Summary
Bakteriociner antas å spille en nøkkelrolle i å definere mikrobiell mangfold i forskjellige økologiske nisjer. Her beskriver vi en effektiv prosedyre for å vurdere hvordan bakteriociner påvirker tarmmikrobiotasammensetningen i en dyremodell.
Abstract
Svært spennende spørsmål oppstår med vår fremvoksende kunnskap om tarmmikrobiotasammensetningen og forholdet til helse, spesielt knyttet til forhold som bidrar til å opprettholde befolkningsbalansen. Det er imidlertid begrenset tilgjengelige metoder for å evaluere disse faktorene. Bakteriociner er antimikrobielle peptider produsert av mange bakterier som kan gi en konkurransefortrinn for matinnkjøp og / eller nisjestifting. Mange probiotiske melkesyrebakterier (LAB) -stammer har stort potensiale for å fremme menneskers og dyrs helse ved å hindre veksten av patogener. De kan også brukes til immunmodulasjon, da de produserer bakteriociner. Den antagonistiske aktiviteten til bakteriociner bestemmes imidlertid normalt av laboratorie bioassays under veldefinerte, men overforenklede forhold sammenlignet med det komplekse tarmmiljøet i mennesker og dyr, hvor bakterier står overfor multifaktoriale påvirkninger fra verten og hundrevis av mikrobielle arter sHaring samme nisje. Dette arbeidet beskriver en komplett og effektiv prosedyre for å vurdere effekten Av en rekke bakteriociner med forskjellige mål-spesifisiteter i et murint system. Endringer i mikrobiotasammensetningen under bakteriocinbehandlingen overvåkes ved anvendelse av komposisjonell 16S rDNA-sekvensering. Vår tilnærming bruker både bakteriocinprodusentene og deres isogene ikke-bakteriocin-produserende mutanter, sistnevnte gir muligheten til å skille bakteriocin-relatert fra ikke-bakteriocin-relaterte modifikasjoner av mikrobiota. Fekal DNA-ekstraksjonen og 16S rDNA-sekvenseringsmetodene er konsistente og sammen med bioinformatikk utgjør en kraftig prosedyre for å finne svake forandringer i bakterieprofilene og å etablere korrelasjoner, når det gjelder kolesterol og triglyseridkonsentrasjon, mellom bakteriepopulasjoner og helsemarkører. Vår protokoll er generisk og kan derfor brukes til å studere andre forbindelser eller næringsstoffer med potensial for å endre vertsmikrofonenRobiota-sammensetning, enten når man studerer toksisitet eller gunstige effekter.
Introduction
Bakteriociner er antimikrobielle peptider produsert av et bredt spekter av bakteriearter 1 , 2 . Disse forbindelsene og deres produsenter, spesielt LAB, har blitt utforsket og utnyttet verden over i flere tiår for deres potensielle bruksområder i matvern og medisin 3 . Flere bakteriociner er kjent for å drepe viktige patogener, inkludert arter av Listeria, Enterococcus, Staphylococcus og Bacillus . Noen bakteriociner har selv muligheten til å modulere immunresponsen 4 . Mange bakteriociner har relativt smale spektra, en egenskap som er mye verdsatt i enkelte applikasjoner. For eksempel kan noen smalspektrede bakteriociner brukes til å lede spesifikk aktivitet mot utvalgte grupper av problematiske bakterier, uten mye forstyrrelse på commensal eller gunstig flora som deler samme nisje; Dette er spesielt viktig i tarmenOnment, hvor mange gunstige mikrober trives på en interaktiv og dynamisk måte 5 . Bakteriociner er også svært attraktive for profylaktisk eller probiotisk bruk, da de kan undertrykke (ut) vekst av patogener, patobioner eller opportunistiske bakterier som kan ubalanse tarmhemostasen 6 , 7 .
