पूंछ को पकड़ने के लिए पर्याप्त है; मल को सीधे गुदा से एक ट्यूब में एकत्र किया जा सकता है।
    4. चार सप्ताह के प्रयोग ( चित्रा 1 ) के दौरान सप्ताह में एक बार प्रत्येक माउस से बुखार के नमूने एकत्र करें। जीवाणुओं को चूहों के जोखिम से पहले, एक दिन (टी 0, समय शून्य) पर पहले नमूनों को इकट्ठा करें। दिन 7, 14, 21, और 28 पर निम्नलिखित भेस नमूने एकत्र करें।
    5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर तब तक सर्द कर दें, जब तक प्रयोगशाला में उनका परिवहन न हो जाए, जहां वे -80 डिग्री सेल्सियस पर जमी रहें। अग्रिम में योजना और पर्याप्त भंडारण बक्से प्रदान करते हैं, क्योंकि बड़ी संख्या में एफएएफप्रयोग के दौरान कैल नमूने एकत्र किए जाएंगे।
  2. हर हफ्ते फेकल संग्रह दिवस पर सभी चूहों वजन।
  3. 15 वें दिन सभी चेतना से चेहरे की नसों से रक्त के नमूनों को इकट्ठा करें, बैक्टीरिया प्रशासन का आखिरी दिन, और ट्राइग्लिसराइड्स के स्तर, कुल कोलेस्ट्रॉल, उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल), और निम्न घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) का स्तर निर्धारित करें। रक्त का सीरम।
    नोट: जानवरों में तनाव कम करने के लिए अनुभवी कर्मियों को रक्त इकट्ठा करना चाहिए।

4. एलएबी गणना और बैक्टीरियोसिन गतिविधि

  1. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक नमूने के एक फीकल गोली लें और 10% (डब्ल्यू / वी) समाधान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त मात्रा में बर्फ-ठंडा 0.9% NaCl जोड़ें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए बुखारयुक्त माइक्रोप्रस्टल का उपयोग करें जो कि fecal निलंबन को एकजुट करता है और बर्फ-ठंडा 0.9% NaCl में दस गुना धारावाहिक dilutions तैयार करता है।
  2. एलएबी कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें
    1. पतली कोशिकाओं (100 μL) को 4 एमएल की प्रीवार्मेड मा में स्थानांतरित करेंएन रोगोसा शार्प (एमआरएस) सॉफ्ट एगर (50 डिग्री सेल्सियस, 0.8 फीसदी अगर) एक ठोस एमआरएस अगर प्लेट (1.5% अगर) पर कोशिकाओं को डालने से पहले भंवर द्वारा मिलाएं।
    2. सेल विकास और कॉलोनी गठन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे - 20 के लिए कोशिकाओं incubating से पहले बाँझ हुड में 5-10 मिनट के लिए ढक्कन बंद करके प्लेट सूखी।
  3. बैक्टीरियोसिन-उत्पादन कोशिकाओं की गणना करें
    1. बैक्टीरियोसाइन उत्पादक के पतला कोशिकाओं (100 μL) को 4 एमएल के प्रीवार्ज्ड एमआरएस सॉफ्ट एगर (50 डिग्री सेल्सियस, 0.8% अगर) में स्थानांतरण करें, भंवर द्वारा मिलाएं, और एक एमआरएस अगर प्लेट (1.5% अगर) पर कोशिकाओं को डालें; इस परत को पहली परत के रूप में जाना जाता है
    2. मुलायम अगर में सभी कोशिकाओं को एम्बेड करने के लिए पहली परत पर सेल-मुक्त एमआरएस मुलायम अगर (0.8% अगर) के एक और 4 एमएल स्थानांतरण।
      नोट: इस परत का मतलब है कि अगर प्लेटों की सतह पर कोशिकाओं के रूप में बढ़ती कोशिकाओं को रोकना सतह पर बढ़ते सेल आसानी से विस्थापित हो सकते हैं जब शीर्ष पर सूचक कोशिकाओं को डालना (चरण 4.3.4) औरइसलिए परिणामों की व्याख्या को बहुत मुश्किल होगा इस परत को दूसरी परत के रूप में जाना जाता है।
    3. सेल विकास और कॉलोनी गठन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए incubating से पहले बाँझ हुड में 5-10 मिनट के लिए ढक्कन बंद करके प्लेट सूखें।
    4. बैक्टीरियोसिन उत्पादन करने वाले कॉलोनियों की पहचान करने के लिए, उपयुक्त संकेतक तनाव के 40 μL को रात भर की संस्कृति में मिलाएं, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, 4 एमएल की प्रीवार्मल्ड मुलायम अगर प्लेट पर मिश्रण डालो; इस परत को तीसरी परत के रूप में जाना जाता है
    5. सेल विकास और कॉलोनी गठन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए incubating से पहले बाँझ हुड में 5-10 मिनट के लिए ढक्कन बंद करके प्लेट सूखें।
      नोट: बैक्टीरियोसिन-उत्पादन वाले उपनिवेशों को कालोनियों के आसपास स्पष्ट (निषेध) क्षेत्र ( चित्रा 2 ) है।