Når det gjelder deres natur og fysisk-kjemiske egenskaper, er bakteriociner svært forskjellige, da de har forskjellige strukturer, målspesifikasjoner, virkemåter etc. De fleste bakteriociner er studert i stor detalj i in vitro- innstillinger, men svært få er testet i mat Matriser 8 , 9 eller in vivo, som for eksempel i en dyregutt 6 , 10 . In vitro- egenskapene kan variere i stor grad når de vurderes in vivo på grunn av kompleksiteten oF tarmmiljøet og også til påståelige utilsiktede effekter på gunstige bakterier. De fleste probiotika er LAB. De produserer en rekke andre metabolitter, inkludert kortkjedede fettsyrer, som er kjent for å påvirke vertenes fysiologi, samt å demonstrere antimikrobielle egenskaper mot visse bakterier. Derfor, når det gjelder probiotiske stammer som produserer bakteriociner, er det best å etablere realistiske analyser, for eksempel sunne dyr med normal mikrobiota.
I den foreliggende studien gir vi en strategi som muliggjør vurdering av effekten av forskjellige bakteriocin-produserende stammer, hvis bakteriociner har forskjellige hemmende spektra på friske mus. Vår strategi inkluderer fôring av mus med isogene ikke-bakteriocinmutanter, som muliggjør differensiering av bakteriocin-medierte effekter fra ikke-bakteriocin-medierte effekter. Sequencing 16S rDNA muliggjør å følge de dynamiske endringene av bakteriepopulationen i tarmen. SubsEkvivalent statistisk analyse avgir korrelasjoner mellom bakteriearter og også mellom bakteriearter og målte fysiologiske parametere ( f.eks. Kroppsvekt, serumbiokjemiske parametere, etc. ). Vi tror at protokollen som presenteres i denne studien, også gjelder for andre probiotiske eller prebiotiske anvendelser utover studiet av bakteriociner hos levende dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleie og håndtering må utføres på en spesialisert dyrepleie enhet. Prosedyrene som er beskrevet her, ble godkjent av den tilsvarende etikkutvalget ved Universitetet i Valencia og lokale myndigheter, og fulgte prinsippene for laboratoriedyrpleie obligatorisk i EU-lov og 2010/63 / EU og den spanske regjeringen RD 53/2013 om beskyttelse av dyr Brukes til vitenskapelige formål, for å respektere 3R-prinsippet i dyreforsøk (erstatning, reduksjon, forfining).
1. Frosne bakteriekulturer som brukes til å inokulere mus
- Inokulere individuelle stammer av LAB i 5 ml hjerne-hjerteinfusjon (BHI) medium og dyrk dem i 20-24 timer (over natten) ved 30 ° C.
- Fortyn hver bakteriekultur over natten 100 ganger i BHI ved å overføre 2 ml over natten kultur til 200 ml BHI. Vokse dem ved 30 ° C i 20-24 timer.
MERK: Stammer brukt i denne studien er oppført i tabell 1. - Harvest ceVed sentrifugering ved 5000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og vaske cellene to ganger ved å suspendere hver cellepellet i 100 ml iskald fosfatbuffet saltvann (PBS) og samle cellerne som i trinn 1.3.
- Etter den andre vasken, suspender hver cellepellet i 20 ml iskald 15% glycerol i PBS.
- Del cellesuspensjonen i 1 ml volum i rør og lagre dem deretter ved -80 ° C til bruk.
MERK: Cellene skal brukes innen 1-2 måneder etter dette punktet. - Bestem celle nummeret før lagring og før administrering slik at antall levende celler gitt til mus er kjent.
- For celle telling, gjør ti ganger serielle fortynninger av celler i iskall 0,9% natriumklorid (NaCl) løsning. Spre 100 μl av hver fortynning på en BHI agarplate. Inkuber natten over (20-24 timer) ved 30 ° C for cellevekst og koloniformasjon, sistnevnte for å bestemme kolonidannende enheter (cfu) / mL.
- For å lage bakterieholdig drikkevann, fortynne celler fra hver bakteriel bestandeskultur i 100 ml sterilt, filtrert drikkevann, med en endelig gjennomsnittlig cfu på 10 9 / ml vann. For bakteriell overlevelsesvurdering teller levende celler like etter fortynning og etter 24 timer en gang i uken i løpet av de to første ukene av bakteriebehandling.
2. Mus Assay og eksperimentell design
Merk: Spesifikke patogenfrie (SPF) BALB / c unge kvinnelige mus (6 - 8 uker) er nødvendig for dette eksperimentet; Her ble totalt 100 dyr kjøpt.
- Gi musene fri tilgang til pelletert mat og vann gjennom hele forsøket.
- Utform eksperimentet og beregne effekten.
- Hvis hver behandling har sin egen kontroll, gjelder en parret case-control design (t-test). Bruk en foreløpig analyse for å beregne gjennomsnittlig og standard feil av den viktigste effekten som skal bestemmes. Optimalisere effekten av analysen og antall dyr som trengs per gruppe ved hjelp av forskjellige metoder og fritt tilgjengelige programmer 11 .
- For å teste for virkningene av bakteriocinprodusent versus ikke-produsentstammer, bruk 9 dyr per eksperimentell tilstand.
MERK: Dette nummeret ble bestemt ut fra eksperimentell standardfeil og ga en tilfredsstillende effekt (0,7-1,0) og et signifikansnivå under 0,05.
MERK: I det givne eksemplet ble det laget 11 grupper med mus, en per bur. Ti burder korresponderte med behandlinger med 5 bateriocin-produserende stammer og de tilsvarende 5 isogene ikke-produserende stammer; den 11. buret hadde 10 mus og utgjorde den ubehandlede kontroll.
- Etter ankomsten av musene til oppdrettsanleggene, distribuere dem i bur og øremærke dyrene for å tillate individuell sporing. Akklimatiser musene til husdyrhold og forhold for en uke før sroceeding.
- Forbered bakterieholdig drikkevann, som beskrevet i trinn 1.8, og plasser drikkevannflasker i de tilsvarende uavhengige burene som er tydelig identifisert slik at musene i hvert bur deler samme vannflaske.
MERK: Kontrollgruppen må oppbevares i et eget bur, uten kontakt med de testede bakteriene. - Klargjør en ny flaske med fersk drikkevann (100 ml) hver dag og tilsett nyopptete bakterielle suspensjoner. Gjør dette i 15 sammenhengende dager.
- Følg bakteriebehandlingen med en periode på to uker, i hvilken periode musene drikker bakteriefri vann ( figur 1 ).
3. Samle prøver
- Samle fecal prøver.
- Klargjør autoklaverte bur (tom) og sterile tang og merk sterile 1,5 ml rør for hver mus.
- Samle prøver på samme tid på dagen for å unngå variasjoner i mikrobiotasammensetningen i løpet av dagenE løpet av en dag. For å få de beste resultatene, samle friske prøver separat.
MERK: Samle avføring fortrinnsvis tidlig om morgenen, når mus har en tendens til å avdekke spontant. - Rengjør et tomt bur med 70% alkohol og legg en mus innvendig. Tillat det å avdekke, og samle 2-4 fekale pellets ved hjelp av sterile pincett, og plasser dem i 1,5 ml rør.
MERK: Noen ganger er det nok å holde musen halen oppover; Avføringen kan deretter samles direkte fra anus til et rør. - Samle fekalprøver fra hver mus en gang i uken i løpet av fire-ukers eksperimentet ( Figur 1 ). Samle de første prøvene på dag ett (T0, tid null), like før eksponeringen av musene til bakterier. Samle følgende fecale prøver på dagene 7, 14, 21 og 28.
- Kjøle prøvene ved 4 ° C til transporten til laboratoriet, hvor de fryses ved -80 ° C. Planlegg på forhånd og gi nok oppbevaringsbokser, som et stort antall feKalprøver blir samlet under forsøket.
- Veie alle mus hver uke på fecal samlingsdag.
- Samle blodprøver fra ansiktsvenen fra alle mus den 15. dag, den siste dag av bakterier administrering, og bestemme nivået av triglyserider, total kolesterol, høy tetthet lipoprotein (HDL), og low-density lipoprotein (LDL) i Blodserum.
MERK: Erfarne personell skal samle blodet for å redusere stress i dyrene.
4. LAB Counting og Bacteriocin Activity
- Vei en fekal pellet av hver prøve i et 1,5 ml rør og tilsett et tilstrekkelig volum iskall 0,9% NaCl for å oppnå en 10% (vekt / volum) løsning. Bruk sterile mikropestler til 1,5 ml rør for å homogenisere fecal suspensjonen og tilbered ti ganger serielle fortynninger i iskald 0,9% NaCl.