5. डीएनए निष्कर्षण, 16 एस आरडीएनए प्रवर्धन और अनुक्रमण

नोट: चरण एफया डीएनए निष्कर्षण एक व्यावसायिक किट ( उदाहरण के लिए, वास्तविकता "एसएसएस" किट) के उपयोग के लिए वर्णित है।

  1. 300 μL के विश्लेषण समाधान में 1 - 2 फीकल चूहों की छर्रों (~ 200 मिलीग्राम) निलंबित करें।
  2. नमूना को 2 एमएल माइक्रोट्यूब में ट्रांसफर करें जिसमें लगभग 0.5 ग्राम ग्लास मोती (व्यास: 0.1 मिमी) रखा गया है।
  3. प्रत्येक नमूना के लिए 20 μg / mL पर 10 μ / μL और 2 μL ल्यूसैमियम में 1 μL म्यूटानोलिसिन जोड़ें और 37 से 40 डिग्री सेल्सियस तक का सेवन करें। Fecal नमूने 12 से डीएनए निष्कर्षण के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें
  4. बीड-ब्रेटर चरण के दो चक्रों को लागू करें, 1 मिनट प्रत्येक।
  5. प्रोटीनेस के 2 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करें।
  6. 20 मिनट और भंवर हर 5 मिनट के लिए सेते हैं
  7. नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस तक शांत करें और नमूने के लिए 5 μg / mL RNase A के 1 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण।
  8. 30 से 60 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. कमरे के तापमान पर नमूनों को शांत करें और 180 μL जोड़ेंप्रोटीन वर्षा समाधान का भंवर 20 से 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर सख्ती से
  10. 5 मिनट के लिए 16,000 xg पर अपकेंद्रित्र यदि सतह पर तैरने वाले में कोई फ्लोटिंग कण होते हैं, तो 5 मिनट के लिए बर्फ में नमूनों का सेवन करें और फिर से अपकेंद्रित करें।
  11. डीएनए युक्त एक 1.5-एमएल माइक्रोट्यूब में 300 μL isopropanol युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  12. 20 से 30 गुना ट्यूबों को मिलाकर मिक्स करें और 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस तक सेवन करें। वैकल्पिक रूप से, ट्यूबों को अधिक से अधिक अवधि ( जैसे रातोंरात) के लिए सेते हैं।
  13. 2 मिनट के लिए 16,000 xg पर अपकेंद्रित्र
  14. सतह पर तैरनेवाला निकालें और शोषक पेपर पर ट्यूब सूखें। डीएनए गोली धोने के लिए 300 μL 70% इथेनॉल जोड़ें।
  15. 1 मिनट के लिए 16,000 xg पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और लगभग 15 मिनट के लिए सूखी सूखी गोली छोड़ दें
  16. एक बार गोली साफ हो जाने पर, 100 μL बाँझ पानी या ट्रिस (10 मिमी) / ईडीटीए (1 एमएम) के बफर को जोड़ें और गोली को फिर से खोलें।
  17. किसी भी संभावित निरोधक को खत्म करने के लिएबाद के चरणों के दौरान यौगिकों, डीएनए साफ़ करें। चरण 5.15 के लिए बंधन स्थितियों को समायोजित करने के लिए बफर एनटीआई के 2 संस्करणों (200 μL) के साथ निकाले गए डीएनए मिलाएं।
  18. एक संग्रह ट्यूब (2 एमएल) में पीसीआर क्लीन-अप कॉलम युक्त सिलिका झिल्ली रखें और नमूना लोड करें।
  19. 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र 11,000 x जी प्रवाह के माध्यम से त्यागें
  20. 700 μL बफर एनटी 3 के साथ सिलिका झिल्ली धो लें और चरण 5.16 को दोहराएं।
  21. 1 मिनट के लिए 11,000 xg पर centrifugation द्वारा सिलिका झिल्ली सूखी धो बफर NT3 वाले किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें।
  22. एथेनॉल की कुल हटाने के लिए कॉलम को एक नया 1.5-एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 से 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर लें।
  23. पीसीआर-ग्रेड के 30 μL पानी जोड़ें और 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर लें। 1 मिनट के लिए 11,000 x ग्रा पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एल्यूट
  24. एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या फ्लोरोमेट्रिक विधि का उपयोग करके डीएनए को बढ़ाएं।
  25. ईए में एक ही पिंजरे बांटने वाले चूहों से डीएनए नमूने को सामान्यीकृत और पूल Ch समय बिंदु
  26. समय के दौरान व्यक्तिगत भिन्नताओं का अनुपालन करने के लिए, नियंत्रण से तीन बेतरतीब ढंग से चयनित चूहों के अनुक्रम डीएनए नमूने और दो अन्य यादृच्छिक पिंजरे दिन 0, 14, और 28 पर।