- Telle totalt antall LAB-celler.
- Overfør fortynnede celler (100 μL) til 4 ml forvarmet MaN Rogosa Sharpe (MRS) myk agar (50 ° C, 0,8% agar). Bland ved vortexing før du brener cellene på en solid MRS agarplate (1,5% agar).
- Tørk platen ved å ta lokket av i 5-10 minutter i den sterile hetten før inkubering av cellene i 20-24 timer ved 30 ° C for cellevekst og kolonidannelse.
- Telle bakteriocin-produserende celler.
- Overfør fortynnede celler (100 μl) av bakteriocinprodusenten til 4 ml forvarmet MRS myk agar (50 ° C, 0,8% agar), bland ved vortexing og hell cellene på en MRS agarplate (1,5% agar); Dette laget er referert til som det første laget.
- Overfør ytterligere 4 ml cellefri MRS myk agar (0,8% agar) på det første laget for å legge inn alle cellene i den myke agar.
MERK: Dette laget er ment å forhindre at celler vokser som kolonier på overflaten av agarplatene. Celler som vokser på overflaten blir lett fordrevet når de hælder indikatorceller på toppen (trinn 4.3.4) ogVil derfor komplisere tolkningen av resultatene. Dette laget er referert til som det andre laget. - Tørk platen ved å ta lokket av i 5-10 minutter i den sterile hetten før inkubering i 20-24 timer ved 30 ° C for cellevekst og kolonidannelse.
- For å identifisere bakteriocin-produserende kolonier blandes 40 μl av en nattkultur med en passende indikatorstamme, som vist i tabell 1 , med 4 ml forvarmet myk agar. Hell blandingen på platen; Dette laget er referert til som det tredje laget.
- Tørk platen ved å ta lokket av i 5-10 minutter i den sterile hetten før inkubering i 20-24 timer ved 30 ° C for cellevekst og kolonidannelse.
MERK: Bakteriocin-produserende kolonier har klare (inhiberende) soner rundt koloniene ( Figur 2 ).
5. DNA-ekstraksjon, 16S-rDNA-amplifisering og sekvensering
MERK: Trinn fEller DNA-ekstraksjon er beskrevet for bruk av et kommersielt sett ( f.eks. Realpure "SSS" Kit).
- Suspensér 1 - 2 fekale muspellets (~ 200 mg) i 300 μl lysisoppløsning.
- Overfør prøven til en 2 ml mikrotube hvor ca 0,5 g glassperler (diameter: 0,1 mm) tidligere er plassert.
- Tilsett 1 μl mutanolysin ved 10 U / μl og 2 μl lysozym ved 20 mg / ml til hver prøve og inkuber ved 37 ° C i 40 - 60 min. Fortsett med en av standardprotokollene for DNA-ekstraksjon fra fekale prøver 12 .
- Påfør to sykluser av bead-beater trinn, 1 min hver.
- Tilsett 2 μl proteinase K og bland godt.
- Inkubér i 20 min og virvel hver 5 min.
- Kjøle prøvene til 37 ° C og tilsett 1 μl 5 μg / ml RNase A til prøven. Bland godt.
- Inkuber ved 37 ° C i 30 - 60 minutter.
- Kjøle prøvene til romtemperatur og tilsett 180 μLAv proteinutfellingsløsning. Vortex kraftig ved maksimal hastighet i 20 - 30 s.
- Sentrifuge ved 16 000 xg i 5 min. Hvis det er partikler som flyter i supernatanten, inkuberes prøvene i is i 5 minutter og sentrifugeres deretter igjen.
- Overfør supernatanten som inneholder DNA til en ny 1,5 ml mikrotube inneholdende 300 ul isopropanol.
- Bland ved å invertere rørene 20-30 ganger og inkuber i 1 time ved -20 ° C. Alternativt, inkuber rørene lengre en periode ( f.eks. Over natten).
- Sentrifuger ved 16 000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og tørk røret på absorberende papir. Tilsett 300 μl 70% etanol for å vaske DNA-pellet.
- Sentrifuger ved 16 000 xg i 1 min, fjern supernatanten, og la pelleten tørke i ca. 15 min.