6. 16 एस आरआरएनए जीन प्रवर्धन और अनुक्रमण

  1. प्रवर्धित 16 एसआरआरएनए जीन की एक पुस्तकालय तैयार करें। उचित ओवरहंग एडाप्टर के साथ आगे और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग करके जीवाणु 16 एस आरआरएनए जीन 5 के वी 3-वी 4 क्षेत्र को बढ़ाएं:
    5'-टीसीजी टीसीजी जीसीए जीसीजी टीसीए जीएटी जीटीजी टाट आगा आगा सीएजी सीसीटीसी एसीजी जीजीएन जीजीसी डब्ल्यूजीसी एजी -3 '
    5'-जीटीसी टीसीजी टीजीजी जीसीटी सीजीजी आगा टीजीटी जीटीए टीएए गैग एसीए जीजीए सीटीए सीएचवी जीजीजी टैट सीटीए एटीसी सी -3 '
  2. 1% agarose जेल के साथ वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर प्रवर्धित बैंड की जाँच करें।
  3. एम्प्लिकॉन शुद्धि के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करते हुए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पादों को साफ करें।
  4. निम्नलिखित चरण के साथ आगे बढ़ें, जैसा कि निर्माता द्वारा संकेतित बड़े पैमाने पर अनुक्रमण मंच के अनुसार किया गया है> 6

7. डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

  1. गुणवत्ता फ़िल्टरिंग (आमतौर पर अनुक्रमण सुविधाओं पर किया जाता है)
    1. उपकरण के साथ दिए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे पढ़ता डेटा और डी-मल्टीप्लेक्स फ़िल्टर करें।
    2. यूएएसटीईई पाइपलाइन 13 यूएईईएचर 14 (संस्करण 7.0.10 9 0) में कार्यान्वित किए जाने वाले युग्मित अंत की प्रक्रिया को पढ़ता है। युग्मित सिरों को मिलाएं और 1.0 की अधिकतम अपेक्षित त्रुटि (अधिकतम) मान का उपयोग करके गुणवत्ता फ़िल्टरिंग लागू करें 150 एनटी से कम दृश्यों को छोड़ें एकलकों को त्यागने के लिए दृश्यों को दोहराना
    3. एक 97% अनुक्रम पहचान पर परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (ओटीयू) में अनुक्रम क्लस्टर करें और यूकेइएमए 15 का इस्तेमाल चिमरिक अनुक्रमों को फ़िल्टर करने के लिए करें।
  2. ओटीयू चयन, टैक्सोनोमिक असाइनमेंट और फ़िलेोजेनेटिक पुनर्निर्माण, और विविधता विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन
    1. मात्रात्मक अंतर्दृष्टि Int का उपयोग करते हुए OTU पर प्रक्रिया करेंओ माइक्रोबियल पारिस्थितिकी (QIIME) 16
    2. 30% की न्यूनतम पहचान (डिफ़ॉल्ट) के साथ पीएनएएनएटी 18 के जरिये ग्रेनेज की कोर सेट डेटाबेस 17 के खिलाफ प्रतिनिधि ओटीयू को चुनना और संरेखित करें।
    3. रिबोज़ॉमल डाटाबेस प्रोजेक्ट (आरडीपी) क्लासिफायर प्रोग्राम 1 9 का आविर्भाव के साथ गठबंधन अनुक्रमों में वर्गीकरण निर्दिष्ट करें।
    4. OTU सारणी को निम्न क्रम गहराई के साथ नमूने के अनुक्रम गिनती में सामान्य करें।
    5. अत्यधिक चर क्षेत्रों और स्थिति जो सभी अंतराल हैं, को हटाने के लिए निस्पंदन चरण के बाद फास्ट ट्री 20 का उपयोग करते हुए गठबंधन अनुक्रमों से एक फ़िलेोजेनिक पेड़ बनाएं। अल्फा और बीटा विविधताओं की गणना करने के लिए इस पेड़ का उपयोग करें और दुर्लभ घटता और शैनन इंडेक्सस की गणना करें।
    6. Unweighted UniFrac दूरी मैट्रिक्स उत्पन्न करने और कल्पना करने के लिए 21 , सिद्धांत समन्वय विश्लेषण (पीसीओए) का उपयोग करें
      नोट: एस के लिएतकनीकी विश्लेषण, विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि आर 22 या QIIME 16 के भीतर कार्यान्वित सांख्यिकीय उपकरण
    7. विभिन्न उपचारों के बीच विविधता के शैनन इंडेक्सस की तुलना के लिए, एएनसीओवीए का उपयोग करें, समय पर निरंतर निर्भर चर के रूप में आर।
    8. क्यूआईआईएम में पीसीओए में उपचार के बीच की दूरी की तुलना एक दो-तरफा स्टुडेंट के टी-टेस्ट का उपयोग करते हैं और बोनफ़ोरोनि सुधार का उपयोग करते हुए 1,000 मोंटे कार्लो क्रमपरिवर्तनों के साथ नॉनपेरामेट्रिक पी-वैल्यू की गणना करते हैं।
    9. विशिष्ट ओटीयू के सापेक्ष बहुतायत और अन्य मापा मापदंडों, जैसे कोलेस्ट्रॉल, एचडीएल, एलडीएल, आदि के बीच संबंधों का विश्लेषण, पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण का उपयोग करते हुए। इस समापन पर, साइनेटस्केप 3.1.1 24 का उपयोग करते हुए सहसंबंध नेटवर्क के बाद विज़ुअलाइज़ेशन के साथ CoNet 23 का उपयोग करें।