- Når pellet er tørr, tilsett 100 μl sterilt vann eller Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) buffer og resuspender pelleten.
- For å eliminere eventuelle hemmendeForbindelser under påfølgende trinn, rengjør DNA. Bland ekstraktet DNA med 2 volumer (200 ul) buffer NTI for å justere bindingsbetingelsene for trinn 5.15.
- Plasser en silikamembranholdig PCR-oppryddingskolonne i et oppsamlingsrør (2 ml) og last prøven.
- Sentrifuger i 30 s ved 11 000 x g. Kast bort gjennomstrømmingen.
- Vask silikamembranen med 700 ul buffer NT3 og gjenta trinn 5.16.
- Tørk silikamembranen ved sentrifugering i 1 min ved 11 000 xg for å fjerne eventuell resterende etanolholdig vaskebuffer NT3.
- Overfør kolonnen til en ny 1,5 ml mikrotube og inkuber i 2-5 minutter ved 70 ° C for total fjerning av etanol.
- Tilsett 30 μl PCR-vann og inkuber i 5 minutter ved 70 ° C. Avløp ved sentrifugering i 1 min ved 11 000 x g.
- Kvantifiser DNA med et UV / Vis-spektrofotometer eller en fluorometrisk metode.
- Normaliser og pool DNA-prøvene fra mus som deler samme bur på ea Ch tidspunkt.
- For å observere individuelle variasjoner i løpet av tiden, sekvens DNA-prøver fra tre tilfeldig utvalgte mus fra kontrollen og to andre tilfeldige bur på dagene 0, 14 og 28.
6. 16S rRNA-genforsterkning og sekvensering
- Forbered et bibliotek med amplifiserte 16S rRNA-gener. Forsterk V3-V4-regionen i det bakterielle 16S rRNA-genet 5 ved bruk av fremover- og revers-primere med passende overhengsmoduler:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Kontroller de forsterkede båndene ved hjelp av elektroforese med 1% agarosegel.
- Rengjør polymerasekjedereaksjons-PCR-produktene ved hjelp av magnetiske perler for amplikonrensing.
- Fortsett med følgende trinn som angitt av produsenten i henhold til den massive sekvenseringsplattformen som brukes> 6.
7. Dataanalyse og statistikk
- Kvalitet filtrering (vanligvis utført på sekvenseringsanlegg).
- Filtrer råen, leser data og de-multiplex ved hjelp av programvaren som følger med utstyret.
- Behandle sammenkoblede leser ved hjelp av UPARSE-rørledningen 13 implementert i USEARCH 14 (versjon 7.0.1090). Slå sammen de parrede endene og bruk kvalitetsfiltrering ved å bruke en maksimal forventet feil (maxee) -verdi på 1,0. Kast sekvenser mindre enn 150 nt. Derepliser sekvenser for å kaste bort singletoner.
- Klyv sekvensene i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUer) på en 97% sekvensidentitet og bruk UCHIME 15 for å filtrere kimære sekvenser.
- OTU plukking, taksonomisk oppgave og fylogenetisk rekonstruksjon, og mangfoldsanalyser og visualiseringer.
- Behandle OTUene ved å bruke Quantitative Insights IntO Mikrobiel økologi (QIIME) 16 .
- Velg og juster de representative OTUene mot Greensens kjernedatabase 17 ved hjelp av PyNAST 18 med en minimumsidentitet på 75% (standard).
- Tilordne taksonomi til de justerte sekvensene ved hjelp av Ribosomal Database Project (RDP) klassifiseringsprogrammet 19 med en tillit på 0,8.
- Normaliser OTU-tabellen til sekvensantallet av prøven med den laveste sekvensdybden.
- Bygg et filogen tre fra justerte sekvenser ved å bruke Fast Tree 20 etter filtreringstrinnet for å fjerne svært variable områder og stillinger som er alle hull. Bruk dette treet til å beregne alfa- og beta-forskjeller og å beregne sjeldne kurver og Shannon-indekser.
- For å generere og visualisere uveide UniFrac avstandsverdier 21 , bruk prinsipp koordinatanalyse (PCoA).