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Representative Results

बैक्टीरियोसिन का उत्पादन एलएबी में एक सकारात्मक प्रोबायोटिक विशेषता माना गया है, क्योंकि यह अवसरवादी बैक्टीरिया और रोगजनकों के विकास को रोकने के लिए माना गया था। इस काम का उद्देश्य एक माउस मॉडल में पेट माइक्रोबायोटा आबादी को नियंत्रित करने के लिए जीवाणुओं की क्षमता दिखाने के लिए था। इस प्रयोजन के लिए, बैक्टीरियोसिन उत्पादन करने वाले उपभेदों के सेवन के प्रभाव की तुलना करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई थी और उनके विषैले गैर-उत्पादक उपभेदियां थीं। टीका और परख के समय विस्तार की प्रक्रिया चित्रा 1 में दिखायी गई है। चूहे को ग्यारह पिंजरों में बांटा गया: किसी भी उपचार के बिना नियंत्रण, बैक्टीरियोसाइन-उत्पादक उपभेदों के साथ इलाज किये जाने वाले पांच पिंजरे, और संबंधित पिंडों के साथ इलाज किए गए पांच पिंजरे जो कम या कोई बैक्टीरियोसिन उत्पादन नहीं किया गया है। परीक्षण किए गए बैक्टीरियोसिन उत्पादन करने वाले एलएबी, साथ ही पीने के पानी में संबंधित मामलों (सीएफयू / एमएल) और मल में गिनती के बारे में संक्षेप में चित्रा 2 में एल्यूएब द्वारा बैक्टीरियोसिन उत्पादन का निर्धारण किया गया है जो मल से बरामद किया गया है। बैक्टीरियोसाइन उपचार और इज़ोजेनिक उपभेदों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे, जब सभी नमूनों और सभी बैक्टीरिया समूहों को एक साथ माना जाता था ( चित्रा 3 )। हालांकि, संभावनाएं भिन्न थीं जब विशेष रूप से जीवाणु पीढ़ी को स्वतंत्र रूप से अध्ययन किया गया था, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। इसके अलावा, पियर्सन के सहसंबंध विश्लेषण से पता चला है कि विभिन्न बैक्टीरिया जनरलों के बीच और सीरम में जीवाणु पीढ़ी और ट्रायग्लिसराइड्स और एलडीएल के बीच एक संबंध, जैसा कि चित्रा 5 में कोनेट में बनाया गया नेटवर्क दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक्सपी के समय पाठ्यक्रम डिजाइन को दिखा रहा है योजनाriment। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: लेब में बैक्टीरियोसिन उत्पादन की जांच तीन-परत प्रोटोकॉल (जैसा कि प्रक्रिया में वर्णित है) द्वारा भेड़ से प्राप्त हुई। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: बैक्टीरिया उपचार की संरचना की तुलना। एक पीसीओए प्लॉट को बिना किसी यूनिवेटेड यूनिफ्राक मैट्रिक्स की गणना की दूरी के आधार पर तैयार किया गया था। एक ही नमूने से अलग समय अंक ( एट अल से अनुकूलित , 2016 12 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: उपचार और बाद के उपचार कालों के दौरान जीनस स्तर पर लेब और बैक्टीरियोसिन-लक्षित बैक्टीरियल समूहों के रिलेबल एबबेंस में परिवर्तन। परिवर्तनसमय के संबंध में प्राप्त उपचार में जेनेसा के रिश्तेदार बहुतायत में, 0, नियंत्रण समूह (कों) में उन लोगों की तुलना की गई थी। चित्रण की स्पष्टता के लिए, केवल चार उपभेदों को दिखाया गया है: गर्विकिन और साकसिन उत्पादक और गैर-उत्पादक उपभेद (रंग और उपचार से संबंधित चित्र में किंवदंती देखें)। त्रुटि सलाखें मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करतीं हैं। महत्व की डिग्री निम्नानुसार प्रदर्शित की गई है: पी <0.1 के साथ डॉट (।); पी <0.05 एक स्टार (*) के साथ; पी <0.01 के साथ दो सितारों (**)। उमु एट अल से अनुकूलित , 2016 12 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: दिन 14 और सीरम स्तर पर ओटीयू के सापेक्ष लाभ के सहसंबंध नेटवर्क। सहसंबंध थेकोलनेट में पीयरसन के सहसंबंध का उपयोग करते हुए लिकलेट केवल महत्वपूर्ण वाले (पी <0.05) नेटवर्क पर दिखाए जाते हैं। सीरम में निर्धारित पैरामीटर - कुल कोलेस्ट्रॉल ( चोल ), उच्च घनत्व वाली लिपोप्रोटीन ( एचडीएल ), कम घनत्व वाली लिपोप्रोटीन ( एलडीएल ) और ट्राइग्लिसराइड्स ( त्रिग - एक रंग (ग्रे) द्वारा दिखाए जाते हैं, जबकि विभिन्न परिवारों से जुड़े ओ.टी.यू. अलग अलग रंग (कथा देखें)। सकारात्मक सहसंबंध हरी किनारों, और लाल किनारों के साथ नकारात्मक सहसंबंध के साथ प्रदर्शित होते हैं। नोड्स पर otus OTU नंबर या जीनस जो वे संबंध रखते हैं। से Umu एट अल।, 2016 12 अनुकूलित के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पीने के पानी में inoculated लैक्टिक एसिड जीवाणुओं में मल का गिना जाता है संकेतक उपभेद
सीएफयू / एमएल (लॉग 10) सीएफयू / जी (लॉग 10 मतलब है)
नियंत्रण ---- 10 चूहों एन डी
लैक्टोबैसिलस फीइटी बी 1500 (एसकेए +) 1.6 9 चूहों 8.53 ± 0.18 एंटोकोकस फासीमीम पी 21 (एलएमजी 2783)
लैक्टोबैसिलस फीइटी बी 1501 (साका -) 2.0 9 चूहों 8.22 ± 0.05
पेडीकॉक्सीस एसिडिलैक्टिकिया बी 15050 (पैड +) 26 9 चूहों 8.73 ± 0.12 एंटोकोकस फासीमीम पी 21 (एलएमजी 2783)
Pediocccuएस एसिमलैक्टिक बी बी 1503 (पैड -) 25 9 चूहों 8.75 ± 0.09
एंटोकोकस फासीमियम बी 1 504 (एल 50 वेट +) 6 9 चूहों 8.83 ± 0.14 पेडीकोकस डेमोनोसस (एलएमजी 3397)
एन्ट्रोकोकस फासीमियम बी 1 505 (एल 50 ठीक -) 10 9 चूहों 8.72 ± 0.14
लैक्टोबैसिलस प्लांटारम बी 1 1507 (रोडा +) 26 9 चूहों 9.14 ± 0.14 लैक्टोबैसिलस एसपीपी 9 65 (एलएमजी 2003)
लैक्टोबैसिलस प्लांटारम बी 1 508 (प्लाटा -) 23 9 चूहों 8.60 ± 0.18
लैक्टोकोकस गारिजिया बी 1515 (गार्म +) 17 9 चूहों 8.41 ± 0.08 लैक्टोकोकस लैक्टिस IL1403 (एलएमजी 2705)
लैक्टोकोकस गारिजिया बी 1516 (गार्मल -) 17 9 चूहों 8.05 ± 0.18
सैक और पेडपीए 1 के लिए एन्ट्रोकोकस फासीमीम पी 21 (एलएमजी 2783), एटरेकिन के लिए पेडीकोकस डेमोनोसस (एलएमजी 33 9 7), लैक्टोबैसिलस एसपीपी 9 65 (एलएमजी 2003) प्लांटारिसिन के लिए, और लैटोकोकस लैक्टिस आईएल 1403 (एलएमजी 2705) गारमिल के लिए।