MERK: For statistical analyse, forskjellige programvarepakker kan anvendes, slik som R-22, eller de statistiske verktøy gjennomføres innenfor QIIME 16. - For å sammenligne Shannon indekser av mangfold mellom de ulike behandlingene, bruk en ANCOVA, vurderer tid som en kontinuerlig avhengig variabel i R.
- Sammenlign avstandene mellom behandlinger i PCoA i QIIME ved hjelp av en tosidig Students t-test og beregne de ikke-parametriske p-verdiene med 1000 Monte Carlo-permutasjoner ved hjelp av Bonferroni-korreksjonen.
- Analyser for korrelasjoner mellom den relative overflaten av bestemte OTUer og andre målte parametere, slik som serumnivåer av kolesterol, HDL, LDL, etc. ved bruk av Pearson korrelasjonsanalyse. Til dette formål bruker du CoNet 23 med den påfølgende visualiseringen av korrelasjonsnettverk ved hjelp av Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produksjonen av bakteriociner har vært ansett som en positiv probiotisk egenskap i LAB, da det antas å forhindre vekst av opportunistiske bakterier og patogener. Målet med dette arbeidet var å vise bakteriocins kapasitet til å modulere tarmmikrobiotapopulasjoner i en musemodell. For dette formål ble det utviklet en prosedyre for å sammenligne effekten av inntaket av bakteriocin-produserende stammer og deres isogene ikke-produserende stammer. Prosedyren for inokuleringen og tidsforlengelsen av analysen er vist i figur 1 . Mus ble gruppert i elleve bur: En kontroll uten behandling, fem bur behandlet med bakteriocin-produsentstammer og fem bur behandlet med de tilsvarende isogene mutanter som har redusert eller ingen bakteriocinproduksjon. Den testede bakteriocin-produserende LAB, samt de respektive teller (cfu / ml) i drikkevann og teller i avføring, er oppsummert i
Figur 1: Ordning Viser Time Course Design of the Experiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Deteksjon av bakteriocinproduksjon i LAB gjenopprettet fra avføring ved en trelagsprotokoll (som beskrevet i prosedyren). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av sammensetningen av bakteriebehandlingene. En PCoA-plott ble generert basert på de beregnede avstandene i en uvektet UniFrac-matrise. Ulike tidspunkter fra samme prøve ( et al. , 2016 12 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Endringer i relativ overflod av LAB og bakterierocin-målrettede bakteriegrupper på slektsnivå under behandlings- og etterbehandlingsperioder. EndringS i de relative mengder av slægter i behandlinger, oppnådd med hensyn til tid 0, ble sammenlignet med de i kontrollgruppen (CON). For tydelighet av illustrasjonen vises bare fire stammer: Garvicin- og Sakacin-produsent og ikke-produsentstammer (se legenden i figuren for å forholde seg til farge og behandling). Feilstenger representerer standardavviket. Betydningsgrad er representert som følger: P <0,1 med prikk (.); P <0,05 med en stjerne (*); P <0,01 med to stjerner (**). Tilpasset fra Umu et al. , 2016 12 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Korrelasjonsnettverk med relativ overflod av OTU på dag 14 og serumnivåer. Korrelasjonene var ca.Lculated ved hjelp av Pearson korrelasjon i CoNet. Bare de signifikante (P <0,05) vises på nettverket. Parametre bestemt i serum - total kolesterol ( Chol ), høy tetthetslipoprotein ( HDL ), LDL og triglyserider ( Trig - vises med en farge (grå), mens OTUer tilhørende forskjellige familier er representert av Forskjellige farger (se legenden). Positive korrelasjoner vises med grønne kanter og negative korrelasjoner med røde kanter. OTU på noder er representert med OTU tall eller slekten de tilhører. Tilpasset fra Umu et al. , 2016 12 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Inokulert i drikkevann | Melkesyrebakterier teller i avføring | Indikatorstammer | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (gjennomsnittlig log10) | |||
| KONTROLL | ---- | 10 mus | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 mus | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA-) | 2.0 | 9 mus | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 mus | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 mus | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 mus | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 cured -) | 10 | 9 mus | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 mus | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 mus | 8.60 ± 0.18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 mus | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 mus | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) for SakA og PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) for enterociner, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) for plantariciner, og Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) for GarML. | ||||
Tabell 1: Inokulerte stammer og teller i fekale prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren beskrevet her har blitt brukt til å avgjøre om endringer i mikrobiota er bundet til helse eller alder. Forskjellige deler av protokollen er viktige, men blant dem kan prøveeksempler av avføring, valg av DNA-fragmentet som sekvenseres og analyseres, og utførelse av DNA-ekstraksjon og bioinformatisk analyse sikkert være de mest kritiske punktene. Prøvetaking er avgjørende fordi av etiske årsaker ikke mus skal stresses, og fordi det er kjent å endre andelen bakterier i tarmen. Prøver må behandles så snart som mulig eller skal fryses inntil bruk, da enkelte bakterier er svært følsomme for dehydrering og / eller oksygen. Utvelgelsen av DNA-fragmentet som skal sekvenseres fra de amplifiserte 16S rRNA-gener er et avgjørende punkt. I dette arbeidet ble de variable regioner V3 - V4 valgt 25 . Betydningen av DNA-ekstraksjonsmetoden må ikke undervurderes, da bakterielle celler tilstede i prøvene ikke er alle ekvUalsk sensitiv for forskjellige lysisprotokoller, og biaser i estimeringen av bakteriepopulasjonene kan skyldes ufullstendig lysis. Derfor er introduksjonen av et beadbeater-trinn nødvendig. Isogene stammer kan konstrueres ved genetisk nedbrytning eller ved plasmidkurering, men i tilfelle av stammer kan ildfaste til transformasjonskromosomkodede bakteriociner representere et problem. Denne fremgangsmåten kan tilpasses ved anvendelse av forskjellige spesifikke dyrkingsteknikker, som anaerobe metoder 26 .
Prosedyren kan modifiseres i de fleste trinn, avhengig av hvilken type faktorendringer som skal studeres. Inokulasjonsprosedyren kan forkortes, men endringer i serumparametere kan trenge litt tid å utvikle. En mulig begrensning av metoden kan være studien av bakteriestammer (næringsstoffer eller forbindelser) som ikke kan overleve flere timer i vann eller som kan klumpe (eller utfelle for forbindelser). Derfor er dette en faktor som må al Så vurderes.
Hittil ble bakteriocinaktivitet generelt bestemt in vitro 27 , 28 , 29 eller i blandede kulturer 30 . Denne metoden har gjort det mulig for in vivo- overvåking av aktivitetene av fem bakteriociner fra hel-gut-mikrobioten av standard laboratoriemus. Små variasjoner i populasjoner kan bestemmes, så vel som deres innflytelse på andre bakteriegrupper eller fysiologiske faktorer, som serumparametere 12 . Bakteriociner har et relativt smalt aktivitetsspekter, som hemmer veksten av taksonomisk relaterte bakterier. Imidlertid er de som brukes i denne analysen, blant de mest effektive, som noen av dem er aktive mot Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 , og til og med noen stammer av Escherichia coli , som i tilfelle av sakacin AAss = "xref"> 32. Når det ble inokulert i mus, ga ikke LAB-produserende bakteriociner anledning til bemerkelsesverdige endringer i den globale mikrobiota-sammensetningen, men heller til et redusert antall bakteriell taxa. Likevel viste global korrelasjonsnettanalyse interessante økologiske kompatibiliteter og motsetning mellom forskjellige bakterier. Denne metoden kan tilpasses for å analysere effekten av matkomponenter, stoffer eller andre forbindelser, selv om det forventede utfallet kan bevisst begrenses for å bevare sunne forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke EEA Grant NILS Science and Sustainability Coordinated Mobility of Researchers (referanse 017-ABEL-CM-2013). CB og GP-M. Ble støttet av AGL2015-70487-P tilskudd fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne. OCOU og DBD ble støttet av et strategisk stipendprogram for matvitenskapelig forskning fra Norsk Universitet for biovitenskap (NMBU) (prosjekt 1205051025). Vi vil også takke Inmaculada Noguera for hennes hjelp med dyrepleie og prøvetaking og Jesus Dehesa for hans hjelp med å sikre tilgjengeligheten av laboratoriematerialer i dyreanlegget. Vi setter også pris på professor Lars-Gustav Snipen for sitt råd om statistikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