तालिका 1: इनक्यूलेटेड स्ट्रेंन्स और फेल्ट नमूने में गिनती।

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Discussion

यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया है कि माइक्रोबायोटा में परिवर्तन स्वास्थ्य या आयु तक सीमित हैं या नहीं। प्रोटोकॉल के विभिन्न भागों महत्वपूर्ण हैं, लेकिन उनमें से, मल के नमूने, अनुक्रमित और विश्लेषण किए जाने वाले डीएनए टुकड़ा का चयन करना, और डीएनए निष्कर्षण करना और जैव-सूचनात्मक विश्लेषण निश्चित रूप से सबसे महत्वपूर्ण बिंदु हो सकते हैं। नमूनाकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि नैतिक कारणों से, चूहों पर बल नहीं होना चाहिए और क्योंकि यह पेट में बैक्टीरिया का अनुपात बदलने के लिए जाना जाता है। नमूनों को जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाना चाहिए या उपयोग तक तब तक जमे हुए होना चाहिए क्योंकि कुछ बैक्टीरिया निर्जलीकरण और / या ऑक्सीजन के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। प्रवर्धित 16 एस आरआरएनए जीन से अनुक्रमित डीएनए टुकड़ा का चयन एक महत्वपूर्ण बिंदु है। इस काम में, चर क्षेत्रों V3 - V4 का चयन 25 डीएनए निष्कर्षण विधि के महत्व को कम करके आंका नहीं जाना चाहिए, क्योंकि नमूनों में मौजूद बैक्टीरियल कोशिकाएं सभी ईक नहीं हैंअलग-अलग लिसेज़ प्रोटोकॉल के प्रति संवेदनशील, और बैक्टीरिया की आबादी के अनुमान में पूर्वाग्रह अधूरे विश्लेषण से हो सकता है। इसलिए, मनका बीटर चरण की शुरूआत आवश्यक है। Isogenic उपभेदों आनुवंशिक दस्तक द्वारा या प्लाज्मिड क्यूरेशन द्वारा बनाया जा सकता है, हालांकि उपभेदों के मामले में, रूपांतरण क्रोमोसोम-एन्कोडेड बैक्टीरियॉसिन्स के लिए एक समस्या का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इस प्रक्रिया को विभिन्न विशिष्ट संवर्धन तकनीकों का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि अनैरोबिक विधि 26

अध्ययन की जाने वाली कारक परिवर्तनों के प्रकार के आधार पर प्रक्रिया को सबसे अधिक चरणों में संशोधित किया जा सकता है। टीकाकरण प्रक्रिया को छोटा किया जा सकता है, लेकिन सीरम मापदंडों में परिवर्तन के लिए कुछ समय का विकास हो सकता है। विधि का एक संभव सीमा बैक्टीरियल उपभेदों (पोषक तत्व या यौगिकों) का अध्ययन हो सकता है जो पानी में कई घंटों तक नहीं रह सकता है या जो यौगिकों (या यौगिकों के लिए वेग) हो सकता है। इसलिए, यह एक कारक है जो अल को चाहिए तो विचार करें

अब तक, बैक्टीरियोसिन गतिविधि आम तौर पर इन विट्रो 27 , 28 , 29 या मिश्रित संस्कृतियों 30 में निर्धारित की गई थी। इस पद्धति ने मानक प्रयोगशाला चूहों के पूरे-पेट माइक्रोबायोटा से पांच जीवाणुओं की गतिविधियों की निगरानी में अनुमति दी है। आबादी में लघु रूपांतरों को निर्धारित किया जा सकता है, साथ ही साथ अन्य बैक्टीरियल समूहों या शारीरिक कारकों पर सीरम मापदंडों जैसे उनके प्रभाव 12 । बैक्टीरियॉसिन्स में अपेक्षाकृत संकुचित गतिविधि स्पेक्ट्रम है, टैक्सोनॉमिक रूप से संबंधित बैक्टीरिया के विकास में बाधा हालांकि, इस परख में प्रयुक्त लोग सबसे प्रभावी में से हैं, क्योंकि उनमें से कुछ स्टेफिलाकोकास ऑरियस , लिस्टिरिया मोनोसाइटोजिनेस 31 , और एस्चेरिचिया कोली के कुछ उपभेदों के विरुद्ध सक्रिय हैं, जैसे कि साबैकिन ए के मामले मेंAss = "xref"> 32 जब चूहों में inoculated, एलएपी उत्पादन बैक्टीरियोसाइन वैश्विक microbiota संरचना में उल्लेखनीय परिवर्तन को जन्म नहीं दिया, बल्कि एक कम संख्या में बैक्टीरिया taxa के लिए। फिर भी, वैश्विक सहसंबंध नेटवर्क विश्लेषण से पता चला कि विभिन्न जीवाणुओं के बीच दिलचस्प पारिस्थितिकीय संगतताएं और विरोध। इस विधि को भोजन के घटकों, दवाओं या अन्य यौगिकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि अपेक्षित परिणाम जानबूझकर स्वस्थ स्थितियों को संरक्षित करने के लिए प्रतिबंधित कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने ईईए ग्रांट नोल्स साइंस एंड रिसर्चैबिलिटी कोऑर्डिनेटेड मॉबिलिटी ऑफ रिसर्चर्स (संदर्भ 017-ABEL-CM-2013) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। सीबी और जीपी-एम स्पेनिश सरकार के अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धात्मकता से AGL2015-70487-P अनुदान द्वारा समर्थित थे ओक्यूओ और डीबीडी को नॉर्वेजियाई यूनिवर्सिटी ऑफ लाइफ साइंसेज (एनएमबीयू) (प्रोजेक्ट 1205051025) से खाद्य विज्ञान अनुसंधान के लिए रणनीतिक छात्रवृत्ति कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। जानवरों की सुविधा में प्रयोगशाला सामग्री की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए हम पशु देखभाल और नमूने और यीशु देहेसा के साथ उनकी सहायता के लिए इनकमुलादा नोगुएरा को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। हम सांख्यिकी के बारे में उनकी सलाह के लिए प्रोफेसर लार्स-गुस्ताव स्निपेन की भी प्रशंसा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mice (female) Harlan Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish Thermo Scientific 101VR20
Brain-Heart-Infusion broth Conda 1400.00
European Bacteriological Agar Pronadisa 1800.00
Agarose D1 Low EEO Pronadisa 8010.00
1x TAE buffer Thermo Scientific 15558042
MRS broth Difco 288130
PBS tablets Sigma P4417-100TAB
scale Mettler Toledo PB602-S
sterile forceps Levantina de Laboratorios S.L. 260-3710014
Microcentrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Hermle Z383K
sodium chloride AppliChem Panreac 121659.1211
Realpure SSS Kit Real Life Science Solutions, Durviz, Spain RBME04 (300 ml)
Isopropanol AppliChem Panreac 131090.1611
Ethanol AppliChem Panreac 131086.1214
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
AMPure XP beads Beckman Coulter Genomics, USA A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit Quanta BioSciences, Maryland, USA 733-2300
MiSeq v3 reagent kit Illumina, San Diego, California, USA MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit FC-131-1002 Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. Sigma Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter Biospec Products 11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609.25
Omni Bead Ruptor 24 Omni International Inc. 19-040
mutanolysin Sigma M9901-10KU
lysozyme Roche 10837059001
proteinase K Roche 3115887001
RNase A Sigma R4875

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References

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Bäuerl, C., Umu, Ö. C. O.,… More

Bäuerl, C., Umu, Ö. C. O., Hernandez, P. E., Diep, D. B., Pérez-Martínez, G. A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice. J. Vis. Exp. (125), e56053, doi:10.3791/56053 (2017).

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